抗構象表位橋粒芯蛋白抗體和乙酰膽堿受體抗體滴度與尋常型天皰瘡病情活動度的相關性研究

李志量 張寒梅 向睿宇 荊可 馮素英

中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院皮膚科 江蘇省皮膚病與性病學重點實驗室，南京210042

尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）是一種以血清中存在橋粒芯蛋白（desmoglein，Dsg）抗體為特征的自身免疫性水皰病。根據受累部位，可分為皮膚黏膜型和黏膜型天皰瘡，單純皮膚受累的PV較少見。黏膜型PV血清中通常僅有Dsg3抗體，皮膚黏膜型PV 血清中通常同時存在Dsg1 和Dsg3 抗體［1-2］。部分研究表明［3-6］，Dsg抗體滴度可一定程度上反映PV 患者病情嚴重程度和病情活動度。Dsg抗體可分為抗構象表位抗體和抗線狀表位抗體，其中抗構象表位抗體有致病性［7］。傳統Dsg抗體檢測方法檢測的是抗構象表位抗體和抗線狀表位抗體總量。近年來有文獻報道［8］，通過改良的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可以檢測出抗構象表位Dsg抗體滴度，可能比傳統方法更能反映病情變化。也有研究發現，膽堿能途徑在天皰瘡的發病中可能發揮作用，并且部分患者血清中可以檢測到乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor antibody，AChR）抗體［9］。本研究檢測了PV 患者血清中抗Dsg 抗體及抗Dsg 構象表位抗體的滴度和AChR 抗體滴度，以探究PV血清抗體滴度與病情嚴重程度和病情活動度的相關性。

對象與方法

一、對象

中國醫學科學院皮膚病醫院于2012—2015 年收治的24例PV患者，男13例，女11例。所有入選病例符合以下標準：①皮膚和/或黏膜出現松弛性水皰，尼氏征陽性；②組織病理可見棘層松解細胞；③直接免疫熒光可見角質形成細胞間IgG 和/或C3 沉積；④Dsg1 和（或）Dsg3 抗體ELISA 檢測值＞20 U/ml。同時符合①、②、③或者④時診斷為PV。按照天皰瘡病情活動度分為活動期和穩定期。活動期指患者發病初次就診，未系統使用糖皮質激素及細胞毒性藥物，就診前3天有新發水皰或糜爛面；穩定期指至少2周內沒有新發的紅斑和水皰，原有的水皰和糜爛面完全消失，糖皮質激素用量相當于醋酸潑尼松≤20 mg/d。本文24 例PV 患者均有皮膚和口腔黏膜受累，首次就診時處于活動期。根據患者病情嚴重程度，使用不同劑量糖皮質激素（部分患者同時使用環磷酰胺、麥考酚酯或硫唑嘌呤等免疫抑制劑）治療。共有20 例患者完成隨訪，均為穩定期，天皰瘡疾病面積指數（pemphigus disease area index，PDAI）評分均≤3，糖皮質激素用量相當于≤20 mg/d 醋酸潑尼松，穩定期患者距首次就診間隔時間為半年至2 年。本研究通過中國醫學科學院皮膚病醫院倫理委員會批準（批準號：2010臨審09號），所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.PDAI 評分及血清標本采集：24 例活動期患者首次就診時采集血清標本，評估PDAI。20 例患者隨訪至穩定期時再次采集血清標本，評估PDAI。

2.ELISA檢測Dsg1、Dsg3抗體：將PV患者血清稀釋（1∶101）后，按照ELISA試劑盒（日本株式會社醫學生物學研究所）說明書操作。在波長450 nm處讀取吸光度（A值），以2個孔的均值作為結果，按照說明書公式計算抗體滴度。當滴度值＞150 U/ml時，稀釋血清，重新檢測，并按照稀釋倍數計算真實滴度。

3. 改良ELSIA 檢測Dsg1、Dsg3 抗構象表位抗體［7，10］：乙二胺四乙酸（EDTA）具有破壞抗原構象表位的作用，用EDTA 處理包被抗原的ELISA 孔板30 min 后，再進行后續ELISA 檢測，可以只檢測線狀表位的抗體滴度，用傳統方法測得的抗體滴度減去抗線性表位的抗體滴度，得到的結果即為抗構象表位抗體滴度。

4.ELISA 法檢測患者血清中AChR 抗體：按照ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）說明書操作，設2個復孔，取平均值。陽性判定標準：試驗孔A值＞2.1×陰性對照A值。

結 果

一、Dsg1抗體及抗構象表位Dsg1抗體與PV患者PDAI的關系

首次就診時，活動期患者的Dsg1 抗體滴度（611.4 ± 136.8）與 抗 構 象 表 位Dsg1 抗 體 滴 度（585.5 ± 134.7）差異無統計學意義（t = 0.13，P =0.89）。活動期患者的Dsg1抗體滴度及抗構象表位Dsg1 抗體滴度與PDAI 評分均呈正相關（r = 0.54、0.54，均P ＜0.01）。20 例穩定期患者的Dsg1 抗體與抗構象表位Dsg1抗體滴度與首次就診時比較均明顯下降（抗體檢測陰性或滴度＜活動期時的20%）。

二、Dsg3抗體及抗構象表位Dsg3抗體與PV患者PDAI的關系

首次就診時，活動期患者的Dsg3 抗體滴度（708.6 ± 130.7）高于抗構象表位Dsg3 抗體滴度（297.2 ± 54.4），差異有統計學意義（t = 2.90，P ＜0.01）。活動期Dsg3 抗體滴度與PDAI 評分無相關性（r=0.11，P=0.62），抗構象表位Dsg3 抗體滴度與PDAI評分呈正相關（r=0.53，P ＜0.01）。

20 例穩定期患者抗構象表位Dsg3 抗體滴度（119.9 ± 40.7）低于活動期（297.2 ± 54.4），差異有統計學意義（t=2.52，P ＜0.05）。20 例穩定期患者血清中Dsg3 抗體滴度與活動期相比，7 例明顯下降，13 例仍存在較高滴度Dsg3 抗體（抗體檢測滴度＞活動期的20%），這13 例患者活動期時的PDAI 評分（38.26 ± 3.36）高于另外7 例（29.29 ±3.12，t=1.74，P ＜0.05），且這13例患者中有6例在穩定期抗構象表位Dsg3抗體滴度明顯下降。

三、AChR抗體與PV患者病情的關系

活動期患者中有6 例AChR 抗體陽性，穩定期患者均為陰性。在上述13例穩定期血清中仍存在較高滴度Dsg3抗體的患者中，5例在活動期可檢測到AChR 抗體；上述7例穩定期血清中Dsg3抗體明顯下降的患者中，僅1 例在活動期可檢測到AChR抗體（P=0.30）。

討 論

本研究采用傳統的ELISA 與改良ELISA 檢測PV 患者血清中的Dsg 抗體與抗線性表位的Dsg 抗體。改良的ELISA 通過EDTA 破壞致病性的構象表位，可直接檢測非致病性線性表位，再與傳統的ELISA 比較，可得到致病性構象表位的抗體滴度，理論上更能反映病情嚴重程度和病情變化。

本研究中，兩種方法檢測的活動期患者Dsg1抗體與抗構象表位抗體差異無統計學意義，提示PV患者血清中Dsg1抗體絕大部分為有致病性的抗構象表位抗體；活動期患者的Dsg1 抗體滴度及抗構象表位Dsg1抗體滴度與PDAI評分均呈正相關，這也提示兩種方法測得的Dsg1抗體及抗構象表位Dsg1抗體滴度都可以反映病情的嚴重程度。在穩定期患者中，兩種方法測得的Dsg1 抗體及抗構象表位Dsg1 抗體滴度都顯著下降，提示兩種Dsg1 抗體滴度都可以反映病情變化。本文兩種方法檢測活動期患者Dsg3 抗體時，Dsg3 抗體滴度顯著高于抗構象表位抗體，且活動期患者的Dsg3 抗體滴度與PDAI評分無相關性，抗構象表位Dsg3抗體滴度與PDAI 評分呈正相關，提示患者血清中存在一定數量的非致病性線狀表位Dsg3 抗體，而采用改良的ELISA 檢測的抗構象表位Dsg3抗體滴度更能反映病情的嚴重程度和病情的活動性。在臨床工作中，結合改良ELISA 檢測的Dsg3抗體滴度，可能更有助于反映患者病情活動度。

以往部分研究提示，除Dsg抗體外，AChR抗體在PV 發病中也可能發揮一定的致病作用［11-12］，但不同的研究中，AChR抗體的檢出率有差別［3，9］。本研究中，24 例活動期患者中也只有6 例AChR 抗體陽性，而這6例患在病情穩定后，抗體滴度都轉陰，提示AChR 抗體滴度也可一定程度上反映病情的活動情況。值得注意的是，穩定期患者中，7 例患者Dsg3 抗體滴度較活動期明顯下降，13 例患者血清中仍存在較高滴度的Dsg3 抗體，部分患者滴度甚至高于病情活動期。而這13例中，5例在活動期可檢測到AChR 抗體，7 例中，僅1 例可檢測到AChR抗體，提示穩定期患者Dsg3抗體滴度較高的患者，檢測到AChR 抗體的概率更高，但由于樣本量較少，還需更多的樣本驗證。

本文中，這種PV 患者病情的減輕與傳統Dsg3抗體滴度降低不一致的情況在以往的研究中［13-14］并不少見，造成這種不一致性的原因有3 種，①部分患者血清中存在著非致病性的抗線性表位的Dsg3 抗體；②部分患者血清中可能存在著有致病性的AChR抗體；③部分患者血清抗Dsg3抗體亞型中，非致病性IgG1亞型比例高，從而導致了Dsg3抗體滴度與病情變化不一致。我們的研究中，有13例患者表現出了病情變化與傳統Dsg3抗體滴度不一致的情況，其中6例病情變化與抗構象表位Dsg3抗體有關，5 例在活動期可檢測到AChR 抗體，另外2 例不一致的原因不明確，可能屬于上述第3 種情況，但需要通過對抗體亞型的滴度進行檢測以進一步證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突