軍團(tuán)菌檢測(cè)的研究進(jìn)展

宋麗娜,令狐志宏,于珊珊

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.麻醉科，吉林 長(zhǎng)春130033)

軍團(tuán)菌感染可引起軍團(tuán)菌病，該病夏、秋季多發(fā)，潛伏期一般為2-10天，主要易感人群有吸煙者、HIV/AIDS導(dǎo)致的免疫缺陷者、移植等免疫力、慢性肺部疾病者、集中空調(diào)冷卻塔維護(hù)人員等[1]。軍團(tuán)菌肺炎是軍團(tuán)菌病的主要類型,不僅見于社區(qū)獲得性肺炎[2],也是醫(yī)院感染的重要病因之一,WHO已將其列入傳染病報(bào)告范圍。由于體征和癥狀是非特異性的，軍團(tuán)菌病可能難以診斷，因此快速實(shí)驗(yàn)室診斷至關(guān)重要[3]。近年來(lái),許多公共場(chǎng)所的水系統(tǒng)中軍團(tuán)菌的污染情況嚴(yán)重[4，5]，已經(jīng)成為現(xiàn)代化城市發(fā)展中所面臨的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。本文將對(duì)軍團(tuán)菌檢測(cè)的最新進(jìn)展做一綜述。

1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)方法。很多研究團(tuán)隊(duì)在傳統(tǒng)PCR法的基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)條件和體系優(yōu)化，建立了新的檢測(cè)體系，并取得了初步成果。牛莉婭[6]等人通過(guò)嗜肺軍團(tuán)菌種mip基因的保守序列和軍團(tuán)菌屬特異性23S rRNA基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，優(yōu)化熒光PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系后建立的PCR雙管檢測(cè)靈敏度達(dá)10標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)/反應(yīng),并可對(duì)嗜肺與非嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行鑒別。C.Ginevra[7]團(tuán)隊(duì)利用全基因組測(cè)序(WGS)數(shù)據(jù)，開發(fā)了一種通過(guò)lpp1868基因的擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)屬于ST1克隆復(fù)合體的Lp1的qPCR分析法，并用于呼吸道樣本中Lp的檢測(cè)，靈敏度和特異性均高于95%。他們通過(guò)ST1 PCR檢測(cè)將三分之二培養(yǎng)陰性的軍團(tuán)菌病病例篩查出來(lái)，具有較高的實(shí)用價(jià)值。于紀(jì)棉[8]等人建立了一種通過(guò)微滴發(fā)生器將樣本進(jìn)行微滴化處理，再進(jìn)行PCR反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR，dd PCR)，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，可有效的對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行鑒定。在對(duì)模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)dd PCR與 qPCR對(duì) DNA 模板的檢測(cè)限一致，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)，且可以對(duì)基因進(jìn)行絕對(duì)定量。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)稱LAMP，能在等溫(60-65℃)條件下，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，是一種簡(jiǎn)便、快速、精確、低價(jià)的基因擴(kuò)增方法。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，但不依賴任何專門的儀器設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，目前已廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)研究中。Moosavian Mojtaba[9]團(tuán)隊(duì)的研究通過(guò)培養(yǎng)、PCR和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)三種方法檢測(cè)住院呼吸道癥狀患者的呼吸道標(biāo)本中的嗜肺軍團(tuán)菌。結(jié)果顯示，與常規(guī)方法(如PCR和培養(yǎng))相比，LAMP測(cè)定法是一種更快的方法，具有更高的靈敏度和特異性，可用于實(shí)驗(yàn)室診斷軍團(tuán)菌病。

3 MALDI-TOF MS法

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，目前已應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等很多領(lǐng)域。Maria A.Kyritsi[10]等人通過(guò)對(duì)15個(gè)參考菌株和150個(gè) Lp的環(huán)境分離株進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，將獲得的原始光譜引入到Mass-Up軟件平臺(tái)中，以進(jìn)行血清標(biāo)志物篩查和致病性基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS對(duì)Lp血清群的確定和lvh和rtxA毒力基因的檢測(cè)顯示出良好的性能。若能對(duì)該方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并使用直接靶板蛋白譜分析代替蛋白質(zhì)提取的方法，將使該方法的檢測(cè)更為準(zhǔn)確、快速。

4 生物傳感器

生物傳感器是一種由生物敏感材料制成的識(shí)別元件(如探針)和物理化學(xué)檢測(cè)器組成的檢測(cè)裝置，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，操作簡(jiǎn)便廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域[11]。目前有許多研究聚焦于用生物傳感器檢測(cè)軍團(tuán)菌。M.Amirul Islam[12]等通過(guò)結(jié)合帶負(fù)電荷的十二烷基硫酸鈉(SDS)來(lái)提高檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的電荷感應(yīng)GaAs / AlGaAs納米異質(zhì)結(jié)構(gòu)生物傳感器的檢測(cè)限，發(fā)現(xiàn)該方法可使Lp的zeta電位增加兩倍，將這些細(xì)菌暴露于0.02 mg/ml的SDS溶液后，在pH 7.4處可測(cè)定嗜肺軍團(tuán)菌,從而建立了GaAs / AlGaAs納米異質(zhì)結(jié)構(gòu)生物傳感器進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)的方法。Ahlem Laribi[13]團(tuán)隊(duì)將自組裝的16-氨基-1-十六烷硫醇(16-AHT)單層共價(jià)連接到金基質(zhì)上，并將所得的修飾表面用于固定抗嗜肺軍團(tuán)菌單克隆抗體(mAb)，使用電化學(xué)測(cè)量和顯微成像技術(shù)建立了一種新型微流體分析法，對(duì)人造水樣品中的嗜肺軍團(tuán)菌sg1進(jìn)行連續(xù)和定量檢測(cè)的生物傳感靜態(tài)和動(dòng)態(tài)模式的線性響應(yīng)范圍和檢測(cè)極限進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)態(tài)條件下，低細(xì)菌濃度范圍為10至10 3 CFU / mL時(shí)，生物傳感器響應(yīng)呈現(xiàn)線性關(guān)系，與靜態(tài)條件下在靜態(tài)條件下獲得的傳感信號(hào)相比，傳感信號(hào)增強(qiáng)了4.5倍。Ahmad Mobed[14]團(tuán)隊(duì)將半胱胺(Cys A/AuNPs)支撐的金納米結(jié)構(gòu)被沉積在金電極的表面上，為有效固定ssDNA提供了較大的表面積，并確定了固定化pDNA的生物活性和穩(wěn)定性，以此設(shè)計(jì)出了一種新的基于DNA的生物傳感器來(lái)檢測(cè)軍團(tuán)菌，顯示出了良好的靈敏度，選擇性和穩(wěn)定性。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，在不久的將來(lái)基于核酸的生物測(cè)定可能會(huì)替代傳統(tǒng)方法進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上，許多學(xué)者已關(guān)注軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法的探索，很多前沿的技術(shù)也已逐漸應(yīng)用到軍團(tuán)菌檢測(cè)的研究中，建立軍團(tuán)菌快速檢測(cè)的方法并實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化將對(duì)軍團(tuán)菌病的防控有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。