基于數據挖掘分析蒙藥忠倫-5治療類風濕關節炎的作用機制

付旭陽，高 麗，呂 宏，侯秋麗，陳金雙，孔令雷，石瑞麗

(1.包頭醫學院生理學教研室，內蒙古 包頭 014040； 2.包頭醫學院神經科學研究所，內蒙古 包頭 014040；3.山西大學中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006； 4.廣東省人民醫院麻醉科，廣東省 廣州市 510080；5.內蒙古監獄管理局第一醫院麻醉科，內蒙古 呼和浩特市 010000； 6.包頭醫學院麻醉學院，內蒙古 包頭 014040;7.中國醫學科學院、北京協和醫學院藥物研究所，北京市藥物靶標研究與藥物篩選重點實驗室，北京 100050)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是病因尚未明確的、以侵蝕關節為主的全身性免疫疾病。臨床表現為對稱性多關節炎及關節外病理性改變，逐漸出現骨組織的破壞與侵蝕，導致關節不同程度的畸形。患者需要長期服藥，藥物的副作用及經濟負擔嚴重影響患者的生活質量。

蒙藥復方忠倫-5，別名合日呼-5湯、忠倫阿湯等，由苦參(SophoraFlavescensAit，SFA)、梔子(GardeniajasminoidesEllis，GJE)、川楝子(FructusToosendan，FT)、訶子(TerminaliachebulaRetz，TCR)、肋柱花(Lomatogoniumrotatum，LR)組成，出自蒙醫著作《觀者之喜》，具有清熱涼血、舒筋止痛功效，是蒙醫治療熱性黃水病、游痛證、痛風、陳舊熱等疾病的常用方劑，傳統蒙醫臨床應用本方治療RA[1]，能夠明顯改善RA患者的生活質量，療效明確[2]。動物試驗中，忠倫-5對小鼠急性、亞急性和慢性炎癥，均有減輕炎性細胞因子對關節的刺激作用[3]。

作為“非物質文化遺產”的蒙醫學，經過長時間的發展，形成了一個全面而獨特的醫學體系。然而，從分子水平來理解蒙藥方劑仍然是一大挑戰。隨著生物信息學、系統生物學和多向藥理學的飛速發展，“網絡藥理學”概念被提出，基于網絡的藥物研發成為一種新的高效可行的方法。通過網絡橋接藥物和疾病，多方向、多角度地闡述藥物治療疾病的機制。已有研究證實了該方法的可行性[4-5]。為全面闡釋蒙藥忠倫-5的作用機制，本課題擬應用網絡藥理學方法全面地解析忠倫-5治療RA的機制，為傳統蒙藥的研發提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 忠倫-5成分信息及作用靶點的獲取登錄TCMSP數據庫[6](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，Version：2.3)和TCMID數據庫[7](http://www.megabionet.org/tcmid/，Version：2.0)獲得苦參、訶子、梔子、川楝子、肋柱花化合物信息，并以“經口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18”為條件篩選化合物。將化合物的2D分子結構式輸入到Swisstarget prediction數據庫[8](http://www.swisstargetprediction.ch)中，預測化合物的作用靶點，保存靶點uniprot ID和名稱等信息。

1.2 RA相關靶點的獲得在DISGENET數據庫[9](http://www.disgenet.org/，version 5.0)中，以“Rheumatoid arthritis”為關鍵詞，檢索與RA相關的靶點。刪除重復靶點并剔除相關性得分小于0.3的靶點，保留剩余靶點，與上述的忠倫-5靶點相匹配，得到忠倫-5治療RA的作用靶點數據集。

1.3 VENNY圖的制作登錄Draw Venn Diagram網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將各單味藥及靶點輸入在表格中，得到VENNY圖，找到5種成分共同作用的靶點。

1.4 蛋白-蛋白相關作用網路構建分析將數據集的靶點信息導入STRING數據庫[10](https://string-db.org/，Version 10.5)，種屬選擇“Homo sapiens”，獲得靶點間的蛋白-蛋白相互作用網絡，下載相關數據并導入Cytoscape(Version:3.2.1)軟件中，構建網絡、拓撲分析，根據自由度設置節點顏色及大小，構建為蛋白-蛋白相互作用網絡。

1.5 生物功能分析及參與通路獲得將忠倫-5治療類風濕關節炎作用的靶點uniprot ID導入Cytoscape軟件的GO插件(Version:2.3.5)中，設置物種“Homo sapiens”選擇“GO分析、參與生物過程分析及KEGG通路分析”設置P值<0.05，提交獲得相關結果。

1.6 Hub節點選擇及分子對接驗證應用Cytoscape軟件的cytoHubba插件，cytoHubba應用Maximal Clique Centrality(MCC)方法，綜合11個拓撲分析方法(Degree，Edge Percolated Component，Maximum Neighborhood Component，Densityof Maximum Neighborhood Component，Maximal Clique Centrality)和6個中心性方法(Bottleneck，EcCentricity，Closeness，Radiality，Betweenness，and Stress)，選擇關鍵靶點，找到作用于關鍵靶點的活性成分，將成分及應對的關鍵靶點輸入Systems Dock Web Site (http://systemsdock.unit.oist.jp，Version 2.0)進行分子對接，保存結果，根據對接得分分析活性成分與各靶點間的結合活性。

2 結果

2.1 靶點預測通過TCMSP和TCMID數據集得到忠倫-5的潛在靶點，并將這些靶點與DISGENET數據庫中RA的靶點進行對比，交集為治療RA的靶點，通過用uniprot ID獲得靶點全稱及簡寫，按“uniprot ID”及DisGeNET數據庫給出的“Probability”數值排序，得到忠倫-5治療RA的潛在靶點90個(Tab 1)。

Tab 1 Potential targets of Zhonglun-5 in treatment of rheumatoid arthritis

續表1

2.2 VENNY圖的制作為獲得5味藥的共同作用靶點，通過VENNY圖對結果進行可視化，將各味藥及相應的靶點通過Venn diagram網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作VENNY圖，發現雌激素受體β(estrogen receptor beta，ESR2)、細胞色素P450 19A1(cytochrome P450 19A1，CYP19A1)、雄激素受體(Androgen receptor，AR)、雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)靶點為5種單味藥共同作用的靶點，且較多作為共同靶點出現(Fig1)。

Fig 1 Different colors represented different herbs.

2.3 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建與分析考慮到疾病靶點和其它蛋白的相互作用，為全面闡釋靶點機制，將上述數據集的靶點及已有實驗證明的靶點腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及白介素6(interleukin-6，IL-6)通過STRING數據庫獲得蛋白-蛋白相互作用信息[3]，下載數據導入Cytoscape軟件進行可視化處理及拓撲分析，根據自由度設置節點顏色及大小，得到網絡圖(Fig 2)。圖中蛋白節點92個，邊754個。節點顏色由白到黃，顏色越深，節點自由度越高，節點大小由自由度決定，節點自由度越高節點越大。內圈為自由度排序為前30的節點。

2.4 GO插件分析結果通過Cytoscape中的GO插件對數據集中的靶點進行參與生物過程分析及KEGG通路分析。生物過程分析結果表明，靶點主要富集于對活性氧的反應(response to reactive oxygen species)、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、糖皮質激素生物合成過程(glucocorticoid biosynthetic process)、凋亡信號通路的正調節(positive regulation of apoptotic signaling pathway)、等多種生物過程中(Fig 3)，圖中Y軸為生物過程名稱，X軸為靶點在生物過程中的比例，各節點顏色代表P值，節點大小代表參與生物過程的靶點數；KEGG結果表明靶點參與的信號通路包括類固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)、氮代謝(nitrogen metabolism)、ABC轉運器(ABC transporters)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)等43條通路。將靶點參與通路信息導入到Cytoscape軟件中得到“靶點-通路”圖(Fig 4)，圖中以自由度設置節點大小，橙色通路，藍色為靶點，節點109個，邊341個，節點平均自由度為5.927。

Fig 2 Target protein interaction network of Zhonglun-5

2.5 Hub節點選擇及分子對接驗證將上述建立的“靶點-通路”圖導入Cytoscape軟件中，運行cytoHubba插件，對這些節點進行排序，選取排名前8的關鍵靶點(得分大于10)，分別為絲裂原活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9，MAPK9)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、信號轉導和轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和凋亡調節因子Bcl-2。找到與靶點對應的活性成分包括番紅花酸(crocetin)、玫瑰樹堿(ellipticine)、水麥冬甙(triglochinin_qt)、8-異戊烯基-山奈酚(8-首先通過數據庫獲得了90個蒙藥忠倫-5抗RA的靶點，并通過STRING數據庫，獲得了這些靶點的相互作用關系，其中Akt1、IL-6、TNF、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、EGFR及基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)等與多種蛋白存在聯系，這些結果與前期研究結果一致，證明了本次研究的科學性和可靠性。蛋白-蛋白相互作用結果證明這些靶點并非單獨起效，而是通過相關的作用關系、相互聯系isopentenyl-kaempferol)、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮(wighteone)、刺芒柄花素(formononetin)、苦楝子酮(melianone)、槲皮素(quercetin)和皮樹脂醇(40957-99-1)，應用Systems Dock進行分子對接，結果如下(Fig 5)，圖中顏色越深得分越高(最高值為8.416)。

Fig 3 Gene ontology terms for biological process of Zhonglun-5

Fig 4 Target-pathways

3 討論

Fig 5 Results of molecular docking

而產生效應。隨后我們通過網絡分析，發現忠倫-5主要參與氧化應激、內皮細胞增殖、糖皮質激素合成代謝、骨代謝、炎癥及凋亡等生物過程作為主要途徑作用于RA，反映出忠倫-5是多途徑的作用特點。在KEGG通路分析中，發現靶點參與的ras信號通路、PPAR信號通路、erbb信號通路、自噬相關通路、JAK-STAT信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、雌激素信號通路、IL-17信號通路均與RA密切相關。分析靶點-通路圖，得到蒙藥忠倫-5治療RA的Hub節點：MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，找到的活性成分包括番紅花酸、玫瑰樹堿、水麥冬甙、8-異戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮樹脂醇，最后通過分子對接確定了活性成分與靶點的結合活性，發現活性成分中番紅花酸不能與關鍵靶點結合，但番紅花酸可以與其他RA相關靶點結合，且有較多研究證實其具有抗炎作用，因此番紅花酸可作為活性成分存在。靶點中的EGFR與活性成分的結合能力較低，其它靶點均可與活性成分結合。

Hub節點中MAPK8、MAPK9、MAPK14為MAPK家族成員，MAPK作為重要的信號轉導通路，參與細胞的多種生物過程，且已有以MAPK作為治療靶點的成功案例。MAPK14是p38的α亞型，其參與的p38-MAPK通路與RA發病機制中的炎癥密切相關，活化的p38通過激活下游蛋白，間接影響基因表達。有實驗證實[11]，在RA滑膜組織中，炎性因子等因素刺激使T細胞的p38異常活化，抑制腫瘤壞死因子受體超家族成員6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，Fas)誘導的細胞凋亡，使組織中的炎癥持續存在；p38還能導致炎性因子、趨化因子的基因過度表達，進一步促進RA的滑膜細胞炎癥的發展。MAPK8和MAPK9是JNK的1/2亞型，JNK通路被認為與RA相關，當JNK和JNK上游的蛋白磷酸化被抑制時，基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP1)、基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)表達都被降低[12]，而MMP-1和MMP-13是介導軟骨破壞的關鍵蛋白。Akt1是蛋白激酶B，現有研究中，Akt主要通過PI3 Kinase-Akt經典信號途徑參與RA的發病，PI3 K/Akt通路通過激活各種下游靶蛋白，產生不同的生物效應[13]，且PI3 K/Akt/mTOR通路能夠調節自噬，為RA的研究熱點。STAT1和STAT3為信號轉導子和轉錄激活子，在RA纖維樣滑膜細胞增殖及炎癥反應中均有影響[14]，此外JAK/STAT信號通路通過誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)基因的表達[15]，參與軟骨的破壞中。有關忠倫-5與MMPs表達的研究已有證實，但對上游的STAT的影響，還需進一步研究。Bcl-2是與凋亡密切相關的基因，具有抗凋亡和延長細胞生命的作用。上述很多靶點及通路都作用于Bcl-2，產生相應的生物學效應。本研究發現，Bcl-2作為訶子和川楝子共同的靶點，參與多種生物過程及信號通路，并且可能以抗凋亡的作用干預疾病的發展，具有一定的研究價值。

最終我們確定了忠倫-5治療類風濕關節炎的主要靶點MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，活性成分有玫瑰樹堿、水麥冬甙、8-異戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮樹脂醇，本研究發現蒙藥忠倫-5主要通過MAPK通路、P13 K/Akt通路、JAK-STAT通路以及一些炎性因子發揮治療RA的作用。有關忠倫-5在RA中的抗炎作用既往已有一些報道，反映了本研究結果的可靠性，其它靶點及通路可作為后續研究的理論基礎。本研究較為全面地闡述了經典蒙藥復方忠倫-5治療RA的靶點及其信號轉導通路，為臨床應用該方提供了更多的理論依據，也為今后深入地研究忠倫-5的藥理作用機制提供了新的線索。