布加綜合征模型大鼠缺氧相關因子與表觀擴散系數的變化及臨床意義

朱楠 張甜甜 成德雷

布加綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）的本質是肝靜脈（hepatic vein，HV）回流受阻導致的淤血性肝損傷，若不經治療，最終會進展為肝硬化[1-2]。研究發現，在BCS的病理損傷中，缺氧誘導因子-1琢（hypoxia-inducible factor-1琢，HIF-1琢）、NF-資B 扮演重要角色，其參與調節BCS肝損傷中肝星型細胞活化，從而影響細胞外基質沉積、微循環灌注等情況，這些均表現為細胞內外水分子彌散變化，從而改變MRI表觀擴散系數（apparent diffu原sion coefficient，ADC）的水平[3-5]。在評估脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝損傷中已有ADC值應用的報道，但在BCS中的研究為數不多[6]。因此，本研究參考文獻[3]結扎下腔靜脈（inferior vena cava，IVC）建立下腔靜脈梗阻型BCS模型大鼠，并動態檢測肝臟ADC值與HIF-1琢、NF-資B水平的變化，初步探討其在BCS肝損傷中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組、建模 135只體重235～305 g的健康雄性SD大鼠購自安徽省立醫院動物實驗中心，在12 h明/暗交替光照下，溫度15～25益，濕度50豫～60豫條件下清潔飼養。按隨機數字表法分組：（1）對照組15只，僅常規飼養；（2）模型組 60 只（分為第 1、4、8、12 周亞組，每組15只），于劍突下正中開腹分離肝鐮狀韌帶，暴露肝后段IVC，用3 F微導管平行緊貼IVC，并以0號線環繞結扎IVC后將微導管抽出，結扎IVC松緊度適中，逐層縫合關腹（圖1，見插頁）；（3）假手術組60只（分為第 1、4、8、12周亞組，每組 15只），開腹后未結扎肝后段IVC，僅作切口縫合。

圖1 模型組結扎下腔靜脈（IVC）示意圖

1.2 MRI及DSA檢查 MRI檢查：使用GE HDXT-1.5T磁共振機。對照組于第12周末，模型組及假手術組分別于建模后第1、4、8、12周末隨機取9只大鼠，晨起停飼，常規麻醉后，取仰臥位，腹部加壓固定于腕關節線圈中心，掃描參數為TR 1 250 ms，TE 65 ms，FOV 55 mm伊55 mm，層間距 0.2 mm，層厚 3.0 mm，反轉角90毅，激勵次數 8，矩陣 192伊192，行常規 T1WI、T2WI序列檢查及仰臥軸面DWI檢查。b值取800 s/mm2，自旋回波-回波平面成像加脂肪抑制。測量ADC值，感興趣區（ROI）大小約 15耀20 mm2，盡量避開膽管、血管及肝臟邊緣，取3個ROI測得數值的平均值。DSA檢查：各組大鼠于MRI檢查后1 d行DSA，于任意一側下肢消毒、鋪巾，以21 G靜脈留置針穿刺股靜脈，注射對比劑觀察IVC血流情況。DSA檢查后1 d，麻醉下開腹處死大鼠，取肝臟作下述檢查。

1.3 常規病理檢查及免疫組化檢測 取MRI測量ROI相應層面的新鮮肝組織適量，用10%福爾馬林固定24 h，石蠟包埋，制作組織切片，HE染色后行常規病理學檢查。并以PicTureTM法（PicTureTM檢測試劑，美國Zymed公司）行免疫組織化學染色：石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5～10 min后PBS（ZSbio公司）沖洗。滴加一抗[兔抗 HIF-1琢（1:300）、兔抗 NF-資B（1:300）]，室溫孵育30～60 min后PBS沖洗。滴加通用型IgG抗體（Fab段）-HRP多聚體，室溫孵育10～20 min后PBS沖洗，應用DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，采用已知陽性片作為陽性對照，陽性表達為結構清晰的細胞質棕黃染色。

1.4 肝組織HIF-1琢、NF-資B的mRNA表達檢測 肝組織液氮研磨后加入1 ml TRIzol勻漿，嚴格按照說明書步驟提取總RNA，提取出的RNA逆轉錄合成cDNA（RevertAidTM逆轉錄試劑盒，美國Thermo Scientific公司），然后行 real-time PCR 檢測 HIF-1琢、NF-資B 的mRNA表達水平。PCR反應條件：95益2 min；95益5 s，60益10 s，40個循環。引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）如下：茁-actin 上游序列：5憶-CCCATCTAT原GAGGGTTACGC-3憶，下游序列：5憶-TTTAATGTCACG原CACGATTTC-3憶；HIF-1琢 上游序列：5憶-TGACCACTGC原TAAGGCATCA-3憶，下游序列：5憶-GGCTCCTTGGAT原GAGCTTTG-3憶；NF-資B 上游序列 5憶-AAGATCTGCC原GAGTAAACCG-3憶，下游序列：5憶-TCCCGTGAAATA原CACCTCAA-3憶；基因相對表達量以 2-吟吟Ct計算。

1.5 肝組織HIF-1琢、NF-資B蛋白表達檢測 肝組織細胞裂解、離心后收集上清液，按照1:4加入5伊SDSPAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min，冷卻到室溫，上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內，每孔5～20滋l。濃縮、分離后300 mA恒流轉膜90 min。漂洗5 min，室溫封閉 2 h。一抗[兔抗 HIF-1琢（1:300）、兔抗 NF-資B（1:300）]4 益孵育過夜，加入洗滌液（PBST），10 min/次，共 3次，相應二抗（山羊抗兔，1:5 000）室溫孵育2 h。加入PBST洗滌液，10 min/次，共3次。使用ECL超敏發光試劑盒（美國Thermo Scientific公司）檢測蛋白表達水平，以Image J軟件分析條帶灰度值，HIF-1琢、NF-資B的蛋白相對表達量依照內參照結果計算。

1.6 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用兩因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，各指標間相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BCS模型大鼠建立情況 對照組存活15只，假手術組第 1、4、8、12 周亞組分別存活 15、14、15、15 只，對照組及假手術組大鼠活動如常、反應機警，毛色光亮，DSA檢查均無陽性表現。模型第1、4、8、12周亞組分別存活13、14、13、13只，存活大鼠均成功建立BCS模型，模型組大鼠術后活動逐漸減少、反應遲鈍，毛色灰暗，肝后段IVC管腔明顯變窄，遠端擴張，4周后逐漸見側支循環形成（圖2）。

圖2 模型組第12周DSA檢查所見[肝后段IVC管腔狹窄（短箭頭所示），遠端擴張，見廣泛側支循環形成（長箭頭所示）]

2.2 各組大鼠MRI表現 各組大鼠常規T1WI、T2WI掃描肝實質信號均勻，肝表面光整（圖3）。對照組與假手術組ADC值比較，總體差異無統計學意義（F=0.282，P=0.889）；對照組 ADC值高于模型組（F=14.213，P=0.001）；模型組ADC值低于假手術組（F=13.145，P=0.001）。模型組ADC值呈現先下降后升高的趨勢，在模型組內各亞組整體比較，差異有統計學意義（F=11.275，P=0.001）；各亞組間兩兩比較，第1周亞組與第4周亞組、第1周亞組與第8周亞組、第4周亞組與第12周亞組間差異均有統計學意義（均P=0.001），其中以第4周亞組ADC值最低，見圖4（插頁）、表1。

2.3 各組大鼠HIF-1琢的mRNA及蛋白表達水平的比較 對照組各時點HIF-1琢的mRNA及蛋白表達水平均低于模型組（F=985.298、774.482，均 P=0.001），與假手術組比較差異均無統計學意義（F=1.217、0.653，P=0.315、0.627）。模型組各時點HIF-1琢的mRNA及蛋白表達均高于假手術組（F=563.814、878.432，均 P=0.001），并呈先升高后下降，各亞組間的差異均有統計學意義（F=864.961、372.287，均 P=0.001），其中以第 4 周亞組最高，見圖 5、表 2。

2.4 各組大鼠NF-資B檢測結果的比較 對照組NF-資B的mRNA及蛋白表達水平均低于模型組（F=376.254、682.548，均P=0.001）；與假手術組比較差異均無統計學意義（F=0.820、0.842，P=0.518、0.505，表 3）。模型組各時點HIF-1琢的mRNA及蛋白表達均高于假手術組（F=378.146、685.152，均 P=0.001），并呈先升高后下降，各亞組間的差異有統計學意義（F=248.165、347.134，均P=0.001），其中以第4周亞組最高，見圖5、表3。

2.5 各指標間相關性分析 模型組ADC值與HIF-1琢、NF-資B 呈負相關（r=-0.709、-0.717，均 P=0.001）；HIF-1琢與 NF-資B 呈正相關（r=0.901，P=0.001），見圖 6-8。

2.6 常規病例檢查及免疫組化檢測 對照組（圖9a，見插頁）及假手術組（圖9b，見插頁）大鼠觀察至第12周HE染色均未發現明顯肝組織損傷。模型組（圖9c，見插頁）大鼠肝臟病理損傷程度逐漸加重，12周亞組最顯著，可見肝索破壞、肝細胞變性、萎縮、壞死，肝竇擴張、紅細胞淤積等。對照組及假手術組觀察至第12周的HIF-1琢、NF-資B 免疫組化均無陽性染色（圖 10a～d，見插頁）；模型組HIF-1琢、NF-資B陽性染色呈棕黃色，均以第4周最顯著，主要分布于肝竇周細胞、匯管區間質細胞、血管內皮細胞和纖維組織（圖10e～f，見插頁）。

圖3 各組大鼠肝臟T1WI圖像（a：對照組第12周；b：假手術組第12周；c：模型組第12周）

表1 各組大鼠ADC值比較（×10-3mm2/s）

圖4 模型組肝臟表現擴散系數（ADC）偽彩圖

圖5 各組大鼠缺氧誘導因子-1琢（HIF-1琢）、NF-資B蛋白表達電泳圖

表2 各組大鼠HIF-1α的mRNA及蛋白表達水平的比較

圖6 缺氧誘導因子-1琢（HIF-1琢）與表觀擴散系數（ADC）值相關性

圖7 NF-資B與表觀擴散系數（ADC）值相關性

圖 8 缺氧誘導因子 -1琢（HIF-1琢）與NF-資B 相關性

圖9 各組大鼠肝臟組織常規病理檢查所見（a：對照組第12周；b：假手術組第12周；c：模型組第12周；HE染色，×200）

圖10 各組大鼠肝組織免疫組化檢測所見[a：對照組第12周缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）；b：假手術組第12周HIF-1α；c：對照組第12 周 NF-κB；d：假手術組第 12 周 NF-κB；e：模型組第 4 周 HIF-1α；f：模型組第 4 周 NF-κB；免疫組化染色，×200]

3 討論

DWI是反映水分子布朗運動情況的一項MRI檢查技術，其通過反映出組織間隙水分子擴散的改變，反映出肝損傷過程中細胞外間隙的變化信息，ADC值是其主要參數[6]，可以先于肝硬化形態學的變化，幫助早期判斷BCS肝臟損傷情況[5]。BCS是肝靜脈回流障礙導致的肝臟淤血缺氧損傷，其最終轉歸為淤血性肝纖維化[1]。研究發現[3-4]HIF-1琢、NF-資B參與BCS肝損傷，其可造成肝細胞水腫、肝微循環障礙、細胞外基質沉積等，進而導致細胞內外水分子和肝臟灌注的改變，從而反映在ADC值的變化[5-6]。本研究建立大鼠BCS動物模型，在BCS病程的多個時間點檢測了ADC值、HIF-1琢、NF-資B的變化，發現3者呈現一定的變化規律，提示其存在相關性，并可從一定程度上反映BCS肝臟淤血缺氧的嚴重程度。

HIF-1琢是調節細胞對缺氧反應的轉錄因子，其在缺氧期間可呈現高表達，進而誘導肝臟淤血缺氧損傷[7-8]。NF-資B是與免疫球蛋白K輕鏈基因增強子B位點特異性結合的核蛋白因子，缺氧時，可調節肝細胞、Kupffer細胞和肝星狀細胞在各種類型的肝損傷及肝纖維化中發揮作用[9]。本研究發現模型組各時間點HIF-1琢、NF-資B水平均高于對照組及假手術組，且呈正相關，提示其可能相互調節并參與了BCS模型肝損傷的進展。但模型組HIF-1琢、NF-資B水平并未持續升高，而是先升后降（第4周最高），這不同于其他原因肝病中隨肝損傷進展持續上升的報道[8，10-11]，說明其誘導BCS肝損傷的機制與其他類型肝病有所不同，可能是肝臟淤血缺氧后上調HIF-1琢表達，激活其下游TGF-茁1、PDGF-B等促纖維化信號轉導和上皮間質轉化，上調NF-資B合成、釋放，進而誘導肝臟氧化應激損傷，致使其在第4周表達水平最高[10，12]；4周后，側支循環逐漸形成，緩解門靜脈壓力及淤血缺氧，從而下調HIF-1琢、NF-資B水平，但其始終高于正常，且肝臟病理損傷仍緩慢進展，說明僅靠側支循環無法從根本解決BCS淤血性肝損傷[13]。

本研究發現，模型組ADC值低于對照組及假手術組，說明BCS肝組織存在水分子彌散受限；模型組的ADC值先下降后上升（4周最低），這不同于脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝病中隨肝損傷進展持續下降的報道[14-15]，這可能是因為隨著IVC結扎時間延長，前4周肝淤血缺氧加重，肝靜脈回流受阻導致微循環障礙，減弱水分子擴散能力和微循環灌注，肝細胞線粒體腫脹[5]，同時氧化損傷蛋白質、DNA生物大分子，改變細胞膜的流動性和通透性，降低ADC值[5，16]，故而4周時ADC值最低，表現出與HIF-1琢、NF-資B呈負相關。另一方面，肝淤血缺氧后引發HIF-1琢持續高表達及氧自由基增加，激活NF-資B及TGF-茁1信號，導致其下游靶基因的激活和HSC的活化，上調PDGF-B等因子的表達，抑制ECM降解[10-12]，加重門靜脈高壓、肝細胞腫脹、肝竇淤血，影響水分子擴散，從而降低ADC值，以上提示BCS肝淤血缺氧損傷程度與ADC值密切相關。

模型組在4周后逐漸建立側支循環，減輕門靜脈壓力，緩解淤血缺氧及氧化應激，下調HIF-1琢、NF-資B表達[10-12]，提示側支血管從一定程度上緩解了肝臟淤血缺氧及微循環障礙，改善細胞外基質沉積及水分子擴散，從而升高 ADC值，并下調HIF-1琢、NF-資B水平，這提示ADC值與HIF-1琢、NF-資B呈負相關，3者的變化均與淤血缺氧程度密切相關。然而，4周后模型組的HIF-1琢、NF-資B水平雖有下調，ADC值雖升高，但始終未達到正常水平，說明側支循環雖部分緩解了BCS淤血缺氧，但病理損傷仍隨IVC結扎時間延長而緩慢進展，這與大量臨床報道相符[1，13]，說明只有介入開通梗阻靜脈才是治療BCS的根本手段。

本研究的局限性在于大鼠肝臟體積較小，呼吸運動及肺底和腹腔氣體等均可能影響ADC值及病理取材的準確性。另外，大鼠生命周期有限，尚無法完美模擬人類中長達數十年的BCS病程。

綜上所述，IVC阻塞后隨著肝臟淤血缺氧進展，ADC值與HIF-1琢、NF-資B在BCS動物模型中的肝臟中呈負相關，3者均與淤血缺氧程度密切相關，可作為無創評估BCS肝損傷的一個新的選擇。