蟬花提取物促進釀酒酵母壽命延長的機制研究

楊 力, 閆孟利, 劉 科

(四川大學生命科學學院 生物資源與生物環境重點實驗室, 成都 610065)

1 引 言

活性氧(ROS)在細胞呼吸過程中被認為是分子氧的代謝物， 由于其不成對的電子而具有很強的反應活性[1-2].活性氧參與許多重要的細胞活動， 包括基因轉錄， 信號轉導和免疫應答[3].低水平的ROS可能對機體產生有益作用， 但其過量產生涉及到各種慢性疾病和退行性疾病的發展， 例如癌癥， 呼吸系統疾病， 神經退行性疾病和消化系統疾病[4-5].在生理條件下， ROS的濃度受到抗氧化劑的微妙調節.通過補充抗氧化劑能夠減少內源性抗氧化劑消耗， 從而在一些臨床研究中減輕相關的氧化損傷[6].天然抗氧化劑具有清除ROS功能， 對腫瘤、心腦血管疾病、神經退行性疾病等都有明顯的防治作用[7-8].

該文選取了我國傳統的中草藥蟬花， 探究其作為一種天然抗氧化劑的潛力， 研究蟬花提取物(CCE)在促進釀酒酵母的氧化脅迫應答， 抑制H2O2誘導的細胞衰老中的作用[9]， 研究發現CCE能夠通過誘導抗氧化防御基因SOD2、CTT1的轉錄， 增強釀酒酵母的抗氧脅迫能力， 降低胞內活性氧的水平， 從而延長釀酒酵母的時序性壽命.該研究對以蟬花為代表的我國傳統中藥的開發和應用具有參考意義.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 試劑 野生型釀酒酵母BY4742 (本實驗室提供)， 蟬花干粉(浙江泛亞生物醫藥股份有限公司)， 氨基酸(Biotopped)， 無水葡萄糖(成都科龍試劑)， YNB(BD公司， 291930)， 酵母提取物(OXODID)， 胰蛋白胨(Solarbio)， 瓊脂粉(Biofroxx)， DCFH-DA(Sigma公司)， RNA 提取試劑盒(TIANGEN)、逆轉錄試劑盒(碧云天生物公司)， 實時熒光定量試劑盒 (碧云天生物公司).

2.1.2 主要儀器和設備 氣浴恒溫振蕩器(鴻科儀器)， SW-CJ-1C超凈工作臺(中國蘇州安泰)， 一次性0.22 μM除菌濾器(Millipore 公司)， 倒置熒光顯微鏡(Leica DMi8)， CFX manager real-time PCR系統(美國 Bio-Rad)， 超純水處理系統(美國 Millipore 公司)， pH計(中國上海康儀)， 立式壓力蒸汽滅菌鍋(中國上海申安醫療).

2.2 實驗方法

2.2.1 蟬花提取物的制備 將2 g蟬花干粉， 20 mL 95% 乙醇放入帶磨口塞的50 mL錐形瓶中(蓋上塞子)， 混勻， 于30 ℃ 200 r/min振蕩48 h， 過濾后收集濾液.40 ℃ 旋轉蒸發濾液， 得到淡黃色粉末狀的CCE.將CCE溶于無水乙醇， 配成50 mg/mL CCE醇溶液置于4 ℃ 冰箱備用[8].

2.2.2 酵母細胞的培養 將野生型釀酒酵母BY4742于YPD固體培養基活化， 挑取單菌落接種于SDC-2% Glucose液體培養基， 30 ℃、200 r/min恒溫培養.

2.2.3 釀酒酵母時序性壽命(CLS)的測定 將活化的酵母細胞接種到20 mL SDC液體培養基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE 處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL 的CCE.30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養.每個樣品3個平行樣， 培養至飽和后， 取菌液稀釋10萬倍.取適量菌液均勻涂布于YPD固體培養基， 倒置于30 ℃ 培養箱生長2～3 d， 統計YPD固體培養基上的菌落數(A).之后每隔1天重復以上步驟， 依次獲得菌落數(B、C...).A/A、B/A、C/A...則表示存活菌落所占的比例， 以存活菌落所占比例為縱坐標、時間為橫坐標所繪制的曲線代表釀酒酵母的時序性壽命.

2.2.4 釀酒酵母抗氧化脅迫能力的測定 將活化的酵母細胞接種到10 mL SDC液體培養基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE 處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL的CCE.30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養24 h.然后取2 mL， 波長600 nm處吸光度為0.5的酵母細胞于離心管中， 離心后棄掉培養基.加入995 μL新鮮的SDC液體培養基， 混勻.向H2O2處理組中加入5 μL 10 mol/L H2O2， 分別處理30 min和60 min后逐級稀釋10倍， 稀釋4次.然后按濃度由低到高， 從右往左依次點樣于YPD固體培養基上， 最后將培養基倒置于30 ℃ 培養箱生長2～3 d.

2.2.5 釀酒酵母細胞內 ROS 水平的測定 將活化的酵母細胞接種到20 mL SDC液體培養基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL的CCE.30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養24 h.然后取2 mL， 波長600 nm處吸光度為0.5的酵母細胞于EP管中， 離心后棄掉培養基.每個樣品中加入含有10 μmol/L DCFH-DA探針的PBS緩沖液1 mL， 于30 ℃ 避光孵育.1 h后棄去探針孵育液， 用PBS緩沖液洗滌兩遍.然后向H2O2處理組中加入2 mmol/L H2O2， 其余實驗組中加入等體積的PBS緩沖液作為對照， 孵育1 h.然后在熒光顯微鏡下觀察ROS的變化(激發波長為488 nm， 發射波長為525 nm).做三組獨立重復實驗.

2.2.6 實時熒光定量PCR檢測CAT、SOD1、SOD2、GPX2 基因表達 將活化的酵母細胞接種到10 mL SDC液體培養基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL的CCE.于30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養24 h后用RNA提取試劑盒提取總RNA， 然后用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA， 再用實時熒光定量試劑盒分別檢測基因SOD2、CTT1、GPX2的表達量.其中， β-actin基因的上游引物為5′-CGTTCCAATTTACGCTGGTT-3′， 下游引物為5′-AGCGGTTTGCATTT- CTTGTT-3′；SOD2基因的上游引物為 5′-TTTGGCAAAGGCAATCGACG-3′， 下游引物為 5′-CGCCTGCTAGCTTTGTGTTG-3′；GPX2基因的上游引物為5′-TAATGTTGCCTCCAAGTGCG-3′， 下游引物為 5′-GGTTCCTGCTTCCCGA ACTG-3′；CTT1基因的上游引物為 5′-AGAAAGAGTTCCGGAGCGTG-3′， 下游引物為 5′-ACATTCTGGTATGGAGCGGC-3′.采用20 μL反應體系， 反應條件為95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s， 75 ℃ 1 min， 總共進行40個循環反應， 采用2-△△Ct計算基因表達的相對變化， 以β-actin作為內參進行歸一化處理.做三組獨立重復實驗.

3 實驗結果

3.1 CCE延長釀酒酵母壽命

通過對比加藥處理組與不加藥對照組的時序性壽命， 發現分別加入0.050 mg/mL CCE和0.100 mg/mL CCE都會對酵母的時序性壽命產生有益的影響， 其延長作用隨著CCE濃度的增加而增強， 結果如圖1所示.

圖1 CCE 延長釀酒酵母壽命Fig.1 CCE extends the lifespan of Saccharomyces Cerevisiae

3.2 CCE 增強釀酒酵母的抗氧化脅迫能力

通過對比加藥處理組與不加藥對照組對H2O2引起的氧化脅迫抵抗能力， 發現當加入H2O2后反應30 min， 其抗氧化脅迫能力增強的不明顯；當加入H2O2后反應60 min， 其加藥組0.050 mg/mL CCE和0.100 mg/mL CCE 都能一定程度的增強釀酒酵母的抗氧化脅迫能力， 并且其增強效果隨著CCE濃度的增加而增強， 結果見圖2.

圖2 CCE 增強釀酒酵母的抗氧化脅迫能力Fig.2 CCE enhances the anti-oxidant capacity of Saccharomyces Cerevisiae

3.3 CCE 抑制H2O2誘導的ROS產生

使用DCFH-DA熒光探針檢測細胞內的ROS， 其原理是DCFH-DA進入細胞后經過酶切反應生成DCFH， DCFH能與ROS反應生成發綠色熒光的DCF， 其熒光強度與ROS的含量成正比.實驗結果表明， 加入0.100 mg/mL CCE處理組中的細胞內ROS含量弱于不加藥對照組(Control)細胞， Control+H2O2組細胞內的ROS含量對比Control組細胞顯著增加；雖然CCE + H2O2組細胞內的ROS含量也比CCE組細胞高, 但卻遠遠低于Control+H2O2組細胞內的ROS含量， 如圖3所示.證明CCE可明顯抑制釀酒酵母中由H2O2誘導的ROS產生.

3.4 CCE 對 SOD2 、GPX2和 CTT1基因表達的影響

SOD2、GPX2和CTT1基因的相對表達量如圖4所示， 0.100 mg/mL CCE處理組中SOD2和CTT1的mRNA 水平都上調了3倍左右， 可知CCE可以明顯提高釀酒酵母SOD2和CTT1基因在mRNA水平的表達；而CCE對GPX2基因在mRNA水平的表達沒有明顯影響.證明CCE的抗氧化活性主要是通過上調SOD2和CTT1的表達所致.

圖3 CCE 抑制 H2O2 誘導的 ROS 產生

酵母細胞經0.100 mg/mL的CCE處理24 h， 之后孵育DCFH-DA探針1 h， PBS 洗滌兩遍之后， 加入2 mmol/L H2O2處理1 h， 在熒光顯微鏡下觀察ROS水平

Fig.3 CCE inhibits H2O2-induced ROS production

Yeastcells were pre-treated with CCE at 0.100 mg/mL for 24 h,and then were stained using DCFH-DA for 1 h, washed twice with PBS. Yeast cells were treated with 2 mmol/L H2O2for 1 h, and the ROS level were detected under a fluorescence microscope.

4 討 論

很多研究表明衰老是源自于氧化脅迫所導致的有機體在氧化防御、免疫功能、代謝調控等方面所產生的損傷[10-12]， 固而增強生物體的抗氧化能力是抵抗衰老的一種有效手段.蟬花作為一種在我國已經有上千年藥用歷史的傳統中藥， 具有增強人體抗氧化的能力， 但其有效活性成分一直不甚明確， 因此將蟬花活性成分進行萃取， 進而檢測它們對細胞的作用效果是一種行之有效的方法.本文從抗氧化脅迫的角度出發， 以釀酒酵母為研究模型， 檢測CCE對酵母細胞氧化脅迫應答的影響.結果顯示， CCE處理能夠延長釀酒酵母的時序性壽命.進一步研究發現， CCE處理能夠增強釀酒酵母的抗氧化脅迫能力并且其增強效果隨著 CCE濃度的增加而增強， CCE處理還顯著的降低了由H2O2誘導的細胞內ROS的上升；通過對細胞內具有抗氧化能力的一些基因SOD2、CTT1、GPX2的表達進行檢測發現， CCE能夠顯著地促進CTT1和SOD2基因在mRNA水平的表達.最后我們得出結論：蟬花提取物(CCE)能夠通過誘導抗氧化防御基因CTT1和SOD2的表達， 增強釀酒酵母的抗氧化脅迫能力， 降低胞內活性氧的水平， 延長釀酒酵母的時序性壽命.