血凝和血凝抑制試驗(yàn)影響因素及解決方法

胡秋霞

（長(zhǎng)葛市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 長(zhǎng)葛461500）

1 血凝試驗(yàn)中常見的問題

1.1 抗原的配制與標(biāo)定

如果用凍干血凝抗原做試驗(yàn)時(shí)，要按照瓶簽要求的量加入注射用水或滅菌用純化水（有時(shí)加入0.9%生理鹽水），搖勻靜置備用。在反應(yīng)板上同時(shí)做3份標(biāo)定抗原效價(jià)，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行操作，在倍比稀釋過程中避免產(chǎn)氣溶膠，最好是每孔稀釋次數(shù)一致，加入1%紅細(xì)胞懸液時(shí)，邊加邊搖勻，然后放到微量振蕩器上混合1 min，避免液體濺出。室溫20～25 ℃靜置20～30 min 或2～8 ℃45～60 min。在對(duì)照孔紅細(xì)胞顯著呈鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果。

1.2 標(biāo)定抗原效價(jià)的結(jié)果判定

將反應(yīng)板傾斜60°，觀察紅細(xì)胞有無淚珠狀流淌，凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%紅細(xì)胞凝集這點(diǎn)很重要，如果終點(diǎn)孔中心有點(diǎn)狀沉集，都對(duì)以后的試驗(yàn)有較大影響。

2 血凝抑制試驗(yàn)中常見問題

2.1 4單位抗原的制備

根據(jù)血凝效價(jià)結(jié)果配制相應(yīng)比例的抗原稀釋液：即4單位抗原。如抗原效價(jià)為1∶128，則應(yīng)將抗原做256÷4=64倍稀釋。

2.2 4單位抗原的校正

為保證4 單位抗原配制準(zhǔn)確，需做回歸試驗(yàn)。方法為：

2.2.1 首先用微量移液器向反應(yīng)板的第2孔至第6孔加生理鹽水25 μl，第1孔不加。

2.2.2 用微量移液器吸取4單位抗原25 μl分別加入第1孔、第2孔，從第2孔開始倍比稀釋5～6次，然后吸出25 μl至第3孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去25 μl。

2.2.3 用微量移液器再吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入1～6孔，每孔25 μl。

2.2.4 于微量震蕩器上震蕩1 min，室溫靜置30 min 后觀察結(jié)果。

2.2.5 結(jié)果觀察：第1、2、3孔為完全凝集，第4孔紅細(xì)胞為50%沉淀，第5孔為對(duì)照完全沉淀，如果出現(xiàn)以上結(jié)果表明4單位抗原配制準(zhǔn)確，校正成立。

2.2.6 通過多次試驗(yàn)比對(duì)證明，配制4 單位抗原后，按照血凝抑制試驗(yàn)操作規(guī)程測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清效價(jià)，血凝抗原和對(duì)照的陽(yáng)性血清效價(jià)一般大于等于7 log 2，兩者效價(jià)基本平行一致，相差±≤1 log 2滴度，此時(shí)也可證明4單位抗原配制準(zhǔn)確。

2.3 待檢血清的處理

新鮮的樣品一般不需要處理，如果是冷凍保存的血清樣品，解凍后出現(xiàn)分層現(xiàn)象時(shí)要搖勻才能用于檢測(cè)。

2.4 血清對(duì)照

每次做HI 試驗(yàn)時(shí)，都要做陽(yáng)性血清對(duì)照和陰性血清對(duì)照，不需要每板都做，一次做兩份陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照即可，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過±1個(gè)滴度，陰性對(duì)照血清效價(jià)不高于2 log 2時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果才有效。

2.5 加樣品稀釋過程中應(yīng)注意的問題

倍比稀釋過程中如果混合不均勻，也會(huì)使結(jié)果出現(xiàn)差異，用微量移液器吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡和液體的濺出，加4單位病毒抗原和1%紅細(xì)胞懸液時(shí)要避免移液器的滴頭與孔內(nèi)的液體接觸，為減少交叉污染，可以從低倍孔往高倍孔方向加樣。加入1%紅細(xì)胞懸液時(shí)要邊搖邊加，保證所加的樣品量和濃度準(zhǔn)確一致。4 單位樣品配制后要在2h內(nèi)用完。

2.6 反應(yīng)溫度和時(shí)間

加入抗原后20～25 ℃靜置至少30 min，加入1%紅細(xì)胞懸液后震蕩混勻，靜置20～30 min，根據(jù)對(duì)照孔紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉于孔底時(shí)迅速判定結(jié)果。

2.7 結(jié)果判定

將反應(yīng)板傾斜，從背側(cè)觀察紅細(xì)胞是否呈淚珠狀流下，以完全抑制4單位抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI效價(jià)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)血清對(duì)照孔與已知效價(jià)誤差不超過±1個(gè)滴度，陰性對(duì)照血清效價(jià)不高于2 log 2時(shí)，試驗(yàn)方可成立。

總的來說，只要1%紅細(xì)胞懸液和4 單位病毒抗原配制準(zhǔn)確，按照試驗(yàn)操作規(guī)程規(guī)范操作，一般情況下試驗(yàn)都會(huì)成立。出現(xiàn)問題時(shí)要認(rèn)真分析，綜合考慮各個(gè)環(huán)節(jié)的影響因素，及時(shí)總結(jié)為以后的試驗(yàn)積累數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，只有這樣才能不斷提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。