淡水雙殼類背角無齒蚌AwHSP70基因克隆及多溴聯苯醚-47對其表達的影響

薛士鵬，王涵，宋國英，華春秀，于瑞雪，劉慶春，王中曉，張慶遠，劉麗，李冰潔，夏西超,,*

1. 南陽醫學高等專科學校基礎醫學部，南陽 473061 2. 平頂山學院醫學院，平頂山 476000

熱休克蛋白(HSP)是一個超基因家族，在調節機體應激反應和耐受性方面發揮重要作用[1-2]。在正常和應激條件下，HSP幫助蛋白質折疊、膜轉位和錯誤折疊蛋白質降解等方面具有積極作用[3-4]。根據其分子量不同，HSP可以分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP20等5個家族，HSP70是最為保守且研究相對廣泛的家族之一[5-6]。HSP70對環境應激反應性較為敏感，溫度、氧化應激、重金屬、能量代謝抑制劑、紫外線和輻射、病毒、細菌和寄生蟲感染均可誘導HSP70表達，以增強機體的耐受能力[7-9]。多聯苯醚(PBDE)是常見淡水持久性有機污染物，具有持久性和高生物蓄積的特點，已經引起學者的極大關注[10]。PBDE-47是水體中最豐富的有機污染物，其生物毒性顯著強于其他溴化化合物[11]。我們前期的研究結果表明，PBDE-47可能導致淡水背角無齒蚌機體應激反應并產生急性毒性效應，具體機制有待進一步探究。在本研究中，從背角無齒蚌中克隆出AwHSP70完整基因序列，通過real-time PCR分析AwHSP70表達，為揭示PBDE-47毒性效應奠定理論基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

背角無齒蚌購自南陽市水產市場，殼長(6.5±0.5) cm，處理之前，動物置于實驗室自動水循環系統中適應養殖2周。PBDE-47(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶解于二甲亞砜(DMSO)制備儲備液。動物處理實驗在長方形塑料盒(40 cm×25 cm，高10 cm)中進行，飼養采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[10]。為了確定AwHSP70組織分布，對來自同一塑料盒5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。根據上述動物處理方法，將80只河蚌隨機飼養于10個塑料盒中，每盒8只，分為對照組和PBDE-47處理組，每組5個盒子。PBDE-47處理組采用3.36 μg·L-1的PBDE-47進行處理，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。第0、1、3、6、9、12和15天從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑(寶生物工程(大連)有限公司，大連)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應模板。

1.2.2 背角無齒蚌AwHSP70核心片段的擴增

簡并引物AwHSP71和AwHSP72分離AwHSP70 cDNA保守區域片段，PCR產物連接至pMDT-19載體，雙向測序。確定HSP70部分cDNA序列后，根據部分cDNA序列設計的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，擴增AwHSP70 cDNA 5’和3’區域序列，5’Race和3’Race的PCR產物進行測序和拼接。

1.2.3 序列和系統發育分析

分析AwHSP70序列，通過GenBank數據庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行BLAST程序比對；根據http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP預測信號肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白質結構域；使用DANMEN分析程序對AwHSP70基因進行多序列比對；通過Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)預測AwHSP70的蛋白質三維結構；使用MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

1.2.4AwHSP70 mRNA水平定量檢測

為了確定AwHSP70轉錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進行定量分析。β-actin作為內參基因，根據AwHSP70-F和AwHSP70-R引物常用PCR儀中的分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳檢測出一個條帶，并進行PCR產物測序和序列鑒別。使用ABI7500實時檢測系統(Applied Biosystems，美國)進行real-time PCR分析，構建標準曲線，通過2-△△CT分析AwHSP70表達水平。

1.2.5 統計學分析

2 結果(Results)

2.1 背角無齒蚌AwHSP70基因的cDNA及預測蛋白質序列分析

AwHSP70 cDNA序列由2 305 bp核苷酸序組成，全長cDNA包含1個67 bp的5’-端非編碼區、1個267 bp的5’-端非編碼區和1個1 971 bp的開放閱讀框。開放閱讀框為由657個氨基酸組成的多肽，分子量為71.57 kDa，理論等電點為5.61(圖1)。AwHSP70具有HSP70家族3個標簽序列(7-IDIDLGTTYSLGTTYSCV-16、197-IFDLGGGTFDVSIL-210和334-IVLVGGSTRIPKV-348)，ATP/GTP結合位點為131-AEAYLGQR-137，核定位信號區域為246-KRKHKKDISDNKRSVRR-262，另有C末端高度保守的EEVD序列和重復序列GGXP(圖1)。

2.2 背角無齒蚌AwHSP70的進化關系

BLAST分析顯示，AwHSP70的氨基酸序列與HSP70家族成員具有顯著相似性，與三角帆蚌和光滑雙臍螺同源性分別為98.63%和88.43%。AwHSP70與模式生物小鼠、斑馬魚、非洲爪蟾、水蚤和果蠅同源性分別為86.76%、85.54%、81.76%、81.91%和71.88%。為了分析AwHSP70的進化關系，分別從脊椎動物和無脊椎動物物種中選擇HSP70家族的不同成員，通過MEGA5.0鄰接法構建系統進化樹。AwHSP70與雙殼類和腹足綱動物親緣關系最近，昆蟲、甲殼動物和哺乳動物次之，脊椎動物較遠，細菌親緣關系最遠(圖2)。

圖2 根據背角無齒蚌AwHSP70氨基酸序列使用鄰接法構建的系統進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed by adjacency method according to the Anodonta woodiana AwHSP70 amino acid sequence

2.3 背角無齒蚌AwHSP70 mRNA的組織分布

組織分布結果顯示，AwHSP70廣泛表達于背角無齒蚌斧足、鰓、心臟、肝胰臟、血淋巴、閉殼肌和外套膜(圖3)。上述組織中，AwHSP70 mRNA在肝胰臟中表達水平最高，鰓和血細胞次之，心臟、閉殼肌、外套膜和斧足最低(圖3)。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 PCR amplified primer sequence

圖3 背角無齒蚌AwHSP70基因的空間表達注：每組數據來源于5只動物，重復3次。Fig. 3 The spatial expression of Anodonta woodiana AwHSP70 geneNote: Each group data was derived from five animals and the experiment was repeated three times.

2.4 PBDE-47對背角無齒蚌AwHSP70表達的影響

正常條件下，AwHSP70在背角無齒蚌肝胰臟、鰓和血淋巴表達穩定，PBDE-47處理組中AwHSP70表達水平受到顯著影響。1～15 d內，PBDE-47處理后肝胰臟中AwHSP70 mRNA水平隨時間顯著上調(圖4)；與對照組相比，AwHSP70 mRNA水平在第1天增加2.79倍(P<0.01)，第15天增加13.15倍(P<0.01)(圖4A)。PBDE-47處理后，與對照組相比，鰓中AwHSP70表達水平顯著上調；且變化趨勢呈現倒U字形，1～6 d內AwHSP70表達水平顯著上調，第6天達到峰值，6～15 d內呈現下調趨勢(圖4B)。與對照組相比，第1天后血淋巴中AwHSP70 mRNA水平增加了1.81倍(P<0.05)(圖4C)。

圖4 PBDE-47對背角無齒蚌肝胰腺AwHSP70基因表達的影響注：A 肝胰腺，B 腮，C 血淋巴；n=5，*、**表示與相應對照組相比差異顯著(P<0.05、P<0.01)。Fig. 4 The effect of PBDE-47 on AwHSP70 gene expression in Anodonta woodiana hepatopancreasNote: A, hepatopancreas; B, gill; C, hemolymph; n=5; *, **indicates a significant difference compared with the corresponding control group (P<0.05, P<0.01).

3 討論(Discussion)

在AwHSP70蛋白質序列中包括HSP70家族的保守結構域和特征性序列，如：HSP70標簽序列1、2和3，細胞核定位信號、ATP/GTP結合位點序列、C末端最后4個氨基酸形成EEVD特定基序，提示AwHSP70是一種胞漿類型熱休克蛋白。根據HSP70家族特征序列和細胞中的分布，可將HSP70劃分為不同類型。EEVD保守結構被視為胞漿類型熱休克蛋白與其他類型區別的關鍵標志。HSP70的GGMP氨基酸重復結構域能夠促進HSP90和其他輔助分子與其形成多分子伴侶復合體[12-13]。GGMP重復區域還參與蛋白質三維結構和螺旋亞結構域形成，在介導輔助因子與分子伴侶結合方面發揮重要作用[14]。由此可見，GGMP在AwHSP70形成的連續重復區域可能在多分子伴侶復合體形成和輔助因子識別方面發揮重要作用。值得注意的是，AwHSP70氨基酸序列與其他HSP70家族成員具有高度同源性，但UTR核苷酸序列卻各不相同，推測HSP70的UTR核苷酸序列差異性可能與不同物種HSP70轉錄調控的復雜性有關。

序列比對和系統進化分析結果顯示，從軟體動物到昆蟲，以及到脊椎動物，HSP70譜系高度保守。背角無齒蚌和三角帆蚌存在更為親近的親緣關系，提示二者在進化上來自同一個祖先。背角無齒蚌AwHSP70 mRNA具有廣泛的分布，提示這種分布模式與AwHSP70參與環境應激反應和提高耐受性相關。肝胰臟是軟體動物主要的消化、吸收和分泌器官，不斷接觸溫度、pH和水體成分等變化，對環境改變敏感[15]。鰓是動物的呼吸器官，環境中污染物主要入口之一，并與污染物直接接觸[16]。雙殼類微循環系統是一個淋巴細胞和血細胞混合在一起的開放式循環系統，淋巴細胞和血細胞在淋巴管、血竇以及全身軟組織中流通。黏膜組織中淋巴細胞和血細胞填盈充足，與這些器官與周圍環境進行氧氣交換或營養素提取有關。血淋巴是應對環境應激的重要防線[17]。肝胰臟、鰓和血細胞在維護動物穩態方面發揮關鍵作用，也是環境因素作用的關鍵靶器官。肝胰臟、鰓和血淋巴中的AwHSP70表達水平相對較高，提示這種分布模式很可能與器官功能有關。

在本研究中，PBDE-47處理能夠誘導肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP70表達，提示背角無齒蚌能夠通過上調AwHSP70表達提高對PBDE-47暴露的適應能力和耐受能力。背角無齒蚌作為一種濾食性淡水生物，靠過濾水體中營養物質來維持生存。PBDE具有較高親脂性，水中溶解的PBDE很容易蓄積在細胞中，導致活性氧(ROS)大量產生。正常情況下，ROS很快被一系列抗氧化酶清除，維持在一個合理水平。在應激環境中，過量生成ROS引起DNA損傷、脂質過氧化和蛋白質糖基化，導致蛋白質錯誤折疊可能性增加。HSP70表達上調有助于幫助錯誤折疊蛋白質進行修復和轉膜，并促進錯誤折疊白質降解，提高機體環境適應性和耐受性。與其他熱休克蛋白家族相比，HSP70研究較為廣泛且對環境應激較為敏感。暴露于重金屬和多環芳烴類后，紫貽扇貝能夠上調HSP70表達提高對污染物的耐受能力[18]。蝦夷扇貝暴露于麻痹性貝類毒素后，能夠增加HSP70表達水平以增強毒性應激的適應能力[19]。高溫條件下，太平洋牡蠣通過增加HSP70表達來提高自身對高溫的適應能力[20]。抗抑郁型藥物氟西汀處理后，河蜆消化腺中HSP70 mRNA表達水平上調[21]。研究證實，一些蚌類HSP70表達可被重金屬激活，該過程是金屬硫蛋白調控途徑的重要環節之一[22-27]。干擾機體蛋白質正確折疊是環境因素和污染物干擾機體功能的重要路徑之一，而激活HSP表達是動物提高環境適應能力的關鍵策略[28]。由此，AwHSP70表達上調是背角無齒蚌應對PBDE-47引起的氧化應激重要手段之一。

PBDE-47處理后，肝胰臟中AwHSP70 mRNA水平上調表現出時間依賴模式，提示這種模式與動物的代償機制相關。動物長期暴露在PBDE-47環境中，機體通過適應性機制處理應激效應，并逐漸恢復細胞穩態。作為一種細胞內的分子伴侶，HSP70參與細胞內外免疫調控并保護細胞免受環境應激損害，HSP70表達常表現出時間和劑量依賴性模式。銅、鎘和180CST燃料油等重金屬和其他化學物質處理后，紫貽扇貝肝胰臟中HSP70表現出時間依賴性的上調模式。渦鞭毛蟲毒素處理蝦夷扇貝后，HSP70表達水平呈現出時間依賴性上調模式。太平洋牡蠣高溫條件下HSP70表達水平呈時間依賴性上調模式。苯并芘處理后，菲律賓哈仔消化腺中HSP70和HSP90表達水平顯著上調，其絕對表達水平呈現時間和劑量依賴性反應。

整個實驗過程中，背角無齒蚌鰓中AwHSP70表達呈現倒U型曲線，早期上調，中期達到峰值，晚期下降，提示這種現象可能與動物應對持續產生氧化應激的耐受能力有關。隨著PBDE-47處理時間延長，PBDE-47在體內不斷蓄積，將不斷產生ROS，導致細胞應對不斷增加的氧化應激效應。機體通過上調HSP表達的方式減少錯折疊蛋白質的產生，增強耐受性[29]。一旦PBDE-47處理后氧化應激水平達到峰值并超出細胞耐受能力，巨大應激效應將導致慢性損傷、炎癥和細胞凋亡[30-31]。這種情況下，如果動物喪失產生新細胞去補償死亡細胞的能力，活細胞數量將逐漸降低[32-33]。由此，PBDE-47處理后AwHSP70表達水平呈現出倒U型曲線變化趨勢。

值得注意的是，水蚤LC50急性毒性結果顯示，PBDE-28、PBDE-47、PBDE-99和PBDE-100呈現出不同的毒性效應，其原因與這些物質的親脂性有關。其中PBDE-47、PBDE-99和PBDE-100具有明顯的高親脂性，呈現出較強的毒性效應[34]。由此，為了系統分析PBDE-47對背膠無齒蚌和淡水生物的毒性效應，需要從多個基因靶點和多個靶組織予以分析。總之，本研究首次從背角無齒蚌中克隆出AwHSP70 cDNA序列，該序列包含HSP70家族高度保守的標簽序列。PBDE-47處理可顯著上調肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP70表達水平，AwHSP70轉錄水平上調與提高動物的耐受性和適應能力密切有關。