高鹽對乳鼠心臟成纖維細胞增殖與膠原分泌的影響及相關機制

劉娟 商黔惠，2 李璐 趙宇

(1遵義醫科大學臨床醫學研究所 心血管病研究所 高血壓研究室，貴州 遵義 563003；2遵義醫科大學附屬醫院心內科)

鹽是高血壓的重要易患因素之一，高鹽攝入可使大鼠血壓升高，同時出現血管纖維化和(或)心肌纖維化(MF)，增加心血管病的發生率〔1，2〕。研究證實，整體實驗中高鹽不僅可導致動物血壓升高，且可引起心血管、腎等重要靶器官的損傷〔3～6〕，鹽負荷加劇了各靶器官的損傷〔7，8〕。MF是多因素導致的心肌纖維持續性和反復加重的結果，是長期高血壓等疾病后心肌的代償性改變，主要表現為細胞增殖及膠原合成或分泌增加。長期高鹽飲食可誘導MF的發生〔9，10〕，MF后易誘發心力衰竭等的發生，加劇MF患者的死亡率〔11〕。心臟成纖維細胞(CFs)占心臟間質細胞總數的60%～70%〔12〕，參與細胞外基質合成和代謝〔13〕。CFs在外界病理因素的刺激下，可轉化為肌成纖維細胞，激活的肌成纖維細胞增殖和分泌細胞外基質的能力增強，進而加劇MF〔14〕。轉化生長因子(TGF)-β1主要由內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞等細胞合成，可控制多種細胞的增殖、分化及刺激細胞外基質的分泌。磷酸化smad2/3(p-smad2/3)是其下游信號分子，介導TGF-β1促纖維化的效應，smad7在該信號通路中主要發揮負性調控作用〔15〕。TGF-β1/smads通路是纖維化發生的重要分子機制〔16〕。課題組前期實驗表明，8%高鹽誘導的Wistar大鼠左心室纖維化模型中心肌細胞增大，膠原容積分數增大，其機制與TGF-β1/smads表達異常相關〔5，17，18〕。那么，在體外實驗中，高鹽是否能夠誘導CFs增殖和膠原分泌增加呢？是否會引起TGF-β1/smads信號通路蛋白表達異常？本研究旨在通過體外誘導實驗，以SD乳鼠CFs為研究對象，對高鹽致CFs增殖的Na+濃度、作用時間及膠原分泌進行初步研究，分析高鹽誘導CFs發生增殖及導致膠原分泌增加的可能機制，以期為相關實驗提供依據。

1 材料和方法

1.1材料 雄性SD大鼠12只，雌性SD大鼠24只，體重200 g左右〔許可證號為：SCXK-(渝)2012-0005〕，購買于中國人民解放軍陸軍軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，購買后進行合籠配種，取1～3天齡乳鼠進行細胞培養；DMEM培養基購買于美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自南美MRC；CCK-8細胞增殖試劑盒購自凱基生物；波形蛋白、TGF-β1、p-smad3、smad7一抗購買于美國Santa Cruz公司；二抗購于中國Proteintech公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2實驗動物倫理 本方案經遵義醫學院動物實驗倫理會審查，遵循動物福利和倫理原則，審查編號倫審〔2016〕2-067號。

1.3乳鼠CFs的培養及鑒定 3天齡乳鼠無菌條件下于超凈臺上開胸取出心臟，剔除心臟結締組織，留取心尖部并剪碎〔19〕，0.125%胰酶消化20 min，終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄上清，再用0.75 mg/ml膠原酶Ⅱ于37℃消化2 h，終止消化后再次1 500 r/min離心5 min，棄上清，貼壁培養90 min，棄去尚未貼壁的細胞懸液，加入含10%FBS的DMEM培養基，37℃、5%CO2孵箱中培養，待細胞貼壁后，倒置相差顯微鏡下觀察乳鼠CFs的生長狀況。波形蛋白免疫熒光法進行細胞鑒定。選取狀態良好的第4代CFs用于后續實驗。

1.4CCK-8測高鹽對乳鼠CFs增殖的影響并篩選促CFs增殖的最佳Na+濃度和作用時間 胰酶消化乳鼠CFs后，制備(3～5)×104個/ml的細胞懸液，每孔100 μl接種在96孔板中，血清饑餓法同步化24 h后，于DMEM培養基中加入相應NaCl，使培養基中Na+濃度范圍在146～176 mmol/L，梯度3 mmol/L，共分11組，培養基中Na+終濃度146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176 mmol/L(對應的NaCl濃度分別為：131.8、134.5、137.1、139.9、142.6、145.3、148.0、150.7、153.4、156.1、158.8 mmol/L)，加入培養基的NaCl分別為：1.39、1.56、1.74、1.92、2.09、2.27、2.44、2.62、2.79、2.97、3.14 mg/ml；對照組培養基Na+終濃度139 mmol/L為培養基中原有濃度，對應的NaCl濃度110 mmol/L。各組分別培養24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入增殖檢測液10 μl，37℃孵育3 h，波長450 nm處測定OD值。根據CCK-8結果確定促CFs增殖的最佳Na+濃度和作用時間，進行后續實驗。

1.5CCK-8增殖試劑盒檢測滲透壓對乳鼠CFs增殖的影響 CFs接種數量及同步化同1.4，根據1.4結果分為對照組(培養基Na+終濃度139 mmol/L)、高鹽組(培養基Na+終濃度161 mmol/L)、甘露醇組(甘露醇濃度為29.334 mg/ml，與高鹽組等滲，滲透壓為355.55 mOsm/kg)，培養48 h，每孔加入細胞增殖檢測液10 μl，37℃孵育3 h，波長450 nm處測定OD值。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測高鹽對乳鼠CFs中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的影響 乳鼠CFs以5×105個/ml的密度接種于培養瓶中，同步化及分組同1.5，培養48 h后收集細胞培養上清液，按照酶聯免疫檢測試劑盒說明進行Ⅰ型及Ⅲ型膠原的測定。

1.7Western印跡檢測高鹽對乳鼠CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響 細胞以5×105個/ml接種于培養瓶中，同步化及分組同1.5，培養48 h后收集細胞，總蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法行蛋白定量。十二烷基硫代硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行電泳，電轉到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，4℃孵育TGF-β1、p-smad3、smad7一抗過夜；TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜，將ECL化學發光試劑加在膜表面后，經Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像，采用Quantity One定量分析軟件進行積分吸光度測定，目的蛋白的積分吸光度值除以內參照GAPDH的積分吸光度值，得到各組蛋白條帶相對值。

1.8統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1乳鼠CFs的生長形態及鑒定 CFs在培養60 min后大多數已貼壁，伸展成梭形，多邊形，乳鼠CFs生長迅速，2～3 d即可進行傳代培養，傳代后CFs鋪滿培養瓶底，平行排列呈峰、谷樣結構特征(圖1)。波形蛋白單克隆抗體免疫熒光鑒定〔17〕結果顯示乳鼠CFs胞質著綠色熒光，4′,6-二脒基-2-苯基嘴哚(DAPI)復染胞核著藍色熒光，合并圖后胞核清晰可見，見圖2。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察乳鼠CFs的生長狀態和生長形態(×100)

圖2 乳鼠CFs 波形蛋白免疫熒光染色(×400)

2.2高鹽誘導乳鼠CFs增殖的時效量效關系及促CFs增殖的最佳Na+濃度和作用時間 CCK-8結果顯示，與對照組(培養基Na+終濃度139 mmol/L)比較，培養基Na+終濃度146～176 mmol/L作用48、72 h OD值顯著增高，其中培養基Na+終濃度161 mmol/L作用48 h時CFs增殖效應最為明顯，培養基Na+終濃度146～176 mmol/L 培養96 h OD值降低。由此確定，高鹽誘導乳鼠CFs增殖的最佳Na+終濃度為161 mmol/L，適宜的作用時間為48 h。見表1。

2.3滲透壓對乳鼠CFs增殖的影響 選擇促乳鼠CFs增殖最為顯著的培養基Na+終濃度161 mmol/L為高鹽組作用48 h后，高鹽組細胞OD值為1.214±0.154，細胞活性較對照組(OD值為0.857±0.064)和甘露醇組(OD值為0.906±0.119)顯著增高(均P<0.05)，甘露醇組細胞活性與對照組比較未見明顯變化(P>0.05)?？梢?，高鹽組與甘露醇組雖為等滲，但對細胞增殖的影響卻是不同的，高鹽組促進了細胞增殖，但甘露醇組對細胞增殖無影響。

表1 高鹽對乳鼠CFs增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05

2.4高鹽對大鼠CFs Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分泌的影響 高鹽(培養基Na+終濃度161 mmol/L)作用48 h后，高鹽組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分泌較對照組和甘露醇組顯著增多(P<0.05)，甘露醇組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分泌與對照組比較無差異(P>0.05)。見表2。

表2 高鹽對乳鼠CFs膠原分泌的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與高鹽組比較：2)P<0.05；下表同

2.5高鹽對大鼠CFs 中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響 高鹽組TGF-β1和p-smad3蛋白表達較對照組和甘露醇組顯著增多(P<0.05)，smad7蛋白表達顯著減少(P<0.05)；甘露醇組TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達與對照組比較無差異(P>0.05)。見表3、圖3。

表3 高鹽對乳鼠CFs TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響

圖3 高鹽對乳鼠CFs TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響

3 討 論

MF是指單位質量細胞外基質(ECM)中膠原含量或膠原容積分數明顯高于正常值及成纖維細胞增殖的病理表現，它與高血壓、心功能不全、心律失常等疾病密切相關〔20〕。ECM由膠原、彈性蛋白、纖維蛋白及蛋白聚糖等組成，其主要成分是膠原蛋白，且以Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原為主，二者為參與MF的膠原蛋白類型〔21〕。CFs是心臟組織的主要組成細胞，CFs主要合成的膠原類型為Ⅰ型和Ⅲ型膠原〔13〕。正常生理情況下，成纖維細胞少量分泌膠原蛋白，維持心臟的結構和功能，當受到外界病理因素刺激時，CFs處于激活狀態，重新增殖，并轉化成肌成纖維細胞，進而介導膠原蛋白過度沉積，導致MF發生〔22〕。

食鹽與高血壓的關系一直為人們所重視，高鹽飲食誘導高血壓及其靶器官損害的防治仍是重要的臨床課題。近年研究發現，高鹽飲食可誘導高血壓大鼠和正常血壓大鼠心血管纖維化〔6〕。另有體外實驗證實，高鈉鹽培養液能引起血管平滑肌細胞(VSMC)增殖、蛋白合成增加〔23〕，但高鈉鹽培養是否會影響CFs增殖和膠原分泌少見報道。本實驗通過模擬體外高鹽環境，觀察到當鹽濃度到達一定程度時會發生成纖維細胞增殖，另一方面，同樣的培養基Na+終濃度范圍，當培養時間延長至96 h時，OD值降低，表明細胞的死亡可能與時間的延長及濃度的增加有關，這樣的結果又會與各種心血管疾病的發生相關聯，故在后續實驗中選擇培養基Na+終濃度161 mmol/L作為高鹽組進行相關指標檢測。Na+是細胞外液中的主要陽離子，在維持細胞外液晶體滲透壓中的作用不容小覷，本實驗說明高鹽組與甘露醇組雖為等滲，但對細胞增殖的影響卻是不同的，高鹽促進了細胞增殖，與培養基中Na+濃度增加有關，并非是高鹽所致的滲透壓增高影響了細胞的增殖。課題組前期整體動物實驗結果顯示，長期給予Wistar大鼠8%高鹽飲食后，發現大鼠血管周圍和心臟間質發生了明顯的纖維化Masson染色顯示大鼠左心室膠原合成增加〔5〕。本實驗結果說明膠原分泌的增加與培養基中Na+濃度增加有關，與高鹽所致高滲透壓無關。

TGF-β1是強有力的促纖維化的細胞因子〔24〕，參與ECM的合成。TGF-β1 有3種亞型，分別是Ⅰ型(TβR-Ⅰ) 、Ⅱ型(TβR-Ⅱ) 和Ⅲ型(TβR-Ⅲ) ，其中 TβR-Ⅲ是由二硫鍵鏈接的蛋白聚糖，含量最多，與 TGF-β1 結合后，可將 TGF-β1 傳遞給TβR-Ⅰ或者 TβR-Ⅱ?；罨蟮腡βR-Ⅰ則調控下游smad2/3磷酸化，磷酸化smad2/3與smad4 結合形成活性的轉錄復合產物共同進入細胞核內，調節相應的靶基因轉錄，刺激成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞從而導致器官纖維化的發生與發展〔25〕。本實驗說明滲透壓相等的高鹽組與甘露醇組，對CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響不同，高鹽導致CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達異常，僅僅與培養基中Na+濃度增加相關。 綜上所述，高鹽能夠誘導大鼠CFs發生增殖，當Na+濃度161 mmol/L，作用48 h時CFs增殖效應最為顯著。高鹽可誘導CFs發生增殖以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原分泌增加，與培養基中Na+濃度增加有關，并非是高鹽所致的滲透壓增高影響了細胞的增殖及膠原分泌，其機制可能與培養基中Na+濃度增加導致TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達異常有關。