S100A8/A9和S100A12與動脈粥樣硬化關系的研究進展

陳杏蘭，李勝男，陳少鳳，鄧福，朱佩儀綜述 李友審校

1.廣東醫科大學附屬醫院神經病學研究所，廣東 湛江 524001；

2.廣東省衰老相關心腦疾病重點實驗室，廣東 湛江 524001

動脈粥樣硬化導致的心、腦血管疾病是嚴重危害人類生命和健康的疾病之一，而動脈粥樣硬化發病機制十分復雜。因此，在探索動脈粥樣硬化形成的病理生理及分子機制過程中，尋找動脈粥樣硬化早期診斷、判斷預后及指導新治療方法的新標記物已成為當前的研究熱點。當前，越來越多的研究表明：S100 家族中的S100A8/A9 和S100A12 不僅有望成為判斷動脈粥樣硬化嚴重程度及預后的新標志物，而且有望為心肌梗死及缺血性腦梗死患者提供新的治療思路。

1 S100家族與S100A8/A9和S100A12

1.1 S100家族概述 由于S100蛋白可以溶解在100%中性飽和硫酸銨中，被MOORE等于1965年首次在牛腦組織中發現了,分子量較小 (9 000～13 000) 的鈣結合蛋白家族。S100 家族的成員分別由各自的基因編碼，現今至少有24 個成員，其中包括S100A1-16、S100G、S100P、S100B等，S100蛋白家族成員的結構和功能各不相同，但都包含一個EF手結構，該結構在氨基末端和兩個梭基末端都能結合鈣離子。該結構為螺旋一環一螺旋結構，兩側則為疏水區，中間為鉸鏈區。N末端通常具有環狀結構，與鈣離子具有低的親和力，但C末端與鈣離子具有高的親和力。兩種EF手結構中間的鉸鏈區和梭基延伸區的每個家庭成員之間差異很大，因為每個成員的生物活性具有自己獨特的特征。S100蛋白通過與多種配體結合而發揮不同作用，主要包括晚期糖基化終產物 (receptor for advanced glycation end products，RAGE) 受體、Toll 樣受體 (Toll-like receptor，TLR) 、高級糖基化終產物 (AGEs) 、膜聯蛋白A2、p53等。S100蛋白家族具有多種生理功能，如參與炎癥反應、調節氧化應激、調控細胞凋亡、糖原磷酸化、聚集巨噬細胞等。

1.2 S100A8/A9和S100A12結構及功能特性

1.2.1 S100A8 和S100A9 S100A8 和S100A9 是S100 家族的重要成員，主要由免疫細胞 (如嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞) 分泌，這些細胞富含S100A8和S100A9，約占45%的粒細胞胞漿蛋白，它們參與炎癥反應，并成為急性和慢性炎癥的重要炎癥前介質。其分子量分別為10.8 kD 和13.2 kD，分別由93個和113 個氨基酸殘基組成。S100A8 和A9 基因與S100 蛋白家族的其他基因一起位于染色體1q21 的位置，形成了S100基因簇 (gene cluster) ，該基因簇是染色體變化的熱點區域，有報道指出該區域染色體的變化或減少與癌變的發生有密不可分的關系[1-2]。S100A8、S100A9在體外和體內均能形成穩定的異二聚體或同二聚體。但是它們更容易形成異二聚體，并且S100A9的表達在維持S100A8蛋白的穩定性中起著重要作用[3]。S100A8/S100A9的每個單體包括4個α螺旋 (HⅠ、HⅡ、HⅢ和HⅣ) 和2個環 (環Ⅰ和環Ⅱ) ，N端和C端序列是相對疏水的殘基，S100A9 的C 端是所有S100 蛋白家族中最長的；S100A8/A9 蛋白二聚體，又名鈣衛蛋白，也被稱為骨髓相關蛋白 (myeloid-related protein，MRP) ，是由兩個單體形成的螺旋，特別是HⅠ和HⅣ，它們形成了緊密的四個螺旋束[4]。S100A8/A9 的作用多種多樣，既可以調節炎性細胞的遷移和附著，又具有抗微生物炎癥反應，減少細胞增殖，調節免疫，誘導凋亡，促腫瘤細胞生長和其他生物學功能。最近的研究表明，S100A8 和S100A9 水平的升高與心血管疾病和動脈粥樣硬化的增加有關[5]。

1.2.2 S100A12 S100A12 (又稱細胞外新認定的RAGE 結合蛋白即EN-RAGE、鈣粒蛋白C) 也是S100 家族重要成員之一，和S100A8、A9 一樣，為具有手型EF結構的鈣結合蛋白，主要由參與炎癥反應的免疫細胞如中性粒細胞合成和分泌表達，最早是在牛肺組織液中被發現。S100A12由92個氨基酸組成，其相對分子量大小為10.575 kD[6]。該結構由反向平行、鞍形的四個螺旋亞基組成，以二聚體存在居多。它與鈣離子有很高的親和力，并在與一定濃度的鈣離子結合時形成六聚體。在炎癥介質刺激后，蛋白可發生構象變化，暴露靶蛋白的結合位點，使之與特異性的蛋白或肽類物質結合，從而發揮生物學功能，如參與激活炎性細胞、導致炎細胞遷移、黏附、趨化作用和抗微生物作用、代謝性及腫瘤性疾病的病理生理過程和主動氧化防御。S100A12與血管內皮黏附因子的表達有密切聯系，能激活炎癥細胞引起趨化作用[7-8]，進一步加劇動脈粥樣硬化過程中血管壁的慢性炎癥。此外，S100A12 是RAGE 和TLR-4 的內源性配體，以及AGEs的內源性受體配體。其中最著名的是RAGE，一種傳遞炎癥刺激的多配體受體，其與S100A12的結合可激活涉及NF-κB 和介導炎癥和動脈粥樣硬化的炎性細胞因子的炎性級聯反應。最近的研究發現，S100A12水平升高與動脈粥樣硬化性心血管疾病[9]和頸動脈粥樣硬化[10]之間存在顯著相關性。

2 S100A8/A9和S100A12與動脈粥樣硬化的關系

2.1 動脈粥樣硬化及斑塊形成機制 動脈粥樣硬化是由活化的巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和平滑肌細胞介導的血管壁慢性炎癥過程[11-13]，可導致動脈粥樣硬化斑塊緩慢形成。這與炎癥、高膽固醇血癥、血脂異常、高血糖和血管緊張素系統失調等相關[14-15]。動脈粥樣硬化的特征在于動脈內膜中過多的脂質沉積，脂質沉積在內膜中發生聚集和氧化導致修飾后的脂質結構 (最小氧化脂質，oxLDL) 的產生，引起先天免疫和適應性免疫應答的緩慢刺激，進而導致血管壁慢性炎癥形成。內皮細胞和血管平滑肌細胞的誘導可導致黏附分子、趨化劑和生長因子的表達增加[16]。這些因子與單核細胞上的受體相互作用，導致單核細胞回歸、遷移和轉化為樹突狀細胞和巨噬細胞。單核細胞黏附在內皮細胞上，逐漸增多后移入內膜下成為巨噬細胞，通過清道夫受體吞噬oxLDL，轉變為泡沫細胞，形成最早的粥樣硬化病變脂質條紋，并通過動脈粥樣硬化、粥樣斑塊和纖維粥樣斑塊進展變化，從而形成穩定的斑塊。炎癥、病毒和細菌的感染、內皮和血管平滑肌細胞的失調都可以導致斑塊的形成。穩定斑塊是由厚的纖維帽和脂質豐富的粥樣斑塊組成的。而不穩定斑塊 (又稱易損斑塊) 的特征是存在薄的發炎的纖維帽，伴隨著脂質核、壞死核心，新血管形成增加，出現炎癥，血管中膜和外膜改變，斑塊內出血和積極的血管重塑[17]。纖維帽變薄是通過基質金屬蛋白酶 (mmps) 降解細胞外基質的膠原含量而介導的[18-20]，其變化進展和易脆性受到病毒、細菌及其產物的感染和炎癥的影響。不穩定斑塊被描述為易破裂的斑塊，易發生血栓形成和缺血事件，如急性冠脈綜合征、缺血性腦卒中等。

2.2 S100A8/A9 和S100A12 在動脈粥樣硬化病變中的作用 炎癥是公認的動脈粥樣硬化形成的危險因素。而S100蛋白家族在炎癥的調節中發揮作用，在多種炎癥條件下其表達顯著增加。其中，S100A8、S100A9和S100A12是炎癥的標志物，可在炎癥過程中高表達，在多種炎癥性疾病的發病機制中具有重要作用。已有多項研究提示S100A8、S100A9 和S100A12參與動脈粥樣化形成。AZHAR 等[10]的研究顯示頸動脈粥樣硬化患者的血漿S100A12 水平顯著高于對照組，血漿S100A8/S100A9 水平呈中度升高；有最新癥狀的患者頸動脈粥樣硬化斑塊中S100A8、S100A9 及S100A12 的mRNA 水平較其余患者有所增加。OZLEM 等[21]的研究提示血漿S100A12 水平升高與動脈粥樣硬化密切相關；并且隨著年齡的增長，血漿S100A12 水平升高，可能在腹膜透析患者中顯示出強大的致動脈粥樣硬化潛能。ZAFER等[22]在正常冠脈、穩定的冠脈病變及急性冠脈綜合征 (ACS) 患者中的臨床研究顯示，與正常冠狀動脈和穩定冠狀動脈疾病患者相比，ACS 患者S100A12 水平顯著升高 (P=0.001) ，并有統計學意義。MASASHI SAKUMA等[23]在連續38例急性冠脈綜合征患者中發現有23例確診為抽吸性血栓的患者其冠狀動脈血MRP-8/14 (S100A8/A9) 水平高于未發現血栓的15例，而且MRP-8/14 (S100A8/A9) 水平與冠狀動脈內髓過氧化物酶 (MPO) 水平相關；血栓的免疫組化結果顯示MRP 8/14 (S100A8/A9) 的表達與活化的Mac-1 陽性白細胞共定位；此外，在培養的人臍靜脈內皮細胞中，MRP-8/14 增加了組織因子的表達。通過以上實驗結論可得知，三者血漿水平均在動脈粥樣硬化病變中不同程度地升高、斑塊中mRNA表達也有所增加，說明它們通過招募炎癥細胞、增加組織因子的表達引起炎癥反應的增強等途徑參與到動脈粥樣硬化的進程及斑塊形成中。而且S100A12 在動脈粥樣斑塊不穩定甚至破裂介導的缺血性事件中起重要作用，如ACS中S100A12水平明顯升高。由此可見，S100A8、S100A9及S100A12血清濃度水平的升高與動脈粥樣硬化、斑塊不穩定介導的急性冠脈綜合征等心血管疾病明顯相關，其受體RAGE、TLR-4在許多炎癥反應中起關鍵作用，并且在動脈粥樣硬化等心血管疾病中具有重大意義。此外，AGEs (高級糖基化終產物) 也參與S100A8、S100A9、S100A12介導的炎癥引起的動脈粥樣硬化。

2.3 S100A8/A9 和S100A12 參與動脈粥樣硬化的相關機制

2.3.1 晚期糖基化終產物 (RAGE) 臨床已在動物和人類中研究了RAGE，它是炎癥和動脈粥樣硬化的重要介質，在炎癥反應中可傳遞釋放或上調的信號。RAGE 是1992 年從牛肺中鑒定出來的一種結合晚期糖基化終產物的蛋白質，在包括內皮細胞、單核細胞和血管平滑肌細胞在內的多種細胞中表達。主要由三個免疫球蛋白結構域 (V，C1 和C2) 組成、跨膜生成螺旋和用于信號傳導的胞質結構域[4，24]。RAGE可與多種配體和信號分子結合，如S100 家族蛋白成員、晚期糖基化終產物 (AGE) 、β淀粉樣蛋白 (β淀粉樣蛋白) 、高遷移率群盒1 (HMGB-1) 、補體系統成員等。有研究顯示缺乏RAGE 的apoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化減弱[25]，這說明RAGE 可激活多種信號通路從而參與動脈粥樣硬化進程。S100A8、A9、A12 與內皮細胞上的RAGE 結合調控的炎癥信號轉導通過參與血管內皮及血管壁損傷引起內皮功能障礙介導動脈粥樣硬化。在S100A9基因敲除的小鼠中，S100A8/A9的缺乏減少了血管受損后頸、椎動脈閉塞的時間[26]，提示血管內皮細胞正常分泌表達RAGE時，S100A8、A9的缺乏仍能減低血管壁損傷后內皮功能障礙引起的動脈粥樣硬化及附著斑塊和血栓形成，兩者的結合在該過程中扮演著重要角色。研究顯示，S100A9 基因敲除小鼠的大動脈血管粥樣硬化厚度比對照組降低約30%[27]，這種減少并不因血中脂肪含量的高低差異所致，而是病變部位巨噬細胞的招募集合減少所致；而且，這種基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊中單核細胞及中性粒細胞的聚集也減少。在RAGE 分泌表達不變的情況下，S100A9基因敲除后動脈粥樣硬化病變明顯減少。說明在炎癥介導的動脈粥樣硬化中S100A8、A9與RAGE結合能促進免疫細胞的聚集，使斑塊中炎癥細胞浸潤，加強血管炎癥反應，促進動脈粥樣硬化形成。HOFMANN 等[28]建立了表達S100A12 的ApoE-/-小鼠模型；將野生型小鼠和ApoE-/-小鼠進行比較，表達S100A12的ApoE-/-小鼠的主動脈粥樣硬化斑塊的面積更大，血管鈣化斑塊增多更為明顯。這說明血管平滑肌分泌的S100A12 能加速粥樣硬化的進展并增強由動脈粥樣硬化觸發的骨生成，促進血管鈣化。因此，S100A12 在動脈粥樣硬化病變中起重要作用，考慮為和RAGE 結合后激活炎癥細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞等胞內信號轉導通路，主要為激活核因子kappa-B、釋放細胞因子，表達黏附分子、產生活性氧等途徑[29-32]，導致白細胞浸潤、氧化應激加劇以及血管炎癥反應，因增強了炎癥反應及組織損傷，進一步引起粥樣斑塊形成導致動脈粥樣硬化甚至斑塊破裂。S100A8、S100A9、S100A12 對配體RAGE 的結合也可以觸發多個下游信號級聯，包括有絲分裂原蛋白活化激酶 (MAPK) 、磷酸肌醇3-激酶 (PI3K) 、Ras 同源-GTPase (Rho-GTPase) 、Janus激酶/信號轉換器和轉錄激活因子 (JAK/STAT) ，細胞分裂調控蛋白42同源物/Ras 相關的C3 型肉毒桿菌毒素底物1 (CDC42/RAC1) 和核因子[NF- (B) ]和活化素蛋白1 (AP-1) 的激活[33-36]，導致產生特異性炎癥因子，在炎癥中起關鍵作用。許多研究顯示在RAGE存在時，S100蛋白轉基因小鼠中白細胞炎癥調節相關的基因轉錄增強了，但這種轉錄在完全缺乏RAGE 的小鼠中消失了[37]，這再次表明了RAGE 與S100 蛋白的結合在炎癥過程中起關鍵作用。同時，在ApoE-/-小鼠中發現，S100A9或RAGE的基因消除可減少動脈粥樣硬化[38]，說明兩者的結合在動脈粥樣硬化過程中起關鍵作用，可促進炎癥反應，加劇動脈粥樣硬化產生。因此，RAGE 與S100A8、S100A9和S100A12結合，在炎癥誘導的動脈粥樣硬化中發揮潛在作用。

2.3.2 Toll 樣 受 體4 (TLR-4) TLR-4 是 一 種 跨膜信號轉導受體，通過p38 絲裂原激活的蛋白激酶 (MAPK) 發揮作用，其在誘導機體產生炎性反應中起重要作用[39]。S100A8/A9、S100A12 都是Toll 樣受體4 (TLR-4) 的內源性配體，并且先前的研究表明S100A8/A9 與TLR-4 結合的信號傳導參與了各種炎癥反應。SCHENTEN等[40]的結果表明，只有磷酸化形式的復合物誘導促炎細胞因子的表達和分泌，并首次證明S100A8/S100A9 能通過Toll 樣受體4 信號通路誘導細胞因子的分泌。CHEN 等[41]的研究提示，急性冠脈綜合征 (ACS) 和冠心病 (CHD) 患者血清cox-2、tlr-4 和S100A8/A9 水平明顯高于健康對照組 (P＜0.05) ；在大鼠頸動脈血栓形成模型中，ACS組S100A8/A9表達與TLR-4、COX-2明顯相關，在CHD組則與TLR-4顯著相關。說明s100a8/a9在血管損傷后上調，并通過絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) p38激活與Toll樣受體4和環氧化酶-2 聯合誘導增強。S100A8/S100A9 與TLR 4結合，在細胞內觸發一種特殊的信號通路，從而形成自分泌的正反饋環，并放大內毒素引起的炎癥因子如細胞因子、趨化因子和腫瘤壞死因子 (α) 的上調，進一步增強炎癥反應。AZHAR等[10]的研究表明，在THP-1單核細胞中，Toll樣受體4和2的激活增加了S100A8、S100A9、S10012 和白細胞介素-1、干擾素和凝血酶激活血小板釋放物的mRNA 水平，并顯著增強了S100A12的表達。由此說明，TLR-4不僅通過與S100蛋白的結合參與動脈粥樣硬化，還可上調三者的表達，進一步增強其在動脈粥樣硬化中的作用。oxLDL可誘導TLR 4 的表達增加，從而促進促炎癥細胞因子的產生。TLR 4還參與動脈粥樣硬化過程中的脂質沉積。TLR4 的信號傳導可被TREM-1 放大并進一步增強炎癥和免疫反應[42]。TLR-4 參與冠狀動脈粥樣硬化、缺血性腦卒中動脈粥樣硬化、病理性心肌重塑和組織損傷等的發展。

2.3.3 高級糖基化終產物 (AGEs) 還原糖與蛋白質，脂質或核酸上的游離氨基之間的非酶促反應所形成復雜結構的異質基團，稱為AGEs。AGEs 與RAGE 的結合可改變細胞內信號轉導，導致單核細胞活化和巨噬細胞遷移增加[43]，介導炎癥反應，誘導動脈粥樣硬化形成。此外，AGEs 還可以誘導血管平滑肌細胞功能障礙、調節膽固醇的攝取以增加巨噬細胞中的脂質蓄積，從而使泡沫細胞增多、加劇動脈粥樣硬化和斑塊形成。AGEs 濃度升高，氧化應激和炎癥反應增加能進一步促脂質沉積，引致動脈粥樣硬化的發展進程。而S100A8、S100A9 表達增加即可引起AGEs 的積累[44]，使AGEs 上述活動增強，進一步影響動脈粥樣硬化形成。故此，S100A8、A9 可通過增加AGEs的積累而影響動脈粥樣硬化的形成。

2.3.4 晚期糖基化終產物 (sRAGE) C 截斷RAGE是一種可溶性片段，被稱為sRAGE的人可溶性受體。由于其能與RAGE 競爭與AGEs 結合的能力、限制其他配體和RAGE的結合[45]以及缺乏胞內信號轉導，又稱為拮抗誘餌式受體。sRAGE 能阻止AGEs 的激活、減少配體進入RAGE，從而減少炎癥損傷、延緩炎癥介導的動脈粥樣硬化，故此認為sRAGE可能在動脈粥樣硬化過程中擔任保護角色。血管鈣化是動脈粥樣硬化的重要特征之一，亦是動脈粥樣硬化的必然終點事件。WANG 等[46]研究的Logistic 回歸分析顯示血清S100A12 水平是嚴重冠狀動脈鈣化發生的獨立影響因素，血清S100A12水平的升高與冠狀動脈鈣化的進展呈正相關。在表達S100A12 小鼠上建立的慢性腎病小鼠模型中顯示：在高脂以及慢性腎病導致的炎性環境中，S100A12 可與RAGE 結合，這一過程可進一步加速血管鈣化[47]。KIM等[48]的一項研究也證明了血漿s100A12與血管鈣化呈正向關系，而sRAGE與其鈣化程度呈反向關系。JI等[49]的研究也表明血液透析患者的循環sRAGE 水平越低，則血管鈣化程度越高。綜上，考慮sRAGE 并不參與加速血管鈣化的進程，對動脈粥樣硬化起保護作用。因此，sRAGE可能是減少動脈粥樣硬化、保護身體的一個因素。當釋放到血液中時，sRAGE會抑制RAGE與其配體的結合，或可以捕獲RAGE配體、從而減少循環可測量的RAGE，降低RAGE軸的活動，從而減少炎癥反應，減慢動脈粥樣硬化。早前的研究也顯示了sRAGE濃度可能與冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度和炎癥過程有關，sRAGE 聯合S100A12可作為嚴重冠心病的預測指標。

3 展望

目前的研究認為，S100A8/A9 和S100A12 蛋白是能促炎的鈣結合蛋白，它們在血漿和其他身體部位中的炎癥過程中表達增加并累積，通過不同機制激活參與炎癥的細胞，在炎癥反應不同過程中起調節作用，參與動脈粥樣硬化的慢性炎癥病理過程。這使S100A8/A9和S100A12在動脈粥樣硬化性疾病和其他各種炎癥性疾病中成為有價值的生物標志物和示蹤劑。為了進一步將S100A8/A9和S100A12用作炎癥性疾病的生物標記物，并闡明S100A8/A9 和S100A12 阻斷劑在炎癥性疾病的治療中的潛在應用，未來的研究 (包括臨床試驗) 將是必要的。S100A8/A9 和S100A12有望為動脈粥樣硬化性疾病以及其他炎癥性疾病的預防、診治提供重要的分子依據和治療靶標。