地中海貧血基因檢測研究進展

施建剛

廣西壯族自治區貴港市人民醫院檢驗科，廣西貴港 537100

地中海貧血是由于珠蛋白基因突變而引起的一組常染色體隱形遺傳病[1]。目前，地中海貧血的治療方法正處于臨床研究的過程中，難以通過有效手段來達到根治的效果，因此需要通過婚前檢查、產前篩查、遺傳信息指導等方面來控制遺傳。特別是針對攜帶了地中海貧血基因的孕婦，應加強妊娠早期的產前基因檢查，提高地中海貧血基因的診斷率，在合理的調控下減少貧血兒的出生人數，是目前最為有效的預防手段[2]。在此，現對地中海貧血基因突變檢測的研究進展作出如下綜述。

1 地中海貧血的分子基礎

1.1 α-地中海貧血

α-地中海貧血是現階段最為常見的單基因遺傳病，其發病機制在于珠蛋白基因缺失的影響，或者是缺陷使α-珠蛋白鏈合成受到抑制所形成的[3]。從基因簇來看，α-珠蛋白基因位于16號染色體末端16pl3.3點位上，因此也將α-地中海貧血分為兩個不同的種類，其中包括：（1）缺失型α-地中海貧血：常見的為α0地中海貧血和α+地中海貧血，前者表現為缺失2個α基因，后者表現為缺失1個α基因；（2）非缺失型α-地中海貧血：基因樣本中缺失了小部分的堿基或者基因發生點突變的情況。在兩種不同的α-地中海貧血類型中，已經確定了38種為α-地中海貧血缺失類型，而基因點突變的非缺失α-類型約有34種[4]。

1.2 β-地中海貧血

β-地中海貧血是一種β鏈在合成過程中受到抑制作用而形成的一組血紅蛋白病，其珠蛋白基因位于11號染色體短臂11pl15上，若是患者本身存在先天性遺傳基因缺陷的問題，就會因血紅蛋白癥而引發溶血性貧血[5]。臨床的相關調查數據顯示，目前大部分的β-地中海貧血均通過基因突變引起的，少部分是由于基因缺失而形成。β0珠蛋白的作用在于障礙性貧血的生成，而基因突變則會導致β鏈出現抑制效果，難以正常合成，最終無法生成β鏈；β+珠蛋白的作用即使也會一直β鏈的合成，但仍可以生成部分β鏈；非典型的β-珠蛋白則會由于分子缺陷的影響，導致β-珠蛋白基因啟動出現異常，最終在基因表達方面也會受到影響[6]。

2 地中海貧血的基因研究檢測方法

2.1 質譜檢測技術

2.1.1 聚合酶鏈式反應技術 聚合酶鏈式反應是一種用于DNA片段檢測的分子生物學技術，能夠實現在生物體外進行DNA的復制功效。目前，聚合酶鏈式反應技術已廣泛應用于地中海貧血的基因檢測中，并在此基礎上研究了多種類型的檢測方法，進一步提高了臨床地中海貧血的基因檢出率。而常見的聚合酶鏈式反應新技術包括：（1）基因特異性PCR-溶解曲線分析技術：Danjou等[7]在β珠蛋白基因突變的患者中應用基因特異性PCR-溶解曲線分析技術，通過加入新型的熒光染料來了解聚合酶鏈的動態反應變化過程，在研究中記錄熒光值變化的溶解曲線，以每5秒的時間間隔為宜，將所得的曲線圖用于β地中海貧血基因突變的觀察中。結果顯示，基因特異性PCR-溶解曲線分析技術的應用成本低，在實際操作的過程中無需應用熒光標記探針，并且具有通量高、污染輕、質控便捷、自動化程度高等特點。（2）單管多重聚合酶鏈式反應技術結合RDB技術：Du等[8]采集了國內常見的缺失型α-地中海貧血基因突變的診斷標本，并選取82例作為研究對象，分析單管多重的聚合酶鏈式反應技術對常見的地中海貧血基因突變的RDB法，并根據擴增圖譜和顯色斑點等數據來判斷標本的突變類型，以將產前診斷標本與引產或者出生后的胎兒基因研究進行結果對比。結果顯示，α-地中海貧血產前診斷的結果與胎兒臍帶血的HbBart"s的定量結果基本一致。

2.1.2 高分辨溶解曲線分析技術 高分辨溶解曲線分析技術在臨床上的應用中具有靈敏度高、特異性明顯等優點，與定量探針法突變分析或者其他檢測技術手段相比，高分辨溶解曲線分析技術的靈敏度可高達0.1～0.8，特別是在多點位基因突變或者樣本量較大的點位篩查中，解決了傳統檢測技術中性價比低、耗時長等問題，因而應用面更為廣泛，成為了近年來國內外遺傳學研究的重點方向之一。王晶晶等[9]在我國國內常見的β-地中海貧血基因突變患者中應用高分辨溶解曲線分析技術，選擇52例正常研究對象作為對照組，45例已知基因突變型患者作為觀察組；其中對照組曲線分析結果顯示基因篩查的區域中存在三個常見的SNPs，觀察組曲線分析結果顯示所有突變均能正常檢出，并且對于不同的基因型都能作出不同的溶解曲線變化圖。Mohammad等[10]在基于高分辨溶解曲線分析技術的應用下，快速對β-地中海貧血基因突變人群進行位點篩查，結果顯示此類快速篩查的方法與直接所得的基因類型結果完全一致。

2.2 擴增檢測技術

2.2.1 突變擴增系統技術 在應用突變擴增系統技術的過程中，需要同時采用聚合酶鏈反應技術和瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法，以觀察檢測對象中是否攜帶基因突變的擴增產物[11]。在現階段突變擴增系統技術的應用中，一般僅需要進行單次的聚合酶鏈反應電泳便能呈現出正常的檢測結果，同時具有成本低、方法簡單便捷、檢測時間段等優點，但其局限性在于無法一次性檢測多突變位點，具有方法單一、樣本容量小等缺陷。在Feng等[12]的研究中，采用突變擴增系統技術檢測常見的地中海貧血突變位點，結果顯示，該方法能夠一次性檢測14種不同的突變位點情況，但是目前臨床上仍是以反向點雜交技術為主要應用方法，突變擴增系統技術應用范圍有限。

2.2.2 多重連接探針擴增技術 多重連接探針擴增技術出現于2002年后，起初是由荷蘭的一名學者提出的，作為一種相對定量分析技術被應用于臨床檢測中。在多重連接探針擴增技術的應用過程中，可明顯發現該方法具有靈敏度高、通量高等優點，在基因序列的定量分析中，可以巧妙地結合銜接、雜交以及聚合酶鏈反應，提高了檢測的樣本容量，可以應用于30個以上的核苷酸序列拷貝數轉變的檢測中[13-14]。Rasoul等[15]采用多重連接探針擴增技術結合跨越斷裂點技術的檢測方法，用于地中海貧血新的基因突變類型研究中，結果顯示，發現1個新增的地貧突變類型，并將其稱為-α21.9。由此可見，多重連接探針擴增技術具有特異性明顯的特點，其良好的重復性功能可以用于檢測已知、甚至是未知的確實或重復型基因突變中。

2.2.3 跨越斷裂點技術 跨越斷裂點技術是一種檢測地中海貧血缺失型基因突變的方法，其機制和原理在于通過在缺失片段中建立引物，來了解受檢者基因中是否出現缺失、擴增等情況[16]。在正常情況下，若是引物設計出現缺失片段時，引物之間通常會保持一定的距離，因此不會出現擴增出目的的片段；若是在出現缺失片段的狀態下，引物之間的距離則會縮短，同時也能出現擴增出目的的片段。Chan等[17]采用跨越斷裂點技術檢測常見的α-地中海貧血基因，結果顯示-α4.2、-（α）20.5、-αSEA等六種常見基因能夠被正常檢出，這充分說明跨越斷裂點技術在地中海貧血的基因診斷中可以起到重要的作用。目前，Gap-PCR技術在應用過程中具有設備要求低、步驟簡單等特點，但是其局限性在于未能檢測點突變或者未知的缺失突變基因。

2.2.4 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR是一種以熒光化學物質進行聚合酶鏈式反應循環后產物總量的檢測方法，始終發生在DNA的擴增反應過程中，其機制在于能夠對地中海貧血基因樣品中的DNA序列進行定量分析，以了解地中海貧血患者基因突變的發展進程。在聚合酶鏈式反應的擴增階段內，熒光信號可以對其階段的發展情況進行實時的檢測，而在反應擴增期間，隨著各類指數的變化影響，該模板內的CT值和起始拷貝數均存在明顯的線性聯系，而這也是決定定量的重要依據[18]。在地中海貧血基因突變的檢測中，針對核酸拷貝數的檢測，實時熒光定量PCR是敏感度最高的一種方法，在DNA基因表達的研究中也應用廣泛。Danjou等[19]選取32例常規缺失型地中海貧血患者作為研究對象，采用實時熒光定量PCR對其進行基因檢測，結果顯示，32例樣本中均缺失α-珠蛋白基因。由此可見，實時熒光定量PCR在檢測未知缺失類型的α-地中海貧血中檢出率較高，并且具有檢測快速便捷的特點，但是在未來的技術研究中，仍需要加強傳統基因檢測的不足，改善其局限性，提高檢出率。

2.3 雜交檢測技術

2.3.1 Southern印跡雜交技術 在地貧基因檢測中，Southern印跡雜交技術一直是缺失型α-地中海貧血診斷的金標準[20]。經臨床檢測發現，該技術具有穩定性強、檢出率高、檢測準確等優點，但與其他檢測技術相比，也存在一定的缺點，如檢測時間過長、操作復雜、需要加入放射同位素燈。因此，Southern印跡雜交技術在常規診斷中應用較少。

2.3.2 等位基因特異性核苷酸探針雜交技術 等位基因特異性核苷酸探針雜交技術是一種基于雜交理念下進行基因突變檢測的技術，屬于常規檢測的一種。在檢測過程中，采用等位基因特異性核苷酸探針雜交技術擴增目的基因的片段，以促進產物與探針的雜交，進而通過自顯影來記錄并觀察地中海貧血基因檢測的結果[21]。目前，等位基因特異性核苷酸探針雜交技術在應用過程中具有靈敏度高、準確率高等優點，但如若針對多個突變基因進行檢測時，也會耗費較長的時間，因此也不是地中海貧血雜交檢測技術的最優選擇。

2.3.3 反向點雜交（RDB）技術 反向點雜交技術在1989年被Rigas等[22]提出，是一種用于檢測點突變的新技術。與常規的雜交檢測技術相比，固定靶DNA的方式被膜上固定探針所取代，其機制是通過將擴增靶序列與膜上固定探針進行雜交，讓多種特異性的探針能過在首次雜交中篩查檢測出DNA中的突變位點。這一技術的出現和應用，改善了ASO探針雜交技術等傳統檢測方法中1次檢測只能檢出1種基因突變的弊端，也體現出了該檢測方法的多樣性。有研究指出[23]，目前我國的地中海貧血檢測技術中，基因檢測檢出率最高的就是反向點雜交技術，并且具有操作便捷、診斷迅速，準確率高等優點，但與此同時仍存在一些不足之處，如費用高、檢測時間長、操作復雜、影響檢測結果的因素較多等，也為該檢測技術的推廣應用帶來了一定的阻力。梁漢彰[24]在針對β-地中海貧血基因攜帶者中采用反向點雜交結合聚合酶鏈式反應技術，結果顯示，單一的反向點雜交技術假陰性率為17.56%，反向點雜交結合聚合酶鏈式反應技術的假陰性率為3.42%。由此可見，與單一的反向點雜交技術相比，PCR-PDB技術在檢測中的敏感度、特異性、通量更高，同時在成本和檢測時間方面也具有許多優勢，甚至能夠在同一時間內進行3～5個已知基因突變的檢測，在未知突變基因檢測中也能表現出一定的優勢，甚至在質量控制方面也具有顯著效果。

2.4 基因測序技術

基因測序技術是指對聚合酶鏈式反應技術的產物進行突變檢測的一種方法，不僅可以通過檢測來確定受檢樣本基因突變的部位，甚至還能夠明確基因突變的性質，在臨床地中海貧血基因檢測中起到了重要的作用。在基因測序技術的實際檢測應用中，該技術具有靈敏度高、通量高等特點，并且采用了新的基因鑒定方法，在突變檢驗中可以驗證新方法的鑒定效果。Mohanty等[25]選用了基因測序技術結合多重連接探針擴增技術來檢測86例疑似地中海貧血基因缺陷的血清樣本，結果顯示，在檢測中能夠明確α合并β的雙重雜合缺陷基因，其中α基因型占97.1%，β基因型占62.8%，α合并β的雙重雜合基因型占26.4%。這充分提示采用基因測序技術結合多重連接探針擴增技術能夠彌補單次基因測序技術的不足，進一步提高地中海貧血基因缺陷檢測的準確率。

3 結語

隨著各類檢測技術的進步和發展，地中海貧血的基因診斷技術在此類疾病的診療中起到了不可替代的作用。但是，在檢測技術實際應用的過程中，存在操作復雜、費用高、檢測時間長等不足，因此大部分地中海貧血患者未能體會到檢測技術帶來的效益。與此同時，在現階段地中海貧血基因的篩查中，檢測方法和指標尚未完全統一，臨床在進行研究的過程中也缺乏大量的樣本來進行數據的驗證，從而導致基因檢測中存在一定程度的假陽性率或假陰性率。因此，繼續加強檢測方法的研究，追求一種操作便捷、經濟便利、檢測準確的技術方法成為了討論和研究的熱點。總之，在地中海貧血的基因檢測技術發展過程中，需要不斷提高各類檢測技術的質量，提出能夠廣泛推廣的檢測技術，旨在做好地中海貧血基因診斷的工作，同時還應加強新的基因突變位點序列的研究和分析，不斷研究新的檢測方法，對基因篩查、提高人口素質來說都具有積極的意義。