微囊藻毒素-LR對雞肝臟的氧化損傷影響

張大文，袁麗娟，張莉，向建軍，廖且根，羅林廣，邱素艷

江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所，南昌 330200

藍藻是地球上最早出現的光合自養原核生物，是所有藻類中最原始、最簡單的一類。由水體富營養化引起的藍藻“水華”對環境和人類健康的危害已成為全球關注的重大環境問題，是一種全球性的生態災害[1-2]。但是，藍藻中富含蛋白質，是巨大的蛋白質資源庫，是優質的飼料蛋白源和飼料添加劑。天然藍藻中有機質達65%以上，藻泥的蛋白質含量達40%，與大豆的蛋白質含量相當，同時具有豐富的氨基酸和維生素，營養價值極高[3-5]。但是，藍藻中的部分種類(主要的水華藍藻)能產生一系列毒性很強的天然毒素(稱為藍藻毒素)危及人類的健康[6]。自然環境中最常見、關注度最高的藍藻毒素是微囊藻毒素，迄今為止已發現了100多種同分異構體[7]，其中，毒性較大、研究較為深入的是微囊藻毒素-LR(MC-LR)[1]。MC-LR腹腔注射小白鼠的LD50值一般在50～60 μg·kg-1(體重)，其毒性與化學類有機磷神經毒劑相當[8]。

目前，國內外對藍藻飼料化利用進行了初步探討[9]，但是未考慮其中的藍藻毒素對動物的毒性效應。關于藍藻毒素(微囊藻毒素)對動物毒性的研究主要集中在水產品和哺乳動物[6,10-11]，而對家禽毒性效應的研究鮮有報道。王春雨[12]在其碩士論文中初步開展了微囊藻毒素對鴨的急性和亞慢性毒性研究，張曉波等[13]研究了微囊藻毒素對鴨胚的毒性和半致死劑量，探討了微囊藻毒素對鴨各組織和胚胎的損傷。

本文采用腹腔注射的方式研究了MC-LR對崇仁麻雞肝臟氧化損傷的影響，為藍藻飼料化利用提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

試劑：MC-LR(純度≥95%，HPLC)購自ZEN-U Biotechnology公司(臺灣)，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)、考馬斯亮蘭總蛋白和標準蛋白試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

儀器：U-3900紫外-可見分光光度計(HITACHI公司，日本)；SH-1000酶標儀(CORONA公司，日本)，F6/10組織勻漿機(上海凈信實業發展有限公司，中國)；HH-4恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市宏華儀器廠，中國)；CR22N低溫冷凍高速離心機(HITACHI公司，日本)；-86 ℃ DW-HL218超低溫冰箱(中科美菱，中國)。

1.2 實驗動物

健康成年崇仁麻雞，由江西省農業科學院畜牧獸醫研究所提供，平均體重1.16 kg。

1.3 半致死劑量實驗

選取118日齡的健康崇仁麻雞(母雞)，隨機分成5組，每組6只。實驗前1天雞禁水禁食，實驗雞經腹腔注射給予MC-LR，注射劑量最高為LD100，最低劑量為LD0，中間從高到低設計3個劑量，使這5組相鄰2組劑量成等比。注射后觀察24 h內的死亡情況，并做實驗記錄。采用孫瑞元改進的蔻式法[14]計算微囊藻毒素對崇仁麻雞的LD50值。該方法要使每個劑量組的組間距成等比或劑量對數等差，每個劑量組動物數相等，中間劑量接近LD50劑量。計算公式如下：

LgLD50=Xm-i(∑p-0.5)

(1)

(2)

式中：Xm為最大劑量的對數值；i為相鄰兩劑量對數劑量之差；p為各劑量組死亡率；q為各劑量存活率，q=1-p；∑p為各劑量組死亡率之和；n為各組動物數；Sx50為lgLD50的標準誤。

1.4 腹腔注射毒性實驗

將124日齡的健康崇仁麻雞60只，平均體重為1.15 kg，平均分為4組，每組15只雞。實驗設置3個MC-LR染毒劑量組以及1個對照組，染毒劑量組分別為高劑量組、中計量組和低劑量組，每組一次性注射不同計量的MC-LR，注射劑量分別為5、10和20 μg·kg-1bw，注射體積為1 mL左右，對照組每只雞注射1 mL生理鹽水。注射劑量的選擇根據本實驗獲得的LD50值進行設定。實驗期間未發現雞的死亡。

1.5 雞組織取樣

雞經腹腔注射后，分別于1、3、12、24和48 h進行取樣。每個時間點從對照組和3個染毒組各取出3只雞，處死解剖取出肝臟，生理鹽水漂洗，除去血液，用濾紙擦干后，用錫箔紙包裹，再用紗布包裹后現場放入液氮中保存，24 h后放入-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍保存。

1.6 肝臟系數的測定

雞處死之后，將肝臟完整取出，生理鹽水漂洗，除去血液，用濾紙擦干后，立即于分析天平上稱量質量，計算臟器系數。

1.7 分析方法

按照不同酶試劑盒上的方法對肝臟組織進行勻漿以及處理，CAT、GST和GPX采用紫外-可見分光光度計進行測定，SOD和GSH采用酶標儀進行測定，并用考馬斯亮蘭總蛋白試劑盒和標準蛋白測定組織的蛋白質含量，測試方法為比色法。CAT、SOD、GPX和GST酶活性單位為U·mg-1prot，GSH的酶活性單位為μmol·g-1prot。

1.8 數據處理

使用SPSS13.0軟件對數據進行統計處理，采用LSD法對數據進行多重比較，并用字母標記法對各實驗組之間的顯著差異性進行標記。標記原則為：將要標記的全部數值按從大到小順序排列，然后在最大的數值上標上字母a，將該數值依次和其以下各數值相比，凡差異不顯著的都標字母a，直至某一個與之相差顯著的數值則標以字母b；再以該標有b的數值為標準，與上方各個比它大的數值相比，凡不顯著的也一律標以字母b；再以標有b的最大值為標準，與以下各未標記的數值相比，凡不顯著的繼續標以字母b，直至某一個與之相差顯著的數值則標以字母c；如此重復下去，直至最小的一個數值都標記字母為止。

2 結果(Results)

2.1 MC-LR對崇仁麻雞的半致死劑量(LD50)

對崇仁麻雞腹腔注射MC-LR 24 h內的觀察結果如表1所示。在腹腔注射劑量分別為13.33、20、30、45和67.5 μg·kg-1bw時，分別有0、1、2、4和6只雞死亡，死亡率分別為0.00%、0.17%、0.33%、0.67%和1.00%，按照式(1)和(2)計算得出MC-LR對崇仁麻雞的LD50及其95%置信限為34.67(33.51～35.83) μg·kg-1bw。

2.2 MC-LR對肝臟系數的影響

雞腹腔注射MC-LR之后，雞肝臟系數從12 h開始呈現一定程度的上升趨勢，但無統計學差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 MC-LR對雞肝臟系數的影響注：低、中和高劑量組中MC-LR劑量分別為5、10和20 μg·kg-1。下同。Fig. 1 Effect of MC-LR on liver weight index in chickenNote: The low, medium and high doses are 5, 10, and 20 μg·kg-1, respectively. The same below.

2.3 MC-LR對GSH含量的影響

不同注射劑量下雞肝中GSH的含量隨時間變化如圖2所示。3個染毒組雞肝中GSH含量呈現出先下降又恢復為正常值的趨勢。MC-LR注射后的前24 h內，3個染毒組雞肝中GSH含量顯著低于對照組(P<0.05)，在48 h時恢復到對照組水平(P>0.05)。3個染毒組雞肝中GSH含量呈現注射劑量越高，其含量越低的趨勢，但差異未達到統計學顯著水平(P>0.05)。

表1 對崇仁麻雞腹腔注射微囊藻毒素-LR(MC-LR)24 h內的觀察結果Table 1 Acute toxicity results of microcystin-LR (MC-LR) to Chongren Chicken (intraperitoneal 24 h)

圖2 不同MC-LR注射劑量下雞肝臟中谷胱甘肽(GSH)含量隨時間的變化Fig. 2 Dose- and time-dependent variation of glutathione (GSH) contents in liver of chicken after exposure to different doses of MC-LR

2.4 MC-LR對GST活性的影響

雞注射MC-LR后，雞肝中GST酶活性呈現先上升后又恢復至正常值的趨勢(圖3)。雞注射MC-LR后1 h時，與對照組相比，3個染毒組GST酶活性沒有顯著變化(P>0.05)；染毒后3～12 h，雞肝中GST酶活性逐步升高，3個劑量組GST酶活性顯著高于對照組，并呈現一定的劑量效應，即染毒劑量越高，GST酶活性越高的趨勢，但是僅12 h時，高劑量組的GST酶活性顯著高于其他染毒劑量組，至48 h時，3個染毒組的GST酶活性恢復至正常水平(圖3)。

圖3 不同MC-LR注射劑量下雞肝臟中谷胱甘肽S-轉移酶(GST)酶活性隨時間的變化Fig. 3 Dose- and time-dependent variation of glutathione S-transferase (GST) activities in liver of chicken after exposure to different doses of MC-LR

2.5 MC-LR對GPX活性的影響

不同注射劑量下雞肝中GPX酶的活性隨時間變化如圖4所示。雞肝中GPX酶活性整體呈現先保持不變、后顯著上升的趨勢。MC-LR注射后1 h時，高劑量組雞肝中GPX酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，其他2個劑量組GPX酶活性與對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)，3 h時3個染毒組與對照組之間沒有顯著性差異(P>0.05)；12～48 h時，3個染毒劑量組(除12 h低劑量組和24 h的高劑量組外)GPX酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)；在12 h和48 h時，呈現低劑量組GPX酶活性顯著低于中劑量和高劑量的趨勢(P<0.05)。

圖4 不同MC-LR注射劑量下雞肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)酶活性隨時間的變化Fig. 4 Dose- and time-dependent variation of glutathione peroxide (GPX) activities in liver of chicken after exposure to different doses of MC-LR

2.6 MC-LR對SOD活性的影響

雞注射MC-LR后，SOD酶在整個實驗期間幾乎保持穩定，各染毒組與對照組之間沒有明顯差異(P>0.05)(圖5)。

圖5 不同MC-LR注射劑量下雞肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)酶活性隨時間的變化Fig. 5 Dose- and time-dependent variation of superoxide dismutase (SOD) activities in liver of chicken after exposure to different doses of MC-LR

2.7 MC-LR對CAT活性的影響

不同注射劑量下雞肝中CAT酶活性隨時間變化如圖6所示。雞注射MC-LR 1 h時，與對照組相比，3個染毒組雞肝中CAT酶活性呈現顯著下降趨勢(P<0.05)，且酶的活性降低具有劑量效應，高劑量組顯著高于中劑量組和低劑量組(P<0.05)；在3～24 h時，3個染毒組雞肝中CAT酶活性有較小的上升趨勢，但是與對照組之間無顯著性差異，48 h時基本上恢復至正常值水平。

圖6 不同MC-LR注射劑量下雞肝臟中過氧化氫酶(CAT)酶活性隨時間的變化Fig. 6 Dose- and time-dependent variation of catalase (CAT) activities in liver of chicken after exposure to different doses of MC-LR

3 討論(Discussion)

3.1 MC-LR對雞肝臟系數的影響

臟器系數變化是毒理學實驗中較為敏感的指標[15]，可較好地反映毒物對臟器的毒性綜合情況，可旁證病理組織學改變的可能性，也是探索毒物作用靶器官的重要線索。在本研究中，染毒組的雞肝臟系數從12 h后呈現不同程度的上升趨勢；實驗過程中對雞肝進行表觀觀察，結果發現，雞肝在1 h時，僅有少量血點出現，從3 h開始，高劑量組肝臟出現局部充血現象，12 h和24 h時，3個染毒組雞肝具有局部充血現象，48 h時充血范圍有減少的趨勢。這說明，MC-LR注射后導致了雞肝充血，從而使肝臟重量增加。這一結果與李哲等[16]及楊黎江等[17]對大鼠和王春雨[12]對鴨的研究結果一致。

3.2 MC-LR對雞肝抗氧化酶系統的影響

已有的研究證實，微囊藻毒素能誘導細胞或組織產生氧化脅迫，并進一步造成各種損傷和危害，氧化脅迫可能是微囊藻毒素的一個毒性作用機制[17-19]。為抵抗氧化損傷，機體內有一個抗氧化系統，這個系統會利用酶或非酶機制來對抗氧化壓力。這個抗氧化系統的酶主要有SOD酶、CAT酶、GPX酶和谷胱甘肽還原酶(GR)等，而非酶物質主要包括維生素E、維生素A和GSH等[19-22]。

抗氧化酶系統發生作用首先是引起谷胱甘肽系統的反應，GSH在氧自由基(ROS)的清除以及微囊藻毒素的解毒過程中均起著非常重要的作用[23]，MC在GST酶的催化下，與GSH的結合形成極性較強的結合產物(MC-GSH)而被排出，從而達到解毒的目的，這被認為是微囊藻毒素在動物體內解毒的第一步[24-26]。在本研究中，雞肝中GSH含量呈現先下降而后上升恢復至正常水平的趨勢，GST酶活力表現為先上升而后下降至正常值的趨勢。這說明GSH和GST參與雞肝中MC-LR的解毒。在小龍蝦[19]和魚類[27-28]肝臟的研究中也得出了類似的結論。在本研究中，雞肝中GSH在前24小時的下降可能是由于其在與MC的結合或清除ROS過程中被消耗掉了，其合成速度難以滿足消耗速度，在48 h時恢復至正常水平可能是由于MC和ROS已基本被清除而不再消耗GSH；同樣地，GST酶活力從3 h開始顯著升高可能主要是為了應對GSH參與解毒的需求所致。

大量的研究已經證實，SOD、CAT和GPX等酶在機體清除過量ROS過程中起著非常重要的作用[21-22]，但是，由于不同生物體、不同MC種類、不同劑量以及不同的處理時間，抗氧化酶活性的變化可能存在差異，其變化曲線可能是多階段的[29-35]。譬如，李效宇等[32]的研究結果顯示，MC-LR處理培養的鯉魚肝細胞后，CAT和SOD酶的活性隨著處理時間的延長而逐漸升高；環紋蜆(Corbiculaleana)暴露于有毒藍藻中，其腮和外套膜中SOD和CAT酶活性顯著上升[20]；羅非魚腹腔注射MC-LR后，肝臟中SOD酶表現為在36 h突然上升后恢復的趨勢，而CAT酶活性在24 h和84 h有2個高峰[33]；鳙魚腹腔注射藍藻粗提物后，其肝臟中SOD和CAT酶均呈現先上升后下降的趨勢[34]；淡水河蚌(Dreissenapolymorpha)經MC-LR染毒后，大部分組織中SOD酶活力在24 h時呈現上升趨勢，而CAT酶活性基本沒變化[35]。在本研究中，經MC-LR染毒的雞肝中CAT酶活力表現為先顯著下降而后快速上升至正常值的趨勢，3 h后，毒素處理組中CAT酶活力略微高于對照組，但無統計學差異；SOD酶在整個實驗期間幾乎保持穩定。CAT酶活力的下降可能是其酶活力受到抑制所致，而SOD酶活力未出現顯著改變可能是與其酶活性較高所致。本研究中，對照組雞肝中SOD酶活力為(1 011.1±83.25) U·mg-1prot，均高于已有的研究報道中的水平。譬如，對照組羅非魚和小龍蝦肝臟中SOD酶活力水平不到100 U·mg-1prot[19,33]，淡水螺(Radixswinhoei)肝臟中SOD酶活力在450 U·mg-1prot左右[36]，表明雞肝中SOD酶參與ROS的清除并不會引起SOD酶活力的大幅波動。

GPX酶是抗氧化酶系統的重要組成，其在GSH的參與下消除機體內過量的ROS[37]。在本研究中，GPX在1 h時，只有高劑量組雞肝中GPX酶活力顯著高于對照組，3 h時，3個染毒組GPX酶活力出現較小的下降、而后顯著上升的趨勢。這說明雞肝出現了氧化應激現象，GPX和GSH共同參與了雞肝中過量ROS的清除，可以作為監測MC-LR引起雞毒性作用的生物標志物。