缺血后處理對全腦缺血再灌注大鼠海馬區神經元自噬的影響

劉瑤 韓影 許麗雅 趙雅寧 劉宇 劉俊杰 李建民

(華北理工大學，河北 唐山 063000)

腦缺血已經成為嚴重危害中老年人群生命安全和生活質量的嚴重疾病，由于大腦對氧的需求量比較大，比其他器官更容易產生再灌注損傷〔1〕，所以研究怎樣減輕缺血再灌注損傷對治療腦缺血具有十分重要的意義。缺血后處理是指在缺血后再灌注早期對缺血組織進行反復、短暫性缺血再灌注處理，使組織對缺血產生耐受性，從而減輕再灌注損傷，經研究發現缺血后處理可以減少梗死面積、保護內皮細胞功能,是缺血再灌注損傷較有力的內源性保護機制,在臨床上缺血性心、腦及外周血管疾病的防治具有良好的應用前景。近年來自噬在神經系統疾病中的作用及其作用機制受到國內外學者廣泛關注。靳奧潔等〔2〕通過對大鼠腦缺血再灌注模型研究，指出自噬參與腦缺血再灌注損傷的過程。適度自噬可以發揮神經保護作用，而過度自噬引起自噬性細胞死亡。腦缺血后處理作為一種新型的腦保護機制，其明顯減輕了腦缺血再灌注損傷，經研究發現缺血后處理對神經細胞的保護作用可能與蛋白激酶途徑、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、炎癥等有關〔3～5〕，但其與自噬之間的聯系目前尚不清楚，故本文通過檢測自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ 的表達變化，探討腦缺血后處理的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 成年健康雄性SD大鼠72只，10～12周齡，體重(300±50)g，來自華北理工大學實驗動物中心，合格證號SCXK(京)2009-003；清潔級，自由飲食，室溫飼養。

1.2主要試劑與儀器 兔抗Beclin1多克隆抗體、兔抗LC3多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體由北京博奧森生物技術有限公司提供。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Olympus光學顯微鏡由日本Olympus公司提供。Nikon攝影生物光學顯微鏡和Bio-Rad凝膠成像系統為日本株式會社尼康產品。

1.3方法

1.3.1動物分組和造模 將72只大鼠采用隨機數字法分為假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注模型組(CIR組)、腦缺血后處理組(CIP組)，每組24只。采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法〔6〕建立大鼠全腦缺血模型。術后24 h后用無創動脈夾同時夾閉雙側頸總動脈15 min，大鼠全腦缺血成功判斷標準為：大鼠昏迷、翻正反射消失、雙側瞳孔放大、眼睛顏色發白。15 min后大鼠恢復再灌注，放回籠中單獨飼養直至相應時間點留取CIR組大鼠標本。CIP組大鼠首先同CIR組大鼠一樣采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法制作大鼠全腦缺血模型，然后在完全恢復再灌注前給予短暫的再灌注/缺血處理，時間各15 s，重復3次，于恢復再灌注的相應用時間點處死大鼠留取本實驗大鼠腦組織標本。

1.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色 在預定時間點對大鼠進行麻醉，開胸，暴露心臟，穿刺主動脈后，注射4%的多聚甲醛250～300 ml，斷頭取腦，于4%多聚甲醛固定腦組織中。常規包埋蠟塊。連續冠狀切片，片厚約為4 μm，常規脫蠟至水，經HE染色。光學顯微鏡高倍鏡(×400)下隨機觀察各時間點每組均隨機數字表法選取的切片，采用Motic6.0 數碼醫學圖像采集分析系統計數每個視野的存活細胞，取其平均值進行統計分析。

1.3.3免疫組織化學方法 采用SP法。常規脫蠟至水，3%過氧化氫中浸泡，高壓修復抗原；滴加一抗Beclin-1、LC3-Ⅱ(1∶200)，濕盒中過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后滴加二抗PV6001，放于37℃溫箱孵育；二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色，梯度酒精脫水，透明封片。Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細胞計數：光學顯微鏡(40×10倍)下觀察腦組織切片，Olympus攝影顯微鏡計數海馬區不重疊視野的陽性細胞，取其均值進行統計學分析。

1.3.4Western 印跡 無須進行灌注，直接于冰上斷頭取腦，剝離出內部雙側似月牙形狀的海馬，放置于EP管中，標記好后放于-80℃冰箱保存。取出海馬組織，用組織裂解液提蛋白，配置標準蛋白，酶標儀繪制標準曲線，計算蛋白樣品濃度，制膠，進行SDS-PAGE，轉膜，洗膜，加入兔抗Beclin-1多克隆一抗(1∶800稀釋)、兔抗LC3多克隆一抗(1∶800稀釋),4℃冰箱過夜。TBST洗膜,加入山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，采用Bio-Rad凝膠成像分析系統對條帶進行曝光、顯影和分析。將目的蛋白與內參β-actin的光密度值進行比較，對蛋白表達含量進行半定量分析。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組海馬區HE染色結果 Sham組大鼠海馬區神經元結構和形態正常，排列整齊緊密，未見壞死變形的細胞；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區神經元結構損傷，各時間點存活神經元數量較明顯減少(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區神經元結構損傷減輕，各時間點存活神經元數量明顯增多(P<0.05)。見表1,圖1。

表1 各組海馬區存活神經元數量個/高倍視野)

與Sham組比較：1)P<0.05；與CIR組比較：2)P<0.05

圖1 鏡下觀察各組海馬區神經元結構(HE，×400)

2.2各組海馬區免疫組化結果

2.2.1各組海馬區LC3-Ⅱ表達結果 Sham組大鼠海馬區各個時間點可見少量LC3-Ⅱ陽性弱表達；與Sham組比較， CIR組、CIP組大鼠海馬區各時間點LC3-Ⅱ表達顯著增加(P<0.05)，其中6 h開始增加，24 h達高峰，48 h、72 h下降；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區各時間點LC3-Ⅱ表達顯著增加(P<0.05)；CIP組大鼠海馬區LC3-Ⅱ表達24 h達高峰，組內各時間點比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 各組海馬區LC3-Ⅱ陽性細胞表達個/高倍視野)

與Sham組比較:1)P<0.05；與CIR組比較:2)P<0.05；與CIP組內24 h比較:3)P<0.05，下表同

圖2 各組海馬區LC3-Ⅱ表達(DAB，×400)

2.2.2各組海馬區Beclin-1表達結果 Sham組大鼠海馬區各個時間點可見少量Beclin-1陽性弱表達；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區各時間點Beclin-1表達顯著增加(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區各時間點Beclin-1表達顯著增加(P<0.05)；CIP組大鼠海馬區Beclin-1表達24 h達高峰，組內各時間點比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 各組海馬區Beclin-1陽性細胞表達個/高倍視野)

圖3 各組海馬區Beclin-1表達(DAB，×400)

2.3各組海馬區Western 印跡結果

2.3.1各組海馬區LC3-Ⅱ蛋白表達 Sham組大鼠海馬區各個時間點見少量LC3-Ⅱ蛋白表達；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區各時間點LC3-Ⅱ蛋白表達量顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區各時間點LC3-Ⅱ蛋白表達量顯著增加，72 h表達最低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖4。

表4 各組海馬區LC3-Ⅱ蛋白Western印跡結果個/高倍視野)

與Sham組比較：1)P<0.05；與CIR組比較：2)P<0.05；與本組24 h比較：3)P<0.05；與本組72 h比較：4)P<0.05，下表同

圖4 LC3-Ⅱ蛋白Western印跡結果

2.3.2各組海馬區Beclin-1蛋白表達 以Beclin-1光密度值/β-actin光密度值表示Beclin-1蛋白的相對表達量。Sham組大鼠海馬區各個時間點見少量Beclin-1蛋白表達；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區各時間點Beclin-1蛋白表達量顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區各時間點Beclin-1蛋白表達量顯著增加，24 h表達最高，72 h表達最低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5，表5。

圖5 Beclin-1蛋白Western印跡結果

表5 各組海馬區Beclin-1蛋白Western印跡結果個/高倍視野)

3 討 論

腦缺血是一種多因素的異質性疾病，死亡率和致殘率都很高，影響著各個年齡組、種族和國家的人口，尤其是對老年人的損害比較嚴重。缺血后處理通常是指長時間嚴重缺血損傷后對大腦或遠端肢體的血液供應進行的一次或一系列短暫的干擾，調動機體內源性物質，為腦缺血誘導的神經元喪失提供腦保護〔7〕。經研究發現，缺血后處理在減輕心肌損傷的缺血再灌注損傷，肺移植再灌注損傷，腎臟缺血再灌注損傷等發揮著重要作用〔8～10〕。2006年Zhao等〔11〕發現缺血后處理在發生腦卒中后具有促進神經功能恢復，保護腦功能的作用。通過大鼠局灶性腦缺血模型研究證實，缺血后處理能抑制細胞凋亡發揮神經保護作用〔12〕。缺血后處理通過影響缺血后再灌注和腦血流量，改善腦缺血后神經血管單位中內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞之間的相互作用，下調協同的有害過程，包括興奮毒性、線粒體紊亂、氧化應激和炎癥進而影響了其下游的細胞信號〔13〕。本研究證實缺血后處理能夠減輕腦缺血再灌注損傷。這與以往的研究一致，導致缺血后處理腦保護作用的潛在機制是復雜的，并且仍然沒有得到很好解釋。

自噬是一種溶酶體介導的降解過程，它清除錯誤折疊的蛋白質和過量或受損的細胞器，在細胞內環境的穩態中起著至關重要的作用。細胞通過溶酶體途徑降解衰亡的細胞器及損傷的蛋白即是自噬〔14〕。自噬具有雙重作用，當自噬適度激活時，可加速胞內蛋白質降解，一些錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器可以被降解為代謝元素并循環利用以維持細胞內穩態，抵抗能量不足，促進細胞存活；當自噬過度激活時，可導致細胞裂解，引起細胞死亡。王國峰等〔15〕通過在大鼠腦缺血前注射自噬誘導劑雷帕霉素發現細胞凋亡減少，表明自噬能減輕缺氧缺血損傷，具有神經保護作用。Beclin-1和LC3都是重要的自噬相關蛋白，被用作自噬體的可靠生物標記物，Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，Beclin1表達的上調對自噬過程也是必要的，因其表達的強度與自噬的活性程度密切相關，相反，Beclin1的沉默和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化的減少將有助于阻止自噬體的加工〔16〕。已有研究發現通過使用自噬抑制劑3-MA和渥太青霉素下調缺血再灌注后神經元中Beclin-1表達，加重了神經元壞死，而應用自噬激活劑雷帕霉素可以上調Beclin-1表達，同時發現神經元損傷明顯減少，證明了自噬在缺血再灌注后發揮重要保護作用〔16,17〕。幾乎在各種組織細胞均可以見到自噬現象，自噬可以通過調節受損細胞質和線粒體的降解來維持細胞內穩態，并確保細胞在應激條件下的生存，自噬在缺血性腦再灌注損傷中受多重因素調控。在本實驗中，缺血后處理通過上調缺血再灌注自噬相關蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達，以減少缺血再灌注損傷神經元凋亡，減輕神經功能缺損癥狀，從而發揮其腦保護作用，且在出缺血后處理24 h時，自噬相關蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達明顯增多。缺血再灌注損失導致過多的ROS，而ROS不能被內源性防御系統迅速清除，以往的研究發現自噬的產生與低氧誘導因子-1α、氧自由基的適度產生等有關〔18,19〕，其主要機制與增強內源性抗氧化防御系統有關。缺血后處理可誘導低氧誘導因子-1α表達上調，避免氧自由基的過度產生而導致的自噬性死亡，從而使自噬在24 h保持一個較高的水平，發揮了保護作用。

綜上所述，腦缺血再灌注損傷會造成明顯的神經元損傷，缺血后處理通過激活自噬減少了神經元的凋亡，減輕了腦缺血再灌注損傷?？傊S著研究的進一步進行，缺血后處理的腦保護作用已經明確，但由于其機制廣泛而復雜，還未明確。而近年來自噬在心腦血管疾病中的作用越來越受到人們的關注，關于缺血后處理與自噬的關系值得探索發現，為臨床腦缺血再灌注損傷的治療提供新思路。