超聲造影劑微泡聯合低頻超聲在腫瘤靶向治療中的研究進展

徐理敏 王利英

近年來，隨著超聲醫學、分子生物學以及微泡造影劑的發展，超聲造影劑微泡聯合低頻超聲的生物學效應用于臨床治療得到了廣泛關注，已成為腫瘤治療研究的一大熱點。超聲造影劑最初是為了增加超聲顯像的效果，以利于疾病的診斷。近年來研究發現超聲造影劑微泡與低頻超聲聯合應用在腫瘤治療中具有較好潛力。超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可提高細胞膜通透性、介導基因轉染、藥物輸送、栓塞腫瘤滋養血管、開放組織屏障等，發揮靶向治療作用，具有安全、靶向、無創的特點。本文對超聲造影劑微泡聯合低頻超聲在腫瘤靶向治療中的研究進展作一綜述。

1 概述

早期超聲微泡造影劑為含空氣或氧氣的無包膜氣泡，尺寸較大，不穩定，不能由外周靜脈注入。上世紀90年代開始，出現了新型外圍包裹白蛋白、脂類、聚合物或表面活性劑膜殼的空氣微泡的殼膜造影劑，體積小，穩定性好。接著出現了膜包裹的含氟碳類氣體的新型微泡造影劑，比如八氟丙烷、全氟丁烷、六氟化硫或含氟碳類氣體混合物[1-3]。這類微泡造影劑與紅細胞直徑相似，自外周靜脈快速注射進入人體后，可以順利通過肺循環進入體循環。隨著分子成像技術的快速發展，近年來涌現出一批納米級超聲造影劑，例如納米級脂質體造影劑、納米級氟碳乳劑及納米級微泡造影劑，既能通過腫瘤的血管壁，又能具有很好的回聲特性。超聲微泡造影劑的不斷革新是低頻超聲聯合微泡治療腫瘤的基礎。

1917年Rayleigh首次提出了空化效應，該效應指超聲波在液體中傳播時，液體中的微小泡核（空化核）震蕩、膨脹、收縮、崩潰，由此產生巨大的剪切力使處于空化核周圍的組織細胞壁和質膜被擊穿[4]。自Gramiak等[5]首次報道了超聲回聲增強現象并開始研究超聲造影后，研究者陸續發現超聲作用下液體中的微小氣泡即空化核具有治療潛力。超聲微泡造影劑的物理特性使其成為理想的空化核，不但可明顯增加空化細胞核的數量，增強低頻超聲的空化效應，還能極大地降低空化閾值。低頻超聲作用于腫瘤主要有3種機制：機械效應、熱效應、空化效應。

2 抗腫瘤血管作用

實體腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移依賴腫瘤血管的生成。腫瘤血管生成是指腫瘤微血管網通過內皮細胞形成新生血管，為腫瘤細胞增殖提供充足的氧氣等營養物質。目前抗腫瘤血管生成均采用化學或生物藥物攻擊腫瘤新生血管的特異性靶點，不良反應多，治療效果不理想。利用靜脈注射超聲造影劑微泡，增強低頻超聲空化效應，可靶向毀損腫瘤的新生血管。微泡可降低超聲空化效應閾值，增強空化效應，可損傷血管管壁，激活內源或外源性凝血，誘發大面積毛細血管栓塞，阻斷腫瘤組織細胞的營養供應，導致腫瘤組織壞死[6]。空化效應所產生的休克波不僅使細胞膜通透性增加，還可使微血管破裂，內皮細胞間隙增寬，同時介導血管內皮層破壞,暴露血管內皮下層,引起血管內血栓形成，阻斷惡性腫瘤組織的血供[7]。Shen等[8-9]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲組兔VX2肝癌凝血壞死、間質出血和血管內血栓形成，血管內皮細胞壁破裂，內皮細胞間隙擴大，間質紅細胞滲漏，微血管血栓形成，動脈彈性膜分離，局部血管壁缺損，孔洞形成，破裂區表面粗糙不規則，具有抗血管生成作用。

3 血腦屏障和血脊髓屏障開放

中樞神經系統中血腦屏障和血脊髓屏障限制了大多數治療相關藥物及分子的通過，影響中樞神經系統腫瘤治療的療效。開放血腦屏障和血脊髓屏障，使藥物和利用受體介導的運輸技術改造的分子進入中樞神經系統，已成為中樞神經系統腫瘤治療的最前沿。Shih-Ying等[10]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可使腔中氣泡膨脹和收縮，其引起的直接拉伸應力以及在血管處的剪切應力使血腦屏障和血脊髓屏障滲透性改變，增強細胞旁和跨細胞轉運。Dallan等[11]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可抑制對外排轉運蛋白的作用，血腦屏障轉運蛋白基因表達降低，P-糖蛋白的表達可被抑制48 h以上。Lipsman等[12]報道阿爾茨海默病患者和肌萎縮性側索硬化癥患者中血腦屏障通透性增強，提高了治療的療效。

Charissa等[13]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可增加中樞神經系統中的藥物積累，減少淀粉樣茁斑塊負荷。血脊髓屏障開放與血腦屏障開放類似，可以提高腫瘤治療的療效。Meaghan等[14]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲下大鼠腦膜轉移瘤模型中腫瘤控制得到了改善。

4 免疫療法

腫瘤免疫療法被認為是腫瘤治療的最有希望的策略之一，因其利用患者自身的免疫系統選擇性地攻擊和破壞腫瘤細胞，通過增強抗腫瘤免疫應答或標記腫瘤細胞以使其對免疫系統以更可見的方式來釋放免疫系統功能。原理是腫瘤表達特定的腫瘤抗原，因正常的體細胞不會表達或僅表達程度較小的抗原，故可用于引發腫瘤特異性的免疫反應。

Patricia等[15]報道低頻超聲聯合微泡造影劑可促進腫瘤抗原直接遞送到體內免疫細胞，并激活樹突狀細胞。Gilles等[16]報道低頻超聲聯合微泡造影劑可導致CD8+CD4+T細胞活化。Heleen等[17]報道低頻超聲聯合微泡造影劑可將編碼腫瘤抗原和免疫調節分子的mR原NA直接遞送至樹突狀細胞的細胞質，使樹突狀細胞轉染。Yang等[18]報道低頻超聲聯合微泡造影劑可使自然殺傷細胞的腫瘤浸潤增強。

5 誘導腫瘤細胞死亡

細胞增殖失控和死亡抑制是腫瘤發生的主要原因，低頻超聲聯合微泡造影劑可通過機械效應和空化效應明顯抑制腫瘤細胞增殖和克隆形成，其形態學變化包括各種死亡方式，即腫瘤細胞壞死、自噬和凋亡，達到抑癌效應[19-21]。超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可誘導腫瘤細胞死亡，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移[19，22]。低頻超聲聯合微泡造影劑抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移,可能與空化效應有關[23]。文獻報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可促進前列腺癌細胞、肝癌細胞、卵巢癌細胞、膠質瘤細胞及人白血病細胞等腫瘤細胞的死亡[24-26]，又可減少對正常組織的損傷。Hou等[27]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可影響腫瘤的低氧反應，抑制腫瘤生長，促進細胞凋亡。Shen等[28]報道增加膠質母細胞瘤裸小鼠和裸鼠移植瘤血-腫瘤屏障PTX紫杉醇-脂滲透血腦屏障，提高對膠質母細胞瘤化療效能，免疫組化證實誘導細胞凋亡和抑制增殖。Zhang等[29]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可顯著抑制小鼠前列腺癌細胞表面抗原標志物CD11c和成熟標志物CD83的表達，抑制腫瘤細胞增殖。Ji等[30]報道外源性miRNA-133A處理MCF-7和MDA-MB-231細胞時，miR133a表達明顯上調，轉染后明顯抑制表皮生長因子受體表達和Akt磷酸化，抑制乳腺癌小鼠細胞腫瘤增殖，提高其存活率。Yang等[31]報道低頻超聲聯合微泡造影劑作用組在抑制腫瘤生長、促進細胞凋亡、抑制細胞增殖和血管生成方面更有效。Wu等[32]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲使SMMC-7721人肝癌細胞凋亡增加，而遷移和侵襲能力明顯降低。

6 基因靶向治療

低頻超聲使微泡瞬間擊碎，空化效應產生的休克波使得局部毛細血管和臨近組織細胞膜的通透性增高，細胞外的大分子即可進入細胞，使DNA的基因轉染和表達明顯升高[33]。超聲造影劑微泡聯合低頻超聲介導的靶向基因治療不會引起機體的免疫反應和病毒載體產生的突變，是一種新型安全高效的基因轉染技術[34]。Wu等[32]報道低頻超聲聯合微泡可提高SMMC-7721人肝癌細胞siRNA的轉染效率，使轉染效率明顯提高，增強基因轉染。Zhao等[35]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲提高了MCF-7中siRNA的轉染效率和卟啉的攝取，更有效地抑制ER+乳腺癌，顯示出良好的協同作用。Delalande等[36]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可有效地傳遞質粒DNA、mRNA或siRNA。

微泡與基因結合的方式有兩種：一種是將微泡與裸基因或基因載體直接混合；另一種是將基因包裹在微泡的內部或與微泡外殼結合。微泡制備為基因載體后,既可經外周血管注入體內,又可在超聲引導下將基因與微泡載體直接注入靶區,用超聲輻照靶區破壞微泡,使內部及表面結合的基因釋放出來。

7 藥物輸送

化療是目前臨床治療腫瘤的重要方法之一，其利用被封裝在載體中的化療藥物消除快速分裂的腫瘤細胞。近年來研究發現攜帶藥物的超聲造影劑微泡聯合低頻超聲治療能夠局部改變腫瘤環境，改善血管通透性，增加腫瘤細胞內化療藥物濃度，增加化療藥物治療效果，抵抗腫瘤細胞耐藥性，改善藥物向腫瘤的輸送，即具有化療增敏效應[37-38]。將攜帶化療藥物的微泡造影劑靜脈注射入人體內，用低頻超聲輻照特定組織，使微泡破裂，輻照局部毛細血管破裂，微泡所攜帶的藥物由此通過內皮細胞屏障釋放到靶區。同時低頻超聲導致細胞膜產生一過性空隙，通透性增加，即聲孔效應，藥物分子得以進入細胞內，引起腫瘤細胞內藥物水平增加,增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，提高療效[39-40]。Xiao等[41]報道超聲造影劑微泡聯合低頻超聲可通過降低組織間質壓力來增強化療藥物進入腫瘤間質，以提高腫瘤治療的療效。Mariglia等[42]報道應用低頻超聲聯合微泡可增強核苷類似物吉西他濱的胰腺癌細胞毒性，提高胰腺癌化療效果，延長生存期。Zhao等[35]報道低頻超聲聯合多功能FOXA1載卟啉微泡通過超聲誘導聲穿孔效應顯著增加卟啉和siRNA的局部積累，對雌激素依賴性ER+乳腺癌具有良好的治療效果。Li等[43]報道氟尿嘧啶（5-FU）聚乳酸納米微泡受低頻超聲輻照可以進一步提高藥物的靶向性，有效抑制裸鼠肝細胞肝癌的生長。

利用超聲造影劑微泡聯合低頻超聲治療腫瘤仍處于實驗階段，有較多問題亟待解決。首先，微泡造影劑的破壞受多種因素的影響,文獻報道中所采用的超聲波參數（如超聲波工作頻率、聲強、超聲輻照時間與方法）并不完全一致。因此需研究對不同疾病的應用價值，并針對各種應用進行參數優化。其次，加強微泡與配體的結合力以及配體與受體之間的結合強度，增加靶向性，以及有效地控制釋放時機等是我們需要解決的重要問題。最后還需進一步提高超聲造影劑微泡聯合低頻超聲治療的安全性，減少溶血、微血管滲漏及毛細血管破裂等。總之,超聲造影劑微泡聯合低頻超聲治療腫瘤是一項具有廣闊應用前景的治療方法，具有安全、高效、靶向性好、可控性強等優點，是超聲醫學研究熱點之一。隨著超聲分子影像學和靶向微泡造影劑的發展，低頻超聲聯合微泡造影劑治療腫瘤將在基礎及臨床研究中得到廣泛的運用，為臨床腫瘤的治療帶來新的希望。