PM2.5通過NF-κB/NLRP3途徑促進金黃色葡萄球菌肺炎的研究

黃佳偉，魯嫻嫻，崔海燕，張斌，陳鵬，楊少萍，楊旭，李睿,*

1.華中師范大學生命科學學院，武漢 430079 2.華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院，武漢 430016

近年來，頻發的霧霾天氣使空氣污染問題成為公眾關注的焦點，而霧霾空氣中的細顆粒物(PM2.5)，即直徑≤2.5 μm的顆粒物，因其含有多種重金屬以及多環芳烴等有害物質，且粒徑小，可隨人的呼吸沉積于支氣管和肺泡中，因而可對呼吸系統產生巨大危害[1]。

大量流行病學調查表明，PM2.5與多種呼吸道疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌的發生發展具有明顯的相關性[2-4]。其中PM2.5與肺炎發生的關系格外引人關注。據報道，空氣中PM2.5濃度增加可導致肺炎的住院率增加[5]。李玉榮等[6]進行了合肥市大氣污染與肺炎門診量的時間序列研究，得出PM2.5濃度升高可能引起醫院肺炎日門診量增加。在肺炎中細菌性肺炎最為常見，而其中金黃色葡萄球菌肺炎的致死率高，治療費用昂貴，且近年來耐甲氧西林金葡菌的出現使得金葡菌感染的治療和控制越來越難，已給大眾健康和社會經濟帶來嚴重危害[7]。因此，進行動物學實驗探討PM2.5在細菌性肺炎發生發展中的作用具有重要意義。

動物學實驗側重從分子水平揭示環境污染物誘發相關疾病發病的機制，已有大量實驗證明，PM2.5能夠引起肺部損傷[8]。核因子κB(NF-κB)是機體產生炎癥反應過程中重要的轉錄因子之一[9]，已知包括過量的活性氧(ROS)、缺氧條件和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種因素都可活化NF-κB通路[10]。研究表明，PM2.5可以通過增強NF-κB活性使肺部炎癥因子生成增多[11]。然而，關于NF-κB通路的上下游分子以及在具體肺炎模型中發揮的作用，仍需要進一步探究。作為目前研究最多的一類炎性小體，NLRP3的表達受到NF-κB的調控[12]。它由病原識別受體NLRP3、接頭蛋白ASC和效應蛋白procaspase-1組成[13]。NLRP3被活化后可激活caspase-1，進而促進白細胞介素1(IL-1)家族細胞因子包括白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素18(IL-18)和白細胞介素33(IL-33)的成熟和分泌，導致組織局部炎性細胞浸潤[14]。Rho蛋白A(RhoA)是Rho-GTP酶家族的小分子量G蛋白成員之一，Rho激酶(ROCK)是RhoA的下游目標分子之一[15]。已知RhoA/ROCK通路參與前炎性因子產生過程[16]，在炎癥發生過程中，RhoA可能充當NF-κB通路上游的調控分子[17]。近期有研究以人肺上皮細胞(BEAS-2B)為材料，證明工業PM2.5可能通過活化RhoA/ROCK通路，進而激活NF-κB引起肺部炎癥[18]，但仍缺乏體內水平的證據。

本研究以Balb/c小鼠作為實驗對象，通過不同濃度的PM2.5暴露，同時建立金黃色葡萄球菌肺炎模型，以探究PM2.5在細菌性肺炎發生發展中的作用以及其中存在的分子機制，為與PM2.5相關的肺炎疾病提供防治基礎與依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

采用約5周齡的SPF級雄性Balb/c小鼠作為實驗動物模型，購自湖北省三峽大學。將小鼠飼養在華中師范大學實驗動物管理中心的SPF級環境中，條件為12 h:12 h光/暗周期，溫度20～25℃，濕度50%～70%。隨時供給小鼠充足的飲水和飼料。適應環境一周后開始實驗。

1.2 試劑與儀器

主要實驗試劑包括：金黃色葡萄球菌MRSA(StaphylococcusaureusMRSA)，購自武漢大學菌種保藏中心；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA-熒光染料，99.9%)，購自美國Sigma公司；微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；小鼠TNF-α、IL-1β酶連免疫吸附試劑盒，購自美國eBioscience公司；小鼠NF-κB p65、RhoA、ROCK1和NLRP3酶連免疫吸附試劑盒，購自上海源葉生物科技有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Trizol(99%)，購自美國Invitrogen公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、液氮、TBA和TCA，均為分析純，購自國藥集團；Mueller-Hinton瓊脂和MH肉湯，均購自青島海博生物技術有限公司。

主要實驗儀器包括：空氣/智能TSP綜合采樣器(嶗應2050型)，細菌搖床(THZ320，武漢大風)，恒溫培養箱(HP400S，武漢瑞華)，超凈工作臺(SW-CJ-2D型，蘇州凈化)，熒光定量PCR儀(CFX96 Touch，美國BioRad)，細胞計數儀(MTN-21，上海精密)，熒光酶標儀(FLx800型，美國Bio-Tek)，全波長酶標儀(DNM-9602型，北京普朗)，低溫冷凍離心機(Eppendorf-514R)等。

1.3 PM2.5收集和預處理

PM2.5收集在華中師范大學某建筑物樓頂(高約10 m)進行，采用PM2.5采樣器，石英纖維濾膜收集。采樣后將含有PM2.5的濾膜裁剪后浸入去離子水中，超聲振蕩并過濾取濾液于-80 ℃冷凍。過夜后置于冷凍真空干燥機中凍干至粉末狀，于-20 ℃保存備用。PM2.5染毒前，用無菌生理鹽水配制成相應濃度的懸液。

1.4 PM2.5暴露濃度設置

世界衛生組織(WHO)確定的人日均PM2.5暴露的限值為25 μg·m-3[19]，小鼠每日潮氣量為0.035 m3，體重按20 g計算，則25×0.035/0.02 ≈ 50 μg·kg-1，因此，確定暴露低濃度為0.05 mg·kg-1，10倍等比往上確定中、高濃度依次為0.5和5 mg·kg-1，高濃度PM2.5(5 mg·kg-1)與相關毒理學實驗中的所設置的濃度相當[20]。

1.5 實驗分組與暴露方案

將42只Balb/c小鼠隨機分成6組，每組7只，分別為：A. 生理鹽水對照；B. 5 mg·kg-1PM2.5；C. 肺炎模型；D. 肺炎模型+0.05 mg·kg-1PM2.5；E. 肺炎模型+0.5 mg·kg-1PM2.5；F.肺炎模型+5 mg·kg-1PM2.5。PM2.5采用氣道滴注的方式染毒，每天10:00進行，持續7 d。在第7天16:00時進行金黃色葡萄球菌滴鼻，構建肺炎模型。

人們往往是先接觸PM2.5再得肺炎，而且考慮到肺炎模型建立后小鼠可能的死亡及傳染性，為更好地模擬現實情況，本實驗采用先暴露PM2.5再建模的方式進行。

1.6 金黃色葡萄球菌培養與肺炎模型建立

取金黃色葡萄球菌菌株凍存管，用MH瓊脂平板復蘇，37 ℃過夜培養。挑取單個菌落接種于MH液體培養基，37 ℃、210 r·min-1震蕩過夜培養約8 h。離心收集菌體，用生理鹽水洗滌并重懸菌體。采用分光光度計檢測菌液的OD600，并按照1 OD = 2×109CFU·mL-1計算細菌濃度。最終給每只小鼠滴鼻濃度為5×1010CFU·mL-1的菌液50 μL，分2次進行，間隔30 min。為保持菌液的活性，菌液收集于PM2.5暴露的最后一天，即給小鼠滴鼻接種的當天進行。

1.7 肺組織勻漿制備

在PM2.5暴露周期結束后，即實驗的第8天，麻醉小鼠后取肺組織，于PBS(pH 7.5)中漂洗，以去除表面血跡。在濾紙上拭干，稱重，加入一定量PBS(pH 7.5)，用玻璃勻漿器在冰上制成10%的組織勻漿，將勻漿液離心(10 000 r·min-1、10 min、4 ℃)，取上清，將上清液分裝后凍存于-80 ℃冰箱，用于指標的測定。

1.8 肺泡灌洗液中菌落計數與炎癥細胞計數

采用體全肺灌洗法獲得小鼠肺泡灌洗液。小鼠深度麻醉后，剝離氣管，氣管插管，將生理鹽水注入小鼠肺部，回吸液體即為肺泡灌洗液。離心并重懸于0.5 mL生理鹽水中，取其中0.1 mL加入0.9 mL生理鹽水，即稀釋10倍，均勻涂于MH平板上，12 h后進行菌落計數。使用細胞計數儀對剩余0.4 mL重懸液進行各類炎癥細胞計數。

1.9 各項生物學指標的測定

用分裝好的肺組織勻漿進行各指標的測定。活性氧簇(ROS)含量用DCFH-DA熒光法檢測，GSH含量采用GSH試劑盒測定，丙二醛(MDA)采用TCA法檢測，TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、NLRP3、RhoA和ROCK1均采用ELISA試劑盒檢測。所有檢測嚴格按照說明書要求進行。

1.10 肺組織病理學切片制備

肺組織病理切片的制備流程依次包含取材、固定、洗滌脫水、透明、石蠟包埋、切片粘片、脫蠟、染色、脫水、透明和封片等步驟。進行蘇木精伊紅(HE)和Masson染色，評價小鼠肺組織病理學變化[21]。

1.11 熒光定量PCR

采用TRIzol法提取0.1 g肺組織中的RNA，之后用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme)試劑盒進行逆轉錄得到cDNA。最后用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)試劑盒并按照其程序進行qPCR檢測，考察NF-κB、NLRP3、RhoA、ROCK和β-actin(內參)等基因的表達，基因的引物設計如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.12 統計分析

實驗數據均采用平均值±標準誤表示。采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗組間均值差異，之后用Tukey-檢驗進行差異顯著性分析?！?”或“#”表示2組之間有顯著性差異(P<0.05)；“**”或“##”表示2組之間有顯著性差異(P<0.01)。

2 結果(Results)

2.1 小鼠體重與臟體比變化

各組小鼠實驗期間體重變化如圖1所示，對照組小鼠在實驗期間體重穩步增長，而經PM2.5暴露的小鼠體重的增長均減緩，5 mg·kg-1PM2.5濃度組小鼠體重甚至呈現下降趨勢。而在第7天建立肺炎模型后，各模型組的小鼠體重都明顯減小。

圖1 實驗期間小鼠體重變化注：1～7 d為PM2.5暴露期，第7天建立肺炎模型，第8天處死小鼠。5 PM2.5、0.5 PM2.5和0.05 PM2.5分別表示5、0.05和0.5 mg·kg-1劑量的PM2.5氣道滴注。Fig. 1 Changes in body weight of the mice during the experimentNote: the PM2.5 exposure was from 1 d to 7 d, the pneumonia model was established on the 7th day, and mice were sacrificed on the 8th day. 5 PM2.5, 0.5 PM2.5, and 0.05 PM2.5 represent 5, 0.5 and 0.05 mg·kg-1 doses of PM2.5 airway instillation, respectively.

如圖2所示，肺模組、5PM2.5組同對照組相比，小鼠肺臟體比都顯著增大(P<0.01)，表明肺部可能出現充血或水腫等情況。同時，經金黃色葡萄球菌建模的各組中，隨著PM2.5濃度的升高，肺臟體比逐漸增大，且肺模+5PM2.5組與肺模組相比出現顯著差異(P<0.01)。這表明高濃度的PM2.5能使肺炎充血現象更加嚴重，而中低濃度則不明顯。

圖2 小鼠肺臟體比注：** 表示與對照組相比具有顯著差異(P<0.01)，## 表示與肺炎模型組相比具有顯著差異(P<0.01),下同。Fig. 2 The ratio of lung weight to body weight of miceNote: ** means a significant difference compared with the control group (P<0.01); ## means a significant difference compared with the pneumonia model group (P<0.01). The same below.

2.2 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)菌落計數與炎癥細胞計數

為檢驗金黃色葡萄球菌模型的建立是否成功，在MH平板上進行肺泡灌洗液涂板菌落計數，結果如圖3所示。各肺炎模型組(肺膜、肺膜+0.05 PM2.5、肺膜+0.5 PM2.5、肺膜+5 PM2.5)在平板上均長出約1.2×105個菌落，而對照組與5 PM2.5組未長出金黃色葡萄球菌菌落，表明肺炎模型成功建立。

圖3 小鼠肺泡灌洗液(BALF)中菌落計數Fig. 3 Colony count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of mice

各組小鼠BALF中各類炎癥細胞數量如圖4所示，白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數量的變化趨勢基本一致，即表現為5 PM2.5組與對照組相比顯著增多(P<0.05)，而肺炎模型建立后炎癥細胞進一步增多。肺模+5 PM2.5較5 PM2.5顯著增多(P<0.05)，而各肺炎模型組之間并無顯著差異。以上結果進一步證明，肺炎模型成功建立，同時經PM2.5暴露染毒使得小鼠肺部炎癥細胞增多，發生炎癥反應。

圖4 小鼠BALF中炎癥細胞數量注：* 表示與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，# 表示與肺炎模型組相比具有顯著差異(P<0.05)；下同。Fig. 4 Number of inflammatory cells in BALF of miceNote: * means a significant difference compared with the control group (P<0.05), # means a significant difference compared with the pneumonia model group (P<0.05). The same below.

2.3 病理學染色切片

肺組織HE染色結果如圖5所示，與對照組相比，5PM2.5組與肺模組均出現了不同程度的氣道重塑現象。而經PM2.5暴露的肺模組中，隨著PM2.5濃度的升高，氣道重塑現象愈發明顯，具體表現為嚴重的結構變化，包括氣道平滑肌增厚并出現向內突起褶皺，氣道周圍的間質組織中炎癥細胞浸潤逐漸增多。結果表明，PM2.5不但直接造成肺部損傷，而且進一步惡化肺炎引起的病理效應。

圖5 小鼠肺組織HE染色Fig. 5 HE staining of lung tissue of mice

通過Masson染色來檢測肺組織纖維化程度，結果如圖6所示，在氣道重塑方面與HE染色結果呈現類似特征。在各肺炎模型組中伴隨著PM2.5暴露濃度的提升，氣道周圍被染成藍色的部分逐漸增多，即顯示纖維化程度逐漸升高。結果表明，PM2.5能夠進一步加重肺組織的纖維化。

圖6 小鼠肺組織Masson染色Fig. 6 Masson staining of lung tissue of mice

2.4 氧化應激水平檢測

通過ROS、MDA和GSH等典型指標檢驗小鼠肺部氧化應激程度。如圖7所示，5 PM2.5組與對照組相比，ROS和MDA的含量都顯著提高(P<0.05)。同時肺炎模型建立后，隨著PM2.5濃度的升高，ROS和MDA的含量呈現逐步上升趨勢，且肺模+5 PM2.5組的ROS含量顯著高于肺模組(P<0.05)。另一方面，還原性物質GSH的變化趨勢正好相反，即PM2.5暴露后GSH含量顯著下降(P<0.05)；而肺炎模型組中隨著PM2.5濃度的提高，GSH含量逐漸減少。以上結果均表明，PM2.5氣道滴注能使小鼠肺部發生明顯的氧化應激現象，同時也會加劇肺炎過程中出現的氧化損傷。

圖7 小鼠肺部氧化應激水平注：ROS、MDA和GSH表示活性氧、丙二醛和還原型谷胱甘肽。Fig. 7 Oxidative stress level of mice lungNote: ROS, MDA, and GSH represent reactive oxygen species, malondialdehyde, and reduced glutathione, respectively.

2.5 相關信號蛋白的檢測

為探究PM2.5引起肺部損傷并促進肺炎發生的具體機制，對NF-κB、NLRP3、RhoA和ROCK等信號蛋白進行qPCR和ELISA檢測，分別從基因和蛋白層面進行探究，結果如圖8所示。NF-κB的含量在PM2.5暴露和肺炎模型建立后與對照組相比均顯著上升(P<0.05)。同時隨著PM2.5濃度的提高，肺炎模型組中的NF-κB含量也逐步提升，而NF-κB的mRNA表達也表現出相同的趨勢，進一步印證這一改變。對于NLRP3，PM2.5暴露和肺炎模型建立后都呈現一定的上升趨勢，不過只有肺炎模型+5 PM2.5組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，相比而言，NLRP3在mRNA層面的改變更為明顯。而對于RhoA蛋白及其調控的下游分子ROCK，在PM2.5組和各肺炎模型組中，從mRNA和蛋白水平上均未檢測到明顯的變化趨勢，各組之間均無顯著性差異。

圖8 相關信號蛋白的檢測Fig. 8 Detection of related signal proteins

通過檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α來反映小鼠肺部炎癥水平，結果如圖9所示。IL-1β、TNF-α的變化呈現相似的趨勢，在5 PM2.5染毒后，二者的含量顯著升高(P<0.05)，而肺炎模型組與對照組相比顯著上升(P<0.05)。另外，在各肺炎模型組中，隨著PM2.5濃度的增大，IL-1β和TNF-α的含量都逐步提升，并且肺模+5 PM2.5組與肺模組相比有顯著性差異(P<0.05)。以上結果更進一步表明，PM2.5對于肺部炎癥的發生起到了明顯的促進作用。

圖9 炎癥因子檢測Fig. 9 Detection of inflammatory factors

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5引起肺部損傷與加重肺炎的作用

大量研究已經證實，PM2.5急性暴露能夠引發機體肺部損傷。本實驗選用Balb/c小鼠作為實驗動物模型，通過連續7 d進行5 mg·kg-1劑量的PM2.5氣道滴注暴露染毒，發現小鼠的體重顯著下降，肺臟體比顯著升高，提示PM2.5引起肺部充血或水腫。肺泡灌洗液中淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的數量較生理鹽水對照組均顯著增多，且炎癥因子IL-1β、TNF-α的含量也明顯上升，表明PM2.5引起肺部炎癥損傷。另一方面，選用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株作為病原微生物，采用一次性滴鼻的方式成功構建金黃色葡萄球菌肺炎模型[22]。研究發現，經PM2.5暴露的建模組發生了更為嚴重的病理反應，且呈現劑量-效應關系，即隨著PM2.5濃度從0.05 mg·kg-1增加到5 mg·kg-1，肺炎程度逐步加重。此外，從病理學切片中可以看出，小鼠的肺氣道壁逐步增厚并皺縮、氣道重塑和炎癥細胞浸潤現象愈發明顯，肺部纖維化程度也逐步加深。

3.2 PM2.5促病的分子機理——NF-κB信號通路

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內，能與多種細胞基因啟動子或增強子序列的特定位點結合的核轉錄因子，它與炎癥反應過程的密切相關性已被廣泛報道[23]。本研究中，通過qPCR和ELISA的實驗發現，在mRNA和蛋白水平上，小鼠NF-κB的含量在PM2.5暴露和肺炎模型建立后與對照組相比均顯著上升，同時隨著PM2.5暴露濃度的加大，肺炎模型組中NF-κB含量也逐步提升。這表明，在PM2.5導致肺損傷以及加重肺炎的過程中NF-κB被活化，NF-κB信號通路在該過程中發揮重要作用。

3.3 NF-κB被激活的原因

氧化應激是由機體氧化和抗氧化水平失衡引起的[24]。氧化系統中的主要成分ROS會攻擊生物膜和亞細胞結構中的不飽和脂肪酸等易被氧化的位置，脂質過氧化過程中產生的MDA會對機體造成巨大損傷[25]，而GSH的減少則意味著機體抗氧化系統的減弱，無法發揮清除氧自由基的作用[26]。本研究中發現，小鼠在PM2.5暴露后肺部的ROS、MDA含量顯著下降，同時GSH含量顯著上升，這表明小鼠肺部出現顯著的氧化應激反應。氧化應激刺激可以直接激活NF-κB信號分子，進而誘導下游的炎癥反應[27]。

RhoA/ROCK信號通路是體內普遍存在的一條信號轉導通路，該信號通路的關鍵信號分子包括Rho-GTP酶、ROCK和肌球蛋白磷酸酶。其中RhoA是Rho家族的Rho亞族中的一個重要的成員，活化的RhoA可激活其靶蛋白Rho激酶，即ROCK(Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶)。ROCK接受RhoA傳遞的活化信號后可介導其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應，進而影響多種細胞效應[28]。研究表明，RhoA/ROCK途徑可調節NF-κB從而加劇炎癥反應[29]。最近Yan等[18]對人肺上皮細胞進行PM2.5染毒，發現RhoA/ROCK通路被活化，進而激活NF-κB引起肺部炎癥。然而在本研究中，發現小鼠在PM2.5暴露和金黃色葡萄球菌肺炎模型建立后RhoA、ROCK的表達水平在mRNA和蛋白層面較對照組均無顯著改變。因此，筆者認為在PM2.5加重肺炎的過程中NF-κB的激活主要是由氧化應激介導的，而關于RhoA/ROCK通路在其中發揮的作用則有待進一步探究。

3.4 NF-κB下游分子事件NLRP3

炎癥小體是由胞漿內模式識別受體參與組裝的多蛋白復合物，是機體免疫系統的重要組成部分，NLRP3炎癥小體在機體免疫反應和疾病發生過程中具有重要作用，而NF-κB信號是NLRP3被激活的必要前提[30]。本研究結果表明，在PM2.5加重肺炎過程中，隨著NF-κB的激活，NLRP3也隨之被活化。而在NLRP3被活化后，又會進一步導致促進細胞凋亡的蛋白Caspase-1和炎癥因子IL-1β的表達，從而加劇機體炎癥反應[31]。本研究中發現IL-1β的水平在PM2.5暴露后顯著提高，進一步證明了NLRP3在此過程中發揮重要調控作用。

本研究結果表明，Balb/c小鼠經5 mg·kg-1PM2.5暴露7 d后小鼠體重明顯下降，肺部出現顯著病理損傷；更為重要的是，PM2.5暴露對于金黃色葡萄球菌肺炎起到了明顯的促進作用，在0.05～5 mg·kg-1范圍內呈現劑量-效應關系，加劇氣道重塑、炎癥細胞浸潤以及肺纖維化。PM2.5暴露使肺部出現了氧化應激效應，進而激活NF-κB信號通路，活化炎癥小體NLRP3，導致炎癥因子TNF-α、IL-1β表達升高，最終惡化了金黃色葡萄球菌肺炎。