有機磷酸酯對斑馬魚的早期神經(jīng)毒性作用研究

顧杰，吳江，王宏燁，石利利，吉貴祥,*

1. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042 2. 教育部現(xiàn)代毒理學(xué)重點實驗室，南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166

有機磷酸酯(organophosphate esters, OPEs)是一類重要的阻燃劑和塑化劑，廣泛應(yīng)用于化工、電子、建材以及紡織等行業(yè)。近年來，由于多溴聯(lián)苯醚類阻燃劑在全球范圍內(nèi)的逐步禁用，作為替代品的有機磷酸酯阻燃劑生產(chǎn)量大幅增加，使用范圍日趨廣泛[1-2]。2011年，有機磷阻燃劑在歐洲的銷售量已經(jīng)遠遠超過了溴代阻燃劑。全球OPEs產(chǎn)量從1992年的約10萬t增加到2007年的34.1萬t[3]。北美的磷酸三(2-氯異丙基)酯(TCPP)和已被列入歐盟高關(guān)注度物質(zhì)的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)的產(chǎn)量從1986年不足1.4萬t，于2012年增至超過3.8萬t[4]，此外，我國在2007年有機磷酸類物質(zhì)年均生產(chǎn)量接近7萬t，且每年增長速度達到15%[5]。

由于OPEs在使用中主要以簡單的物理添加而非化學(xué)鍵合方式加入到材料中，使其極易在材料使用過程中釋放到周圍環(huán)境中，造成環(huán)境污染[6-7]，且在環(huán)境中具有持久性[8]。自然環(huán)境中的OPEs含量的高值已達到μg·L-1或μg·kg-1級別[8-11]。劉靜等[12]研究珠江主干和東江河流沉積物發(fā)現(xiàn)，珠江主干主要污染物為磷酸三(丁氧基乙基)酯(TBEP)，其次為磷酸三丁酯(TBP)和磷酸三(2-氯)乙酯(TCEP)，均值分別為84.6、55.6和27.8 ng·g-1；東江河段沉積物中以磷酸三甲苯酯(TTP)、磷酸三苯酯(TPhP)和TBEP為主要污染物，平均濃度分別為55.6、32.7和17.5 ng·g-1。高小中等[13]研究發(fā)現(xiàn)，中國幾條較大河流，長江、東江和珠江中OPEs的濃度分別為4.2～86.6、5.5～76.4和11.6～178.5 ng·L-1。研究顯示，TCEP在我國松花江和太湖水體中的濃度分別達到3 700和688 ng·L-1，遠超過德國萊茵河和英國亞耳河中的濃度[14]；我國珠江三角洲魚體內(nèi)檢出了高濃度磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)(1 647～8 840 ng·g-1脂重)、TCEP(82.7～4 690 ng·g-1脂重)和磷酸三丁酯(TnBP)(43.9～2 950 ng·g-1脂重)，與在珠江三角洲附近水域中檢出高濃度OPEs的情況相符[14]。上述研究結(jié)果表明，目前我國OPEs的污染情況日益嚴(yán)重。

大量毒性實驗結(jié)果表明，多種OPEs具有明顯的毒性效應(yīng)。例如，Liu等[15]發(fā)現(xiàn)磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)對于斑馬魚具有肝臟毒性，會顯著提高多種肝臟毒性生物標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄，并且可以通過改變類固醇生成或雌激素代謝等多種方式對人體細胞和斑馬魚產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)環(huán)境中的OPEs會影響人體激素水平和男性精液質(zhì)量[17]。高丹等[18]研究發(fā)現(xiàn)，4種有機磷阻燃劑濃度與斑馬魚胚胎的孵化率、存活率、心率和體長呈負相關(guān)關(guān)系，與異常率呈正相關(guān)關(guān)系。

OPEs在結(jié)構(gòu)上與有機磷農(nóng)藥相類似，而有機磷農(nóng)藥具有神經(jīng)毒性，但是有機磷酸酯的神經(jīng)毒性研究甚少，因此，有機磷酸酯是否具有神經(jīng)毒性也值得關(guān)注。本文以斑馬魚作為模式動物，通過對斑馬魚幼魚運動行為軌跡、氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力和神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的研究，來探討3種有機磷酸酯阻燃劑，即磷酸三苯酯(TPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)和TCEP，對斑馬魚幼魚的早期神經(jīng)毒性，從而為有機磷酸酯類阻燃劑及其替代產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用和危險度評估提供直接依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

試劑：磷酸三苯酯(triphenylphosphate, TPP)純度為99%，CAS為115-86-6；2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-ethylhexyl diphenyl phosphate, EHDPP)純度為99%，CAS為1241-94-7；磷酸三(2-氯乙基)酯(tris(2-chloroethyl)phosphate, TCEP)，純度為97%，CAS為115-96-8；陽性對照毒死蜱(chlorpyrifos, CPF)，純度為99%，CAS為2921-88-2；以上試劑購自百靈威公司。過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司。

儀器：Infinite M200型酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)；水質(zhì)參數(shù)儀(HQ40d，美國哈希公司)；熒光定量PCR儀(ABI-7300，美國)；斑馬魚行為軌跡分析儀(Noldus，荷蘭)。

1.2 魚卵收集

本研究中使用的斑馬魚品系均為AB野生型，親魚購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，飼養(yǎng)于實驗室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，養(yǎng)殖用水為曝氣自來水，水溫控制在25～29 ℃，溶解氧大于6 mg·L-1，光周期為14 h∶10 h(晝:夜)。斑馬魚親魚用剛孵化的豐年蟲每天投喂2次，及時清除多余的飼料和排泄物。在繁殖的前一天，雄魚和雌魚以2∶1的比例放入繁殖盒中，用隔板將繁殖盒中的親魚雌雄分開。次日清晨，將繁殖盒中的隔板拆掉，在光照的刺激下，雄魚開始追逐雌魚，雌魚開始產(chǎn)卵，收集所產(chǎn)受精卵。在顯微鏡下挑選正常發(fā)育的受精卵用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗3次，用于暴露實驗。

1.3 胚胎和幼魚毒性試驗

以陽性參照CPF(0.3 mg·L-1)、TPP(0.1和1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(0.5和5 mg·L-1)進行暴露，濃度選擇參考Jin等[19]、Liu等[20]和Jarema等[21]的研究。CPF、TPP、EHDPP和TCEP用二甲基亞砜(DMSO)配制成母液，-20 ℃保存。

每個濃度組設(shè)3個平行。各濃度組及空白對照組均放斑馬魚胚胎90枚，以6孔板為實驗容器，實驗液體積為6 mL。為減少試驗容器對藥物的吸附，實驗前用相應(yīng)的試驗藥物濃度的溶液浸泡試驗容器12 h。胚胎收取后培養(yǎng)至受精后4 h(hour post fertilization, 4 hpf)，挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎進行染毒，隨機分組暴露于對照組、DMSO溶劑組(體積比為0.01%的DMSO)、CPF(0.3 mg·L-1)、TPP、EHDPP和TCEP的處理組，各處理組DMSO的體積比均小于0.01%，連續(xù)暴露至第6天。間隔24 h更換新配制的暴露溶液，定時觀察受試對象的活動狀況，及時取出死亡個體。斑馬魚不同生命階段的死亡標(biāo)準(zhǔn)如下，卵：特別是在早期階段，蛋白質(zhì)凝固和(或)沉降導(dǎo)致透明度下降，兼有顏色上的變化(白色不透明)；仔魚：靜止不動，無呼吸運動，心跳停止，中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈白色不透明顏色，對機械刺激無反應(yīng)等。

1.4 斑馬魚運動行為測試

根據(jù)Nery等[22]的實驗方法，每個濃度組隨機選擇24條受精后6 d (days post fertilization, 6 dpf)的斑馬魚幼魚放入24孔板置于斑馬魚行為分析儀中進行運動行為學(xué)測試，24孔板每孔加2 mL暴露液，主要測試幼魚在固定時間內(nèi)(50 min)自由游泳行為。受試魚在實驗之前進行10 min的適應(yīng)，實驗后剔除不正常數(shù)據(jù)。使用EthoVision軟件分別采集50 min內(nèi)各組幼魚的運動軌跡，利用軟件導(dǎo)出運動行為距離和游泳時間，然后計算每組魚游泳的總距離，各數(shù)值分別計入統(tǒng)計。

1.5 氧化應(yīng)激酶活力的檢測

每個濃度組收集6 dpf期的幼魚各20條，加裂解液(RIPA Lysis Buffer)500 μL，冰上超聲破碎組織(時間3 s，間隔6 s，振幅50%)重復(fù)2次，共持續(xù)6 s，4 ℃、15 000 r·min-1離心10 min取上清，供CAT和SOD測量使用。勻漿液中蛋白含量用BCA蛋白測定試劑盒測定。取50 μL適量勻漿液，采用碧云天試劑盒檢測SOD和CAT活力。CAT活性單位定義：每毫克組織蛋白中過氧化氫酶每秒分解吸光度為0.50～0.55的底物中的過氧化氫相對量為一個過氧化氫酶的活力單位(U·mg protein-1)。SOD酶活力單位的定義：在黃嘌呤氧化酶耦聯(lián)反應(yīng)體系中抑制率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(U·mg protein-1)。

1.6 神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的檢測

采用熒光定量PCR測定方法，利用Primer Premier軟件設(shè)計并合成神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因包括髓磷脂堿性蛋白基因(mbp)和突觸蛋白基因(syn2a)以及內(nèi)參照基因(β-actin)的Real-time PCR引物。每個濃度組收集6 dpf期的幼魚各20條，提取幼魚總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進行Real-time PCR實驗，檢測有機磷酸酯暴露對斑馬魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響，基因的引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.7 數(shù)據(jù)處理

先采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)發(fā)現(xiàn)各組均數(shù)不全相等，再用dunnett檢驗法比較分析有機磷酸酯對斑馬魚運動行為距離、SOD、CAT活性和神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計分析，使用SAS統(tǒng)計分析系統(tǒng)(version 9.13, SAS Institute, Cary, NC)進行，設(shè)P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 有機磷酸酯對斑馬魚幼魚運動行為的影響

受精卵連續(xù)暴露至第6天。如圖1所示，與對照組相比，6 dpf斑馬魚幼魚運動行為除了0.1 mg·L-1TPP組，其余暴露組均抑制了斑馬魚幼魚行為運動的總距離，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 有機磷酸酯(OPEs)暴露對斑馬魚幼魚(6 dpf)運動行為的影響注：(a). 不同暴露組斑馬魚幼魚行為軌跡；(b). 不同暴露組斑馬魚幼魚運動總距離；CPF表示毒死蜱，TPP表示磷酸三苯酯，EHDPP表示2-乙基己基二苯基磷酸酯，TCEP表示磷酸三(2-氯)乙酯；* P<0.05、** P< 0.01、***P<0.001。Fig. 1 The organophosphate esters (OPEs) exposure affected the locomotion behavior of 6 dpf zebrafish larvaeNote: (a). Behavior track of zebrafish larvae in different exposure groups; (b). Total movement distance of zebrafish larvae in different exposure groups; CFP stands for chlorpyrifos; TPP stands for triphenylphosphate; EHDPP stands for 2-ethylhexyl diphenyl phosphate; TCEP stands for tris(2-chloroethyl)phosphate; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.2 有機磷酸酯對斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激的影響

如圖2(a)所示，與對照組相比，TPP(1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(0.5和5 mg·L-1)顯著抑制SOD的活性，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。如圖2(b)所示，與對照組相比，TPP(1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(5 mg·L-1)可抑制CAT的活性，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。與對照組比較，陽性對照組CPF(0.3 mg·L-1)的CAT和SOD的活性略有下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 有機磷酸酯暴露對斑馬魚幼魚超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力的影響注：*P<0.05、** P<0.01、***P<0.001。Fig. 2 OPEs expsoure altered the levels of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity in zebrafish larvaeNote: *P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001.

2.3 有機磷酸酯對斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的影響

在少突膠質(zhì)細胞中表達的mbp通常作為斑馬魚和人類的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中樞軸突髓鞘化的生物標(biāo)志物[23-24]。syn2a是哺乳動物中形成突觸的生物標(biāo)志物，在突觸發(fā)生和神經(jīng)遞質(zhì)釋放中起重要作用[25]。如圖3(a)所示，與對照組相比，TPP(1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(5 mg·L-1)可抑制mbp基因的轉(zhuǎn)錄，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。如圖3(b)所示，與對照組相比，TPP(0.1和1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(0.5和5 mg·L-1)可以抑制syn2a基因的轉(zhuǎn)錄，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

隨著歐盟對溴代阻燃劑的禁用，有機磷酸酯阻燃劑作為新型阻燃劑產(chǎn)量持續(xù)快速增長，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大。作為一類新型污染物，OPEs已廣泛分布于各種環(huán)境介質(zhì)中，對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成潛在威脅。OPEs與有機磷農(nóng)藥具有相似的分子結(jié)構(gòu)，提示其可能具有神經(jīng)毒性。然而，OPEs的神經(jīng)毒性的研究工作仍處于起步階段，對于OPEs如何引起神經(jīng)毒性的作用機制較少涉及。因此，針對OPEs的神經(jīng)毒性作用機制研究將有利于尋找OPEs神經(jīng)毒性作用的靶點，為OPEs的神經(jīng)毒性作用的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，TPP、EHDPP和TCEP暴露對斑馬魚幼魚的運動行為具有抑制作用，其可能與氧化應(yīng)激和神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān)。運動行為代表神經(jīng)控制的活動系統(tǒng)，已被廣泛用于測試環(huán)境化學(xué)品的神經(jīng)毒性[26]。研究發(fā)現(xiàn)，TPP、EHDPP和TCEP暴露顯著抑制了斑馬魚幼魚的運動距離，提示TPP、EHDPP和TCEP可能介導(dǎo)了斑馬魚幼魚早期階段的神經(jīng)毒性。

氧化應(yīng)激是活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生與機體抗氧化能力的失衡引起的。在正常生理狀態(tài)下，ROS可被抗氧化防御系統(tǒng)有效清除，保障各種生理功能正常有序進行；若兩者失衡，就會導(dǎo)致機體損傷。許多外源化學(xué)物質(zhì)進入機體后可產(chǎn)生氧自由基，引起氧化損傷，這是引起細胞死亡的重要誘因。SOD將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，是抗氧化系統(tǒng)中的第一道防御屏障，而CAT催化過氧化氫轉(zhuǎn)化成水。本研究發(fā)現(xiàn)，SOD和CAT的活性在TPP、EHDPP和TCEP暴露后顯著降低，這與彭濤等[27]、龍鼎新等[28]和劉曉暉等[29]的研究結(jié)果相類似。因此，TPP、EHDPP和TCEP可能通過產(chǎn)生氧化損傷產(chǎn)生了神經(jīng)毒性。

圖3 有機磷酸酯對斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的影響注：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。Fig. 3 OPEs affected the expression of key genes for neurodevelopment in the zebrafish larvaeNote: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

此外，本研究還探討了OPEs暴露對神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的影響。在髓鞘少突膠質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)的mbp基因也被認為是神經(jīng)發(fā)育的生物標(biāo)志物[23-24]，syn2a基因作為神經(jīng)遞質(zhì)釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑并涉及突觸發(fā)生[25]。Sun等[30]研究發(fā)現(xiàn)，3種有機磷酸酯(TNBP、TBOEP和TCEP)都會對抑制斑馬魚幼魚運動行為，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，同時均抑制了mbp和syn2a基因。He等[31]研究發(fā)現(xiàn)，甲胺磷抑制斑馬魚幼魚的運動行為，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，也顯著下調(diào)了mbp和syn2a基因。本研究發(fā)現(xiàn)，TPP、EHDPP和TCEP顯著抑制mbp和syn2a基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)mbp基因可能抑制少突膠質(zhì)細胞，進一步影響髓鞘的形成；下調(diào)syn2a可能會影響神經(jīng)分化和突觸形成，并最終導(dǎo)致神經(jīng)行為障礙。

綜上所述，斑馬魚幼魚在早期神經(jīng)發(fā)育階段暴露于TPP、EHDPP和TCEP可能會通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和抑制神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性。