特發性男性不育癥相關基因研究進展*

李中泰 綜述 李彥鋒 審校

1.陸軍特色醫學中心泌尿外科（重慶 400042）；2.聯勤保障部隊第990醫院泌尿外科（河南駐馬店 463000）

臨床上有30%-40%的男性不育癥病因不明，稱為特發性男性不育癥。盡管一般認為特發性不育癥可能由多種因素引起，包括活性氧（ROS）、未知的遺傳因素以及環境污染引起的內分泌紊亂等[1]，但由于74%的人類蛋白質（n=19692）在睪丸中存在表達，其中1980個基因在睪丸中的表達高于其他組織，而且對睪丸中高表達基因的分析表明，大多數相應蛋白與精子發生有關[2]，因此，在精子發生過程中這些基因中的任何突變都可能直接或間接導致生精異常，并導致男性不育。許多所謂“特發性”不育癥很可能就是某種相關基因突變所致。然而，至今人們對涉及男性不育的遺傳基因突變尚知之甚少。為此，本文根據患者的精液表現特征不同，將特發性不育癥主要分為三類表現類型：非梗阻性無精子癥，畸形精子癥，弱（伴畸形）精子癥。結合近年文獻，總結了目前為止已經較為明確的可導致上述三類表現的常見相關致病性基因突變。

一、非梗阻性無精子癥（NOA）相關基因

1.影響減數分裂相關基因

Tex11基因是第一個證實與無精子癥存在因果關系的突變基因[3,4]。Yatsenko等[4]對289例無精子癥患者和384例正常人的血液和精液標本進行了X染色體上Tex11基因的突變篩查，結果發現在7例無精子癥患者中存在突變，正常的對照組中沒有這種突變。而且，在33例診斷為減數分裂停滯的無精子癥患者（15%）中檢測到其中5個存在Tex11突變，這些患者的減數分裂停止與Tex11缺陷雄性小鼠的表型相似。免疫組化分析顯示，在正常人睪丸晚期精母細胞，圓形精子細胞和長形精子細胞胞漿中有Tex11蛋白特異性表達，而Tex11突變的無精子癥患者出現睪丸內減數分裂停滯和Tex11蛋白表達缺失。小鼠Tex11基因缺陷導致染色體不聯會和交叉形成減少，粗線期精母細胞在第一次減數分裂時染色體不能分離，導致細胞死亡和雄性不育。可見，Tex11的生理功能可能是在減數分裂中促進聯會的起始和/或維持以及交叉的形成。

Syce1基因編碼一種在減數分裂過程中起重要作用的聯會復合體蛋白。該蛋白是聯會復合體中心單元的組成部分。聯會復合體是一種蛋白質結構，它在物理上連接姐妹染色單體。電鏡顯示它是一個由中心單元和兩個側單元組成的拉鏈狀結構。小鼠Syce1基因破壞會導致其DNA修復不完全，聯會復合體和交叉的缺失。Syce1缺失小鼠表現為無精子癥，在偶線期表現出成熟停滯。對一個近親家庭中兩例患非梗阻性無精子癥兄弟的研究發現：兩例患者均為Syce1一個剪切位點的純合突變，患者睪丸免疫染色Syce1蛋白為陰性。組織學檢查顯示患者精母細胞未發育成熟，表現為成熟阻滯。可見，Syce1突變以常染色體隱性遺傳方式，成為導致男性NOA的病因[5,6]。

Tex15基因定位于8號染色體，為睪丸特異性表達。Tex15參與同源染色體的聯會和減數分裂同源重組。小鼠Tex15功能喪失可導致雄鼠減數分裂的早期停滯，同時完全缺乏粗線期精母細胞，具體表現為精母細胞染色體聯會失敗。在存在突變的精母細胞中，DNA雙鏈分裂(DSB)可以形成，但重組蛋白Rad51和Dmc1在減數分裂染色體上的定位嚴重受損。為此，有學者認為Tex15可以調控DNA修復蛋白(如Rad51和Dmc1)在DSB部位的裝載，其缺失則導致減數分裂重組失敗。一項對土耳其近親家庭中8個兄弟姐妹的研究發現，2個存在無精子癥，1個存在重度少精子癥，一個年齡最小的未成年弟弟生育能力尚不明確，他們4人均存在Tex15的一個無義突變，該突變可能導致其第一外顯子的翻譯過早終止，導致生精缺陷。所有受影響的兄弟都呈現出一種與Tex15基因敲除小鼠模型相似的表型，表現為睪丸體積的顯著減小和減數分裂的停止[7]。

Arafat等采用全基因組分型和外顯子組測序方法，在5例具有成熟阻滯的無精子癥近親家族成員中鑒定發現Tdrd9中存在一個4bp缺失移碼突變，該類患者的臨床表型與在Tdrd9基因敲除小鼠中觀察到的表型類似。該基因已證明參與長散布元素-1逆轉錄轉座子沉默[8]。現有研究結果提示Tdrd9蛋白在減數分裂過程中發揮極為重要的作用。

在大多數真核生物中，減數分裂同源重組由兩個重組酶系統介導：普遍存在的Rad51和減數分裂特異的Dmc1。在Rad51介導的同源重組系統中，Rad51和5個Rad51的旁系同源基因是正常Rad51功能所必需的，但Rad51蛋白在人類減數分裂中的作用尚不清楚。Yang等研究發現一個表現為減數分裂停滯和無精子癥的不育家庭，其在Rad51的一個旁系同源基因Xrcc2上發現1bp純合子替換（c.41T>c/p.Leu14Pro）。但在127例其他非梗阻性無精子癥患者中沒有發現任何Xrcc2隱性突變。通過制備Xrcc2-c.T41C/p.Leu14Pro基因突變小鼠模型，證實其雄性純合子表現為減數分裂停滯、無精子癥和不育[9]。

He等對中國近親家系兩例患者 （1例男性為NOA，1例女性為卵巢早衰）的DNA全外顯子序列研究發現在Dmc1中存在一個共同的新純合錯義突變(NM_007068.3:c.106G>A,p.Asp36Asn)。該錯義突變導致Dmc1的H3TH基序中保守的天冬氨酸殘基被天冬酰胺取代，這種替換導致蛋白質錯誤折疊。組織學分析顯示男性患者生精小管中缺乏精子。免疫組化顯示精子發生在減數分裂前期的偶線期受阻。系譜分析顯示該家系中Dmc1突變引起的NOA和卵巢早衰具有常染色體隱性遺傳模式[10]。

Khelifa等報告在一個近親家庭兩個兄弟中觀察到編碼減數分裂雙鏈斷裂形成蛋白1(Mei1)的基因純合子錯義突變，他們患有減數分裂停滯導致的非梗阻性無精子癥。而且，已有研究顯示在小鼠模型中，Mei1基因敲除與減數分裂停滯有關。因此該研究認為這兩兄弟的減數分裂停滯可能是由染色體聯會所必須的Mei1基因的改變所引起[11]。

Gershoni等對3個家系的患病和未患病兄弟進行全外顯子組或全基因組測序，進行生物信息學分析發現了三個新的可能導致無精子癥的突變基因：Meiob、Tex14和Dnah6。這些基因分別與不同的減數分裂過程有關：減數分裂交叉，子細胞脫落，染色體的快速前期運動[12]。

2.影響單倍體精細胞基因表達調節和細胞發育相關基因

Zmynd15基因（含mynd的鋅指蛋白15）在小鼠中只在單倍體精細胞中表達，并通過募集組蛋白脫乙酰酶(HDAC)而作為轉錄抑制因子發揮作用。Zmynd15基因缺陷小鼠顯示出晚期精子發生的中斷，單倍體細胞中基因表達的破壞，從而引起后期精細胞的耗竭，出現無精子癥，導致完全不育，這表明該蛋白產物是精子發生所必需的轉錄抑制因子。有研究發現在一個近親家庭的3個無精子癥兄弟中存在Zmynd15基因的純合突變[13]。

Tan等在無血緣關系的兩個近親家庭的多個同時具有NOA和先天性白內障的成員中，發現Tdrd7基因（表達一種含Tudor表位的RNA結合蛋白）兩個新突變，導致其功能喪失。組織學分析顯示：男性患者的生精小管內缺乏成熟精子。對Tdrd7基因相似位置進行破壞的小鼠模型精確復制了人類的上述表型。因而得出結論，Tdrd7基因是男性無精子癥致病基因，具有常染色體隱性遺傳方式[14]。已有研究表明：Tdrd7蛋白對于單倍體精子細胞的發育至關重要，并與Tdrd6蛋白一起確定染色質體（chromatoid bodies）的關鍵生物合成過程。

3.影響干細胞分化和增殖相關基因

Taf4b，又稱TAFII105（RNA聚合酶II），是一種TATA結合蛋白相關因子，是RNA聚合酶II基本轉錄機制中TFIID復合體的組成部分。對一個近親家庭中1個少精子癥和3個無精子癥兄弟的研究發現存在Taf4b基因的純合截短突變[13]。Taf4b缺失小鼠出現獨特的睪丸表型，包括早期生育能力正常，12周后完全喪失生育能力，表現為精子發生缺陷、生殖細胞喪失和睪丸退化。Taf4b是有絲分裂所必需的，特別是在性腺細胞和精原細胞中。成年男性生育能力的維持需要干細胞的增殖和分化，而Taf4b似乎為生殖細胞干細胞分化和增殖所必需。

4.影響雄激素受體功能相關基因

Ma等對776例確診為NOA的患者和709例明確為生育力正常的男性，通過外顯子測序鑒定了包括USP26在內的男性不育相關基因的遺傳變異。同時采用免疫沉淀法和熒光素酶法檢測了USP26基因突變對Hela細胞和TM4細胞雄激素受體結合、泛素化和轉錄活性的影響。結果發現USP26存在6個新的錯義突變和1個新的同義突變。在錯義突變中，USP26 R344W顯著降低了USP26與AR的結合親和力和去泛素化活性，從而消除了USP26對Hela和TM4細胞AR轉錄活性的抑制作用。其結論為USP26新的變異體p.R344W可能通過影響AR功能與NOA相關[15]。

5.影響DNA修復相關基因

Mcm8與Mcm9基因產物形成復合物。這兩個基因的缺失會影響配子發生和體細胞周期中同源重組介導的DNA修復。Mcm8缺失小鼠表現為不育，精母細胞在減數分裂前期I阻滯于偶線期。現有研究表明，Mcm8蛋白的功能與Tex15的功能類似，Mcm8-Mcm9復合物促進DNA損傷位點修復蛋白Rad51的招募，以促進同源重組[16]。已有研究證明Mcm8基因變異與女性絕經年齡顯著相關。一項對兩個近親家庭中女性表現為原發性閉經和男性表現為小睪丸和無精子癥的患者進行的基因篩查，顯示Mcm8基因存在兩個新的純合突變，突變導致所表達蛋白的截短或顯著縮短。定量分析顯示突變純合子中總Mcm8蛋白顯著減少，而雜合子中總Mcm8蛋白則中等減少。可見，Mcm8蛋白無論對男性還是女性的性腺發育和維持均至關重要[17]。

FANCM（Fanconi anemia complementation group M）正常定位于生精小管的支持細胞和生精細胞，并隨著生殖細胞的發育而表達增強。Kasak等在4個NOA和唯支持細胞綜合征（SCOS）患者中發現FANCM存在突變。FANCM等位基因突變導致其功能缺失的SCOS患者的支持細胞中未檢測到或僅檢測到該蛋白微弱表達。該項研究證明FANCM等位基因功能缺失突變可導致無精子癥[18]。鑒于FANCM是有絲分裂細胞DNA斷裂修復所必需的，而DNA斷裂修復是精子發生過程中染色質重塑的基礎，因此，FANCM在精子細胞DNA斷裂修復中可能是必需的。

6.影響減數分裂前期精母細胞成熟相關基因

Stx2(Syntaxin2)基因編碼一種硫基糖脂轉運體,也被稱為上皮生成素 （epimorphin），是SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor）蛋白家族中的成員，在各種類型的細胞中都有表達。STX2蛋白定位于粗線期晚期生殖細胞胞漿中，推測亞細胞定位在粗線期/二倍體精母細胞的高爾基體中，在硫基糖脂的轉運和/或亞細胞分布中發揮作用。Stx2缺失會導致小鼠生精障礙，表現為精原細胞在減數分裂前期的多核化和精子發生受阻，這表明該蛋白在膜功能和/或細胞間橋中發揮作用。日本一項針對131例非梗阻性無精子癥男性進行的研究，發現一例患者出現Stx2純合移碼突變。患者表現為無精子癥，睪丸相對較小，卵泡刺激素水平輕度升高，但無其他臨床特征。患者睪丸組織學顯示出現普遍性成熟阻滯和多核精母細胞。該結果表明，Stx2突變導致伴有多核精母細胞的成熟阻滯，并占非梗阻性無精子癥的一小部分[19]。

二、畸形精子癥相關基因

畸形精子癥是指精子樣本中超過96%的精子形態異常。主要存在四種典型的嚴重畸形精子癥類型：巨精子癥，圓頭精子癥，無頭精子綜合征及鞭毛多種形態異常（MMAF）。

1.巨精子癥相關基因

巨精子癥(Macrozoospermia)，也稱為大頭精子綜合征（macrocephalic sperm head syndrome），其特征是很高比例的精子具有增大和形狀不規則的頭部，并有多個鞭毛。這些精子顯示出很高的多倍體率，許多是四倍體。巨精子癥患者是由AURKC突變導致，AURKC是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Aurora亞家族的成員，是染色體乘客復合體 (chromosomal passenger complex，CPC)的組成部分。CPC是有絲分裂事件的關鍵調節因子，包括染色體分離和胞質分裂。它在著絲粒處具有確保染色體正確排列和分離的重要功能，是染色質誘導微管穩定和紡錘體組裝所必需的。AURKC蛋白的缺陷導致減數分裂受阻和染色體不平衡配子的產生[20]，導致多倍體率高，這是巨精子癥的典型特征。

2.圓頭精子癥相關基因

圓頭精子癥（Globozoospermia）的特征是在射精中存在大量缺少頂體的圓頭精子。這些精子細胞不能粘附和穿透透明帶，其形態單一，所有精子均表現出相同的異常。單一形態圓頭精子癥，約80%的患者是由單一基因突變所引起。研究顯示圓頭精子癥是由DPY19L2突變所致[21]。DPY19L2是內核膜的跨膜蛋白，是將頂體錨定于細胞核的必要物質。DPY19L2基因敲除小鼠模型顯示，形成的頂體在與細胞質一起從精子中完全分離出來之前，會緩慢地從細胞核中分離出來。此外，對一個血親家族的圓頭精子癥的研究發現在SPATA16基因中存在一個純合突變。SPATA16突變與DPY19L2突變相比較更加罕見，僅在兩個家族中發現[22]。SPATA16定位于高爾基體，在圓形精子細胞和長形精子細胞階段參與前頂體顆粒向頂體的運輸，因此，在精子形成過程中對于頂體的形成起著至關重要的作用。

3.無頭精子綜合征相關基因

無頭精子綜合征（Acephalic spermatozoa syndrome）主要特征為精液中以無頭的精子占主導。因為發現近親婚配家系成員中存在多人發病，高度提示其為常染色體隱性遺傳疾病。 在小鼠中，Prss21、oaz3、Cntrob、Ift88、Odf1和Spata6等基因的功能異常所引起的無頭精子綜合征導致雄性不育。然而，這些基因的任何變異體都沒有在人類中被證實。目前，人類已鑒定出數量有限的無頭精子相關基因。Zhu等在17例男性不育患者中發現有8例患者存在Sun5基因突變，其中5例為復合雜合突變，3例為純合突變。Sun5表達一種睪丸特異性核膜蛋白，在圓形精子細胞階段定位于朝向頸段的精子核膜，在精子形成過程中表達于精子頭尾交界處，在核外膜與中心體的連接中起著關鍵作用。Sun5基因缺陷導致無法形成精子的植入凹和基板，從而導致無頭精子的形成。因為Sun5純合突變或復合雜合突變才能導致無頭精子癥，因此，符合常染色體隱性遺傳的單基因遺傳病特征[23]。Sun5基因敲除小鼠模型的精子多數表現為無頭精子，且雄鼠表現為不育[24]。PMFBP1突變可破壞精子頭部與尾部之間的聯系，導致人和小鼠無頭精子和雄性不育[25]。最近，Sha等通過對兩例無頭精子表型的不育患者進行全外顯子序列分析，發現一例為CEP112基因第5外顯子純合突變，另一例為CEP112基因第20外顯子雙等位基因突變，所有突變都影響CEP112的coiled-coil結構域，這可能會影響該蛋白的功能。因而推測CEP112功能缺失突變可能是人類無頭精子綜合征的病因[26]。此外，人HOOK1、TSGA10和BRDT基因突變也可能參與無頭精子的形成過程。

4.鞭毛多種形態異常

Ben Khelifa等首先描述了該種畸形精子癥的異質性表型特征，稱為“鞭毛多種形態異常（Multiple morphological abnormalities of the flagella，MMAF）”。 該表型包括無鞭毛，短鞭毛，彎曲和卷曲鞭毛，寬度不規則鞭毛[27]。MMAF表型不能用一個致病基因來解釋，其病因學更具異質性。近年來，對MMAF表型的基因組學研究已經鑒定出導致MMAF和不育的至少18個突變基因。所編碼蛋白定位于精子鞭毛軸絲和軸絲周圍結構[28,29]。目前，大部分“MMAF蛋白”的確切功能和分子機制尚不清楚。

三、弱（伴畸形）精子癥相關基因

通過基因分析，目前只有4個基因與弱精子癥有關:Catsper1、Catsper2、Sept12 和 Slc26a8。 而且，這類突變是很罕見的。

在三個無血緣關系的弱精子癥患者中發現了Slc26a8中存在三個雜合的錯義突變[30]。Slc26a8編碼睪丸陰離子轉運體1，一種定位于終環的精子特異性陰離子轉運體。終環是一種位于質膜下的環狀結構，連接哺乳動物精子鞭毛的中段和主段部分。Slc26a8缺失小鼠因其精子完全喪失運動能力和受精能力降低而不育。Slc26a8與囊性纖維化跨膜電導調節因子(CFTR)結合，并刺激其活性。CFTR和Slc26a8聯合調節正常的精子運動和獲能所需的陰離子流。此外，這種跨膜蛋白被認為發揮結構性作用，將終環的細胞質成分錨定在質膜上。

有研究顯示在兩名無血緣關系的畸弱精子癥患者中鑒定發現Sept12基因存在兩個雜合突變。Sept12編碼一種GTP結合蛋白Septin12。該蛋白是精子終環的SEPT環結構的一部分[31]。Sept12基因突變小鼠表現為Sept12纖維的形成遭到破壞，精子終環組織結構紊亂，尾部彎曲，運動能力降低和SEPT環結構喪失。對兩名無血緣關系的弱精子癥患者的體外研究表明，兩種突變蛋白均以劑量依賴的方式破壞野生型Sept12纖維的形成，從而發揮主要的負性蛋白作用。總之，上述發現表明，Sept12突變通過破壞終環Septin絲的形成而損害精子的結構完整性。

Catsper2突變或缺失已在四個無親緣關系的弱精癥家族成員中獲得鑒定。Catsper1突變只在一個血緣家族中被發現。Catsper是“陽離子通道精子相關蛋白”的縮寫，它是一種通道蛋白，特異性定位于精子鞭毛主段的質膜上，是精子超活化所必需的。它由四個獨立的、由Catsper 1-4基因編碼的造孔α亞基和另外三個由Catsperβ、Catsperγ 和 Catsperδ 編碼的輔助亞基組成。Catsper通道以cAMP和pH依賴性方式介導精子運動和超活化所必需的Ca2+內流。

四、小結

精子發生是一個極為復雜而微妙的過程。在這個過程中，精原細胞必須經過有絲分裂、減數分裂和精子形成過程，才能成為細長的精子。大量的證據表明，遺傳缺陷是導致精子發生異常和NOA的主要原因之一。近十余年來，在生殖生物學領域，為明確男性不育的遺傳病因已經進行了大量的研究工作。高通量測序技術的出現極大地促進了與男性不育相關基因的鑒定。通過對臨床上具有典型臨床表現的非梗阻性無精子癥，畸形精子癥，弱精子癥和正常精子性男性不育患者的相關基因篩查，目前已經鑒定了眾多與男性不育相關的基因。通過相對應的基因敲除小鼠的表型研究，進一步證實了相關基因突變與男性不育的因果關系，并提高了人們對精子形成和受精過程中相關重要結構及其功能的分子機制的認識。相信至今人們對導致男性不育相關基因的認識只是冰山一角，特發性男性不育癥的基因研究將為男性不育癥的準確遺傳診斷和個性化治療不斷提供新的理論和新的前景。