無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍研究進展

王佳慧 綜述 陸金春 梁元姣 審校

東南大學醫學院/東南大學附屬中大醫院生殖醫學中心（江蘇南京 210037）

精子冷凍保存技術已經廣泛應用于人類輔助生殖。近十余年來，國內外學者開始探索無冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍，并獲得了一定的成功[1]。多項研究資料顯示[2]，使用無冷凍保護劑的玻璃化冷凍正常精液標本可取得與常規慢速冷凍相同的臨床效果。但在這些報道的無冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍研究中，實際上均存在一些非滲透性的冷凍保護劑，而所謂的無冷凍保護劑是指無滲透性冷凍保護劑。本文將對無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍的可行性、具體實施方法、面臨的問題及可能的應對策略進行綜述，以期為未來臨床常規開展無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍技術提供指導。

一、無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍的可行性

玻璃化冷凍是指細胞及其保護劑溶液在足夠高的降溫速率下，由液相直接轉變成玻璃狀的固體狀態，并以這種玻璃態在低溫下長期貯存的技術。在玻璃化的過程中，無冰晶形成，避免了冰晶對細胞的物理及化學損傷，有效保留了細胞的生物活性與基本功能，可獲得較傳統慢速冷凍方法更好的冷凍效果[3]。理論上，玻璃化冷凍相比于傳統的慢速冷凍方法，操作更為簡便、耗時更短、費用更低、凍融效果更好、精子存活率更高。然而，由于玻璃化冷凍一般使用了高濃度冷凍保護劑，包括滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑[4]，而滲透性冷凍保護劑具有很強的細胞毒性，同時人類精子對滲透性冷凍保護劑毒性又極其敏感，使得玻璃化冷凍融解后的精子存活率和活動率均顯著降低[5]。

滲透性冷凍保護劑也稱為膜內保護劑，常用的有甘油、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇、乙二醇等，均為小分子化合物。這類保護劑能夠自由通過細胞膜進入到細胞內，提高細胞內液體的粘滯系數和溶質濃度，從而抑制細胞內冰晶的產生，減輕冷凍及復溫過程中細胞皺縮和滲透性腫脹，但同時對細胞的結構和功能造成明顯損傷。甘油不僅會影響細胞微管和微絲的組成和功能，損傷精子細胞骨架，而且能使蛋白質變性、肌動蛋白相互作用及破壞精子線粒體及質膜完整性，甚至對受精后胚胎的發展產生不利影響，并且甘油量添加過高時，精子的頂體膜結構會受到損傷，導致解凍后精子的受精能力下降[6]；DMSO是一種含硫有機化合物，毒性較高，不僅會與蛋白質發生不可逆結合，而且易導致果糖-1，6-二磷酸酶的活性喪失[7]；乙二醇易致精子尾部畸形等[8]。此外，復溫時，精子對水的滲透性高于滲透性冷凍保護劑，在滲透性冷凍保護劑尚未完全滲出細胞外的情況下，大量水的進入可引起精子頂體過度膨脹、破裂，造成精子滲透性休克[9]。

那么，無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍是否可行？這是大家所關心的關鍵問題。精子是可以相對容易實現無滲透性冷凍保護劑的玻璃化冷凍的細胞，這是由其自身特點所決定的。與卵母細胞或胚胎相比，精子中的一些大分子結構如DNA、組蛋白、透明質酸酶的含量更高，可達胚胎的6-8倍[10]，且含水量較低，這就大大提高了精子內胞質液體粘滯系數，同時精子的頭部相對較小，冷凍穩定性好，使得在無滲透性冷凍保護劑，但降溫速率足夠高的情況下，精子形成玻璃樣固體狀態成為可能。有間接證據表明[11]，精子細胞內成分可以起到天然冷凍保護劑的作用，所有物種中滲透性最弱的小鼠精子可以在僅有非滲透性冷凍保護劑而沒有滲透性冷凍保護劑的情況下成功冷凍。另一方面，冷凍過程中的降溫速率與細胞內冰晶形成直接相關。如果降溫速率極快，精子可迅速達到一種介于液態與固態之間、非晶體、透明的玻璃態，這不僅可保留細胞內外正常的離子分布，而且可避免冰晶形成對精子細胞膜和細胞骨架的物理損傷。研究顯示[12]，玻璃化冷凍過程中，冷凍速度越快，實現玻璃化冷凍所需要的滲透性冷凍保護劑的濃度越低。因此，當精子冷凍速度達到一定程度時，無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍就可實現。

據此可知，要實現無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍，精子細胞內較高的液體粘滯系數是基礎，而更高的降溫速率是保證。

二、無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍的具體實施方法

要成功實施無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍，降溫速率要足夠快，且要保證所有精子均快速進入玻璃態，最好的方法就是：1.改變冷凍方式，采用快速降溫程序；2.改變冷凍載體，使液體樣本體積更小，而液體表面積/體積比更大；3.在冷凍保護液中添加合適的組分，以更好地保護精子免受損傷。

（一）冷凍方式的改變

目前精子玻璃化冷凍方式主要有，直接將精子樣本投入液氮中和經液氮熏蒸后再投入液氮中。丁露等[13]使用改良麥管法和凍存管法比較了液氮熏蒸和不經液氮熏蒸的精子玻璃化冷凍復蘇效果，發現前者的精子復蘇率和活動率顯著高于后者(P<0.05)。這可能與精子樣本直接投入液氮時，液氮被加熱引起沸騰產生氮氣有關，因為此時產生的氮蒸汽將圍繞精子細胞形成一層蒸汽薄膜將精子與液氮隔離,從而減慢了溫度的傳遞速度,降低了冷凍速率。而經液氮熏蒸后，精子樣本已被大大降溫，再浸入液氮時可避免液氮沸騰，從而避免蒸汽薄膜在精子細胞表面形成。理論上,要獲得更高的冷凍速率最好是經液體導熱而不是蒸汽,液體的熱傳導要比蒸汽快得多。

（二）冷凍載體的選擇

降低液體樣本體積和增大表面積/體積比，主要通過冷凍載體來實現。理論上，只要我們能找到承載樣本量最少、表面積與體積比最大的載體，就可以通過超快的冷卻速率實現無冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍。根據精子是否與液氮直接接觸，冷凍載體可分為開放性載體和封閉性載體。目前報道的開放性載體主要有冷凍環、冷凍薄膜、微滴載體等，而封閉性載體主要有封閉式薄片、一些新發明的載體等。就冷凍效果而言，開放性載體的降溫效果更好，但會存在污染風險。如果確保液氮內或冷凍容器表面無菌，可選用開放性載體。

運用冷凍環和冷凍薄膜的表面張力，可將精子附著在環或膜的表面。將其直接投入到液氮中時，可使降溫速率從傳統麥管的2500℃/min提高到20000℃/min，易于實現玻璃化。研究發現[14]，采用冷凍環進行無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍，在降低冷凍損傷和縮短耗時方面有著常規慢速冷凍法難以實現的優點，且復溫后精子染色質的凝聚和DNA完整性與新鮮精子相當。微滴載體冷凍精子樣本的體積稍大于冷凍環，研究表明[15]，微滴法可以替代常規慢速冷凍管法冷凍附睪微量精子，在沒有明顯增加精子核DNA損傷的同時能回收較多可利用的精子。

馬超等[16]采用封閉式薄片為載體，發現有、無滲透性冷凍保護劑玻璃化冷凍的人類精子解凍后，精子回收率、活動率及存活率均無統計學差異，從而證實添加滲透性冷凍保護劑并不能改變解凍后的精子相關指標。羅樹偉等[17]通過對普通胚胎冷凍麥管進行改造（下端3cm區域采用細砂紙將外側面打磨粗糙，并將麥管打磨區域沿麥管軸線剪一1/8圓周的細縫，然后選擇大小合適的輸液針套將麥管打磨區域套住）后，制備了一種新型無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍載體。與開放性精子載體相比，冷凍前后精子存活率及活力無明顯差異，但液體承載量明顯增加 （從1μl增加至5μl）。 另外，空透明帶、電鏡銅網(EMG)、微麥管、ICSI針、極體活檢針、Cryoleaf、Cell Sleeper、Cryopiece 等，理論上也可進行無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍，但相關報道較少。

（三）冷凍稀釋液的改善

為了進一步提高冷凍復蘇后的精子質量，盡可能保護精子避免冷凍損傷，許多研究者嘗試在精子冷凍稀釋液中添加一些組分，其中以抗氧化劑、避免精子膜損傷的物質最常見。通過在冷凍稀釋液中添加某些組分以改善冷凍復蘇后精子活動率、保護精子正常受精率是目前精子冷凍保存的研究熱點之一。

除了在冷凍稀釋液中添加一般的非滲透性冷凍保護劑如卵黃、白蛋白、蔗糖或海藻糖等外，海帶多糖、枸杞多糖、紅景天多糖、益母草多糖、絞股藍多糖、丹參多糖等亦被報道[18-19]，這些多糖除了可增加精子活動率和存活率外，亦可保護精子質膜完整性、線粒體活性、頂體完整性，并提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶等抗氧化酶活性，從而抑制活性氧的產生。另外，由于多糖類有一定的粘性，能夠粘附于精子外圍，在冷凍過程中亦可減少因冰晶產生而對精子細胞造成的破壞。

除此之外，目前已報道的冷凍稀釋液中添加的組分還有：1.抗氧化劑類，可分為非酶類抗氧化劑和酶類抗氧化劑，前者包括維生素C、維生素E、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、谷氨酰胺、肉堿、麥角硫因、牛磺酸、亞牛磺酸、亞油酸、褪黑素、丙酮酸、二硫赤鮮醇、鋅、硒、白藜蘆醇、蘋果多酚、葡萄籽原花青素、番茄紅素、線粒體靶向肽Elamipretie等物質[20-25]；后者包括過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、輔酶Q10及其衍生物等[26-28]。以前者研究較多，這些抗氧化劑一般可提高精子活動率、存活率、頂體完整性、質膜完整性、線粒體活性、SOD及谷胱甘肽過氧化物酶活性等，降低精子畸形率、DNA損傷和丙二醛（MDA）水平。2.黃嘌呤衍生物：包括咖啡因、己酮可可堿、可可堿等，它們可增加細胞內cAMP濃度,從而增強精子的活動能力，促進精子獲能和頂體反應等。但有研究發現[29]，精子長時間接觸咖啡因或己酮可可堿后，形態和膜完整性受到損害，可能會由于能量耗盡而影響生育潛力。3.三磷酸腺苷(ATP)：其不僅能提高精子活力，也可增強精子頂體反應，從而提高卵子受精力[30]。4.血小板活化因子（PAF）：其與精子表面的受體結合后可誘導三磷酸肌醇形成，進而上調細胞內鈣濃度。已有研究證實[31]，PAF可通過影響精子的運動能力、獲能和頂體反應來影響精子生育能力。5.自體精漿：如果通過梯度離心法等去除精漿中部分有害物質如活性氧、白細胞等，而保留有利于精子的成分，自體精漿可能有助于提高精子質量和活動精子回收率[32]。6.抗凍蛋白Ⅲ（AFPⅢ）：可通過降低冰點來抑制冰晶的形成。Saeed等研究發現[33]，在人精子冷凍培養液中添加1μg/ml AFPⅢ（最佳劑量）可以提高精子冷凍后的活動率、前向運動精子百分率、存活率和質膜完整性。7.其他：包括脂肪源性間充質干細胞（Ad-MSCs）[34]、L-肉堿[35]、二甲雙胍[36]等。

三、無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍所面臨的問題及可能的應對策略

盡管目前已有報道[37]，使用無滲透性冷凍保護劑進行玻璃化冷凍復蘇后的精子，通過卵細胞質內單精子注射（ICSI）后成功獲得健康嬰兒，但這樣的報道畢竟是個案，且基本為稀少精子冷凍，其是否適合精子庫常規冷凍精液以及卵子和胚胎的冷凍，以及其操作的標準化、具體的保存機制及未來對嬰兒健康的影響如何，尚不清楚。目前，無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍仍面臨諸多問題。

一是術語的規范化。目前一些文獻報道中均是以“無冷凍保護劑（cryoprotectant-free）”來描述精子的玻璃化冷凍，可在實際冷凍時冷凍稀釋液中均存在一些非滲透性冷凍保護劑[38]，故標準術語應為“無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍”。

二是缺乏標準化的冷凍流程。目前文獻報道的玻璃化冷凍程序包括液氮熏蒸或直接投入液氮中，液氮熏蒸時距離液氮面的距離和熏蒸時間均有差異，而直接投入液氮時不同的冷凍載體，由于接觸液氮時產生的液氮蒸汽的影響不同，結果可能有很大差異。未來應對大家比較認可的冷凍程序，經過多中心研究后，建立標準化的冷凍流程。另外，不同類型冷凍載體的標準化冷凍流程亦應建立。

三是冷凍組分的添加應有大量實驗依據后方可應用于臨床。目前，關于添加組分的研究存在如下問題：1.同一組分在不同研究中有不同結論；2.一些研究是針對不同動物精子進行的，其是否適用于人類精子尚缺少依據；3.一些組分是在常規精子冷凍中進行的，其是否適合玻璃化冷凍亦需證實；4.一些添加組分并非人體或細胞內固有成分，其雖然能改善精子活力，但對精子代謝、未來受精卵及胚胎的發育是否有影響尚需驗證；5.文獻報道的如此多的組分，可否篩選出一個最優化的適合人類精子的組分組合，經多中心研究驗證后，以應用于臨床。

四、結語

理論上，卵母細胞、胚胎、睪丸及卵巢組織以及其它細胞組織也適合無滲透性冷凍保護劑的玻璃化冷凍，但相關研究極少。無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍技術雖有一些正常妊娠和分娩的案例，但要走向臨床常規使用仍需大量研究驗證。未來有關無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍的研究應集中在：1.探索無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍過程中的精子損傷機制；2.篩選并確定對精子功能有保護作用、對未來胚胎發育無害的非滲透性冷凍保護劑及添加組分，及其最佳劑量、組合及最佳添加時間；3.進一步優化和開發適合稀少精子冷凍和常規精液精子冷凍的載體，并將三維打印技術應用于冷凍載體的制備[39]。4.建立包括精液處理、冷凍、復蘇等全過程的標準化冷凍程序；5.開發新的可以提供極高降溫速率的自動化的冷凍設備，為實現大容量的無滲透性冷凍保護劑的玻璃化冷凍提供物質基礎。