細胞外囊泡的生物學特性及其在缺血性腦卒中診療中的價值

周志文 綜述 鐘望濤 審校

廣東醫科大學附屬醫院神經內科，廣東 湛江 524000

隨著人類平均壽命的逐漸延長，腦血管疾病在人類疾病譜中占據的比例越來越大。美國心臟協會最近的統計數據指出，全球每年有630 萬人死于腦血管疾病[1]。我國最新的全國死亡原因調查結果顯示，腦卒中已超過惡性腫瘤成為中國首位死亡病因；腦卒中是腦血管疾病的最常見類型，包括缺血性和出血性腦卒中，其中前者占87%左右[2]。缺血性腦卒中具有發病率高、致殘率高、死亡率高等特點，隨著老年化的逐漸嚴重，其不僅給家庭甚至給社會帶來巨大的精神及經濟壓力[3]。目前國際上對缺血性腦卒中病因分型廣泛采用TOAST 分型，包括大動脈粥樣硬化型 (LAA) 、心源性栓塞型 (CE) 、小動脈閉塞型 (SAA) 、其他明確病因 (SOE) 及不明原因型 (SUE) 等5個類型[4]。然而，缺血性腦卒中致病機制仍不十分明了。近年來隨著對EVs的深入研究，預示著EVs 在缺血性腦卒中的發生、發展及預后等過程中發揮著不可或缺的作用，為缺血性腦卒中致病機制的探索指出新的方向。

1 細胞外囊泡的生物學特點

1.1 細胞外囊泡的定義 細胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs) 是由細胞在生理及病理狀態下對外分泌的納米級亞細胞結構的小囊泡[5]。根據EVs的直徑大小，主要分為3 個類型： (1) 外泌體 (直徑20～150 nm) ； (2) 微粒 (直徑100～1 000 nm) ； (3) 凋亡小體 (直徑1 000～5 000 nm)[6]。根據EVs 的細胞來源，可分為血小板源性細胞外囊泡、內皮細胞源性細胞外囊泡、紅細胞源性細胞外囊泡等。目前學術界對EVs 的分類仍未達成統一的標準，其中由EVs 直徑大小定義EVs 亞群仍存在爭議，因為EVs 的大小分布有一部分是重疊的，導致亞群分離出現誤差[6-7]。有學者通過鑒別在EVs 聚集的蛋白，并定義了一組在不同EVs 中顯示不同相對豐度的5 種蛋白，證明了EVs 中存在外體亞型和非外體亞型，并提出了利用CD63、CD81 或CD9 免疫分離它們的差異分離方法[7]，這就提示EVs直徑大小聯合蛋白質組標志物來定義EVs 亞型更具特異性。

1.2 細胞外囊泡的分泌及生物學功能 細胞是通過不同形式來分泌外泌體、微粒、凋亡小體的。外泌體是由細胞膜內吞形成小泡，這些小泡聚集在多泡體中逐漸成熟，并以胞吐的形式從母細胞分泌出來[8-9]。微粒是由質膜直接向外出芽和分裂形成的，其分泌過程相對簡單[9-10]。細胞在分泌微粒和外泌體的過程中并不是絕然不同的，也有一些共同之處，如微粒和外泌體的分泌過程均包括聚集、出胞、切斷和釋放4 個環節，同時微粒和外泌體上的跨膜蛋白與質膜上的跨膜蛋白的拓撲結構保持高度一致性[5]。凋亡體是由死亡細胞的分裂形成的[11]。EVs 包含多種蛋白質、脂質、DNA、RNA 等物質[12-13]，這些物質來源于母細胞，具有母細胞的諸多功能，如血小板源性的微粒和外泌體比激活的血小板具有數十倍的促凝功能[14]。在不同的病理機體中，細胞產生的EVs 數量、種類及其攜帶物質 (蛋白質、DNA、RNA等) 均有所差異，并通過體液循環把信息傳遞給遠端細胞[11，15]，從而參與機體的免疫應答、炎癥反應、新生血管的形成、血栓形成等病理過程中[16]，在信息傳遞過程中起到橋梁的作用。

2 細胞外囊泡作為生物學標志在缺血性腦卒中的作用

近年來，隨著對缺血性腦卒中患者循環EVs 的廣泛深入的研究，發現EVs的種類、表型、數量與缺血性腦卒中的類型、危重程度及預后等存在一定內在聯系。血管內皮細胞的功能障礙及血小板的激活促凝在缺血性腦卒中的病理生理過程中扮演著重要的角色。而EVs 則主要反映其母細胞的功能狀態[17]，因此內皮細胞和血小板來源的EVs 更有望成為反映缺血性腦卒中患者病情危重程度及預后等情況的生物標志物。

2.1 微粒在缺血性腦卒中的生物學標志 不同的病理狀態下，機體產生的EVs 的種類、表型及數量等都有所差異。有學者提出，在凋亡的刺激下，CD31和CD105 在內皮細胞微粒 (endothelial microparticle，EMP) 上表達有所增加；在細胞激活的過程中，EMP表達CD54、CD62E和CD106有所增加[18]。此外，在急性病理狀態下，CD31 EMP 能反映內皮細胞新近受損的情況，而在慢性病理狀態下，CD51 EMP則能反映內皮細胞中遠期的損傷情況[19]。LI等[20]通過研究分析缺血性腦卒中OCSP 分類與CD62E+EMPs 之間的關系，發現CD62E+EMP 值具有預測卒中亞型的潛能。JUNG等[21]發現缺血性腦卒中患者NIHSS 評分的高低和梗死體積的大小與CD62E+EMP 水平存在明顯的正相關，同時還發現CD62E (+) 與CD31 (+) /CD42b (-) 或CD31 (+) /AV (+) EMP比值可協助判定顱內外動脈狹窄程度。與正常對照組相比，缺血性腦卒中患者的CD62E+EMPs升高，且在較長的時間內仍處于較高水平[22]。對于這些發現，EL-GAMAL 等[23]提出了以下假設，首先，高水平的CD62E+EMPs 與腦卒中發病時間無關，表明內皮細胞持續活化；其次，缺血性腦卒中內皮功能障礙更可能是由于細胞活化而不是凋亡引起。因此CD62E+EMP能否作為缺血性腦卒中患者復發時的生物標志物，需要進一步深入探究。多個研究發現，CD144+EMPs 與卒中嚴重程度呈正相關，特別在中重度卒中患者中CD144+EMP值升高明顯[20，24]，這將有利于臨床早期快速判斷卒中患者病情的危重程度。此外，另一個值得關注的是，CD105+CD144+EMP計數在出血轉化的患者中升高，這具有診斷腦梗死出血轉化的潛在價值[24]。與此同時，血小板微粒 (platelet microparticles，PMPs) 在缺血性腦卒中的診斷價值也不可忽視。大量的研究表明，相對于正常對照組，腦卒中患者循環PMPs 水平較高[25-26]，這意味著PMPs將可作為診斷的生物標志物運用于卒中。LAA和SAA兩型腦卒中患者的PMPs水平均高于正常對照組、CE和SUE腦卒中患者[25-26]，PMPs似乎能夠成為區分腦卒中類型的良好生物標志物。BIVARD 等[27]發現，在超急性期接受阿替普酶靜脈溶栓治療的卒中患者中，其循環CD41+PMP 的水平與腦血管再通及3個月后Rankin評分的改變存在顯著相關性，這使其成為評估腦卒中患者血管再通的一個潛在候選指標。

2.2 外泌體在缺血性腦卒中的生物學標志 外泌體水平不僅在不同的疾病條件下會有所不同[28-29]，同時在同一疾病不同時期也有所不同[30-31]，因此外泌體也是疾病不同病理生理狀態下的一類潛在候選指標。miRNA 是真核細胞中非蛋白編碼的小核糖核酸分子，其幾乎參與調控生物體生命周期所有的生物變化，因此EVs的miRNA含量提供了一個重要的生物標志物來源。通過觀察大鼠腦組織在不同缺血時間條件下rno-miR-122-5p 和rno-miR-300-3p 水平變化情況，LI等[32]發現相對于正常組和5 min組，10 min組大鼠循環外泌體rno-miR-122-5p表達明顯下降；與正常組、10 min組和2 h組相比，5 min組大鼠循環外體rno-miR-300-3p上調較明顯，因此他們提出循環外泌體rno-miR-122-5p聯合rno-miR-300-3p可作為TIA的生物標志物。隨后LUO等[33]通過類似的大鼠模型實驗發現，10 min組大鼠循環外泌體rno-miR-450b-5p表達水平較正常組、5 min組和2 h組上調明顯，提示循環外泌體rno-miR-450b-5p同樣對短暫性腦缺血發作 (TIA) 具有較高的診斷價值。上述外泌體miRNA對TIA的診斷價值僅限于動物實驗，運用于臨床仍需要大樣本臨床試驗來驗證。外泌體RNA不僅對TIA診斷提供新的參考指標，而且在區分缺血性卒中的類型、預判其危重程度及預后等方面均具有良好臨床運用價值。臨床實驗表明，在急性期，缺血性卒中患者循環外泌體miR-223表達顯著升高，而且與病情危重程度及其預后存在明顯的相關性，提示循環外泌體miR-223可作為評估缺血性腦卒中的危重程度及預后的新指標[34]。LI等[28]通過檢測分析缺血性腦卒中患者急性期和亞急性期的循環外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p表達水平發現，隨著時間推移兩者表達水平下調而且下降幅度較明顯，因此血漿外泌體miR-422a聯合miR-125b-2-3p對判定缺血性腦卒中的分期具有重要的臨床意義。此外，有研究表明循環外泌體miR-21-5p聯合miRNA-30a-5p具有診斷缺血性腦卒中及區分其分期的潛力，為臨床早期確定缺血性腦卒中及在其溶栓治療提供新的參考指標[35]。

3 治療

腦組織是人體代謝最活躍的器官，其能量主要由糖的有氧代謝提供，而無能量儲存，因此神經系統對缺血缺氧極其敏感，腦細胞可在極短時間內受到損害甚至死亡。目前對于缺血性腦卒中的治療主要集中在超急性期再灌注治療 (溶栓及動脈取栓) 、急性期的病因和發病機制治療、恢復期的功能訓練及二級預防等，然而超急性期治療嚴格受時間限制，急性期藥物療效差強人意，迫切需要新的藥物和新的治療方法來改變目前治療的困境。隨著近幾年對EVs的研究，有人發現EVs 在促進組織血管和受損細胞的再生和修復[36]、調控受損細胞的代謝及凋亡[37]等多個環節影響著疾病預后，為今后治療缺血性腦卒中研制新藥物奠定了理論基礎。

3.1 天然的細胞外囊泡作為藥物治療缺血性腦卒中 EVs 不僅具有母細胞的生物學功能，同時還兼備有母細胞不可比擬的諸多優點，如免疫原性低；無血管阻塞作用，降低繼發性微血管血栓形成風險；能夠穿越血腦屏障進入腦實質[38]。同時EVs的磷脂雙分子膜結構使其生物活性物質與內環境隔絕，避免被降解的命運。因此EVs 具有治療缺血性腦卒中的巨大潛力。RIAZIFAR 等[39]總結了前人的研究發現，在各系統臟器疾病的小鼠模型中，EVs 均具有促進組織再生的能力，甚至在卒中模型中也有良好的修復作用。早期動物實驗表明，活化的PMPs 含有多種促生長物質，可激活神經祖細胞和促進神經血管重構，可用于腦卒中治療[40]。此外，內皮細胞微粒對血腦屏障完整性和腦血流有不同程度的調節作用，也可作為缺血性腦卒中治療的靶點之一[41]。一項動物實驗表明，M2小膠質細胞來源的外泌體通過外泌體miR-124 及其下游靶基因USP14可減輕缺血性腦損傷，提高神經細胞的存活率[43]。干細胞是一類能夠自我更新及多能分化的細胞，具有治愈所有疾病的潛能，被譽為21 世紀最有前景的生命科學之一。近年來，干細胞來源的EVs在疾病治療方面的作用逐漸引起學者的關注。DENG等[45]指出，骨髓間充質干細胞 (BMSCs) 來源的外泌體miR-138-5p過表達能夠促進缺氧葡萄糖剝奪，抑制星形膠質細胞凋亡，而且能夠下調脂鈣蛋白2表達，減少炎癥因子的分泌，更重要的是，BMSCs 通過外泌體向星形膠質細胞傳遞miR-138-5p 減輕了卒中小鼠神經元損傷。脂肪源性干細胞 (ADSC) 衍生的外泌體可減少神經細胞的死亡和促使神經細胞的增殖，促進腦功能恢復，更重要的是，與單純外泌體治療相比，miR-126+外泌體治療進一步增強了這些結果[44]。此外，另一項研究表明，mir-30d-5p強化的ADSC分泌的外泌體通過抑制自噬和促進M2小膠質細胞/巨噬細胞極化，可顯著降低腦梗死面積[45]。

3.2 細胞外囊泡作為藥物載體治療缺血性腦卒中 相對于其他現有或潛在的藥物載體，EVs 具有循環穩定性好、免疫原性低、傳遞效率高、無血腦屏障障礙等優點[38]，同時可以根據治療的需要，可對EVs與治療性小分子進行體外的有機結合[46-47]，使藥物的劑量減少，副作用減輕，藥效更佳。因此EVs 作為藥物載體在治療卒中同樣具有廣泛的前景。為解決細胞外囊泡加載藥物的技術難題，生物學家已探索出多種細胞外囊泡裝載外源性物質的技術，如電穿孔技術、生物轉染技術、基于化學的外泌體轉染技術、選擇性外泌體加載技術[48]。例如姜黃素加載到外泌體，然后經鼻給藥缺血-再灌注損傷小鼠模型，Kalani團隊發現小鼠缺血再灌注損傷后的神經功能評分、梗死體積和水腫有所改善，提示姜黃素包膜外泌體能夠幫助小鼠缺血-再灌注損傷后的神經血管恢復[49]。然而，現有的EVs 加載技術雖然能夠裝載外源性藥物，但是其靶向性不足限制了其臨床應用。為了提供外泌體的精準運輸能力，有學者提出C肽偶聯到外泌體表面的方法，并觀察到C肽偶聯外泌體作為運載體運載姜黃素可強烈抑制腦缺血損傷區域炎癥反應和細胞凋亡[50]。此外，類似的實驗證明了C肽偶聯外泌體作為運載體可提高缺血腦病變區域miR-210的濃度，使腦缺血后腦組織修復得到更好的改善[51]。

4 結語

在缺血性腦卒中發病前后，EVs 均發揮著不可或缺的作用，具有反映缺血性卒中類型、危重程度及預后等情況的巨大潛能，但具體的發病機理仍未探明，阻礙其應用于缺血性腦卒中的臨床診斷。此外，EVs在缺血性腦卒中發生后具有促進神經血管恢復等功能，同時具有免疫原性低、循環穩定性好等優點，EVs也表現出治療缺血性卒中的巨大潛能。現階段，EVs作為藥物載體治療缺血性腦卒中仍面臨諸多難題，譬如如何提高EVs 裝載外源性藥物的效率和如何提高EVs 運載體精準運輸的能力。同時，EVs 的分離提純是治療缺血性卒中的必要前提，然而現有的分離提純EVs 的技術仍有待進一步改進。因此，EVs 在診斷和治療缺血性腦卒中等方面的研究仍有較多的技術瓶頸要攻克。