中藥調控干細胞Notch信號通路的研究進展※

杜楠楠 汪引芳 張 鵬 劉宗軍

(上海中醫藥大學附屬普陀醫院心內科，上海 200062)

干細胞是一類具有自我復制、自我更新并且能夠保持未分化狀態的多潛能細胞，主要受Notch、Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)、骨形態蛋白(BMP)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等在內的多條信號通路的調控。近年來，中藥對Notch信號通路的調控已成為中醫藥領域的研究熱點，多種中藥通過調節Notch通路，對骨髓間充質干細胞(BMSCs)、腫瘤干細胞(CSCs)、神經干細胞(NSCs)等多種干細胞的增殖、分化、凋亡產生重要影響。茲將中藥調控干細胞Notch信號通路的研究進展綜述如下。

1 Notch信號通路的構成

Notch通路是一條傳導途徑高度保守的信號通路，由Notch基因調控。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體即Delta-Serrate-Lag(DSL)蛋白、DNA結合蛋白、Notch的調節分子和其他效應物等組成。在哺乳動物中，Notch通路涉及4個異寡聚單通道Ⅰ型跨膜受體Notch1～Notch4，以及5個DSL家族配體:Jagged1(JAG1)和Jagged2(JAG2)，Deltalike1(DLL1)、Deltalike3(DLL3)和Deltalike 4(DLL4)，這5個DSL家族配體均屬于Serrate配體家族[1]。配體和受體結合后，經過2次蛋白水解切割，釋放出Notch細胞外結構域，然后與配體一起，被配體表達細胞內吞，并被γ-分泌酶復合物切割，產生活性片段，即Notch細胞內結構域(NICD)。短壽命的NICD被釋放到細胞質中，易位到細胞核中，并與轉錄抑制因子CSL結合以代替輔阻遏復合物。核受體輔阻遏物(N-CoR)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)在復合物中被共激活因子(Maml)和組蛋白乙酰轉移酶(HAT，p300)取代。p300的HAT功能使染色質松弛，導致RNA聚合酶Ⅱ復合物的募集，以啟動Notch下游靶基因發狀分裂相關增強子(HES)、發狀分裂相關增強子相關抑制蛋白(HERP)等堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄抑制因子家族的轉錄，從而發揮生物學作用[2-3]。

2 中藥基于Notch信號通路對BMSCs的調控

BMSCs是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，可分化為軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞、心肌細胞等。近幾年報道指出，Notch通路在BMSCs的分化和增殖中發揮著重要作用[4-6]。中藥通過調控Notch通路來影響BMSCs的增殖和分化主要有以下方式：某些中藥通過激活Notch通路，促進BMSCs向成骨細胞、神經細胞、軟骨細胞等分化，或抑制BMSCs來源的軟骨細胞的肥大和增生；有些中藥通過抑制Notch通路，促進BMSCs向神經細胞、心肌細胞等分化。

2.1 中藥激活Notch通路調控BMSCs的增殖和分化 有研究表明，雙氫青蒿素抑制間充質干細胞(MSCs)分化的軟骨細胞標志物[包括核轉錄因子SOX9和Ⅱ型膠原纖維α1基因(Col2A1)]的表達，下調包括核心結合因子α1或多瘤病毒增強子結合蛋白及急性骨髓性白血病因子(Runx2)的肥大標志物，與激活核轉錄因子紅細胞系-2p45相關因子-2(Nrf2)和Notch信號通路有關[7]。淫羊藿苷通過上調HES1、Runx2 mRNA表達及增加Notch1、轉錄阻遏物C啟動子結合因子-1(CBF1)、JAG1蛋白表達來促進BMSCs增殖向成骨細胞分化，其促進分化的作用與上調Notch信號通路有關[8]。葛根素誘導BMSCs 2～4周后，測定堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)和Notch配體之一DLL4含量增加，提示葛根素能有效誘導BMSCs向成骨方向分化，其作用機制可能與Notch信號通路上調有關[9]。研究發現，姜黃素不影響BMSCs向軟骨細胞分化，但會通過Notch信號通路的傳導抑制軟骨細胞的肥大[10]。蟲草素可促進BMSCs向軟骨方向分化，同時下調Runx2和X型膠原蛋白在內的肥大標志物，通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/同源結構域蛋白(Bapx1)途徑和Notch信號傳導抑制軟骨細胞肥大[11]。補骨脂素能逆轉骨質疏松癥患者BMSCs內已降低的Notch信號通路活性，提高HES1的表達水平，促進成骨分化，同時抑制成脂分化和Notch信號通路活化[12]。周靈通[13]研究表明，使用固本增骨方(藥物組成:炙黃芪、黨參、當歸、炙淫羊藿、燙狗脊、鹽補骨脂)含藥血清體外培養BMSCs，可促進BMSCs的增殖及成骨分化，同時抑制其向成脂方向分化，固本增骨方含藥血清能夠促進Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、BGP、Runx2蛋白表達，這可能與其上調Notch通路中Notch1 mRNA、下調Notch通路中CBF1 mRNA有關。溫智稀等[14]認為，鱉甲煎丸能促進BMSCs分化為肝樣細胞，在使用鱉甲煎丸14 d后Notch1 mRNA水平達到峰值且高于對照組，其作用機制可能與調節BMSCs的Notch信號通路中Notch1蛋白及Notch1 mRNA表達水平有關。邢少娜[15]應用補陽還五湯聯合BMSCs治療腦缺血大鼠，觀察大鼠腦缺血預后，發現腦缺血部位神經損傷癥狀得到明顯改善，其機制可能與Notch信號通路中Notch1、HES1、JAG1蛋白表達水平增高，促進神經干細胞增殖有關。齊墩果酸主要提取自青葉膽全草或女貞子果實中的五環三萜類化合物。研究表明，齊墩果酸及其糖苷可通過抑制破骨細胞的形成來預防骨質流失，并在體外刺激BMSCs的成骨分化，這種作用機制可能與激活Notch信號通路有關[16]。

2.2 中藥抑制Notch通路調控BMSCs的增殖和分化 黃芪甲苷Ⅳ可誘導快速老化小鼠(SAMR1) BMSCs體外分化為神經細胞，誘導分化過程中β-catenin蛋白和mRNA表達增高，Notch1蛋白和mRNA的表達降低，其機制可能與激活Wnt/β-catenin信號通路、抑制Notch通路有關[17]。紅景天苷通過抑制Notch信號通路、激活BMP信號通路促進BMSCs增殖，誘導BMSCs向神經元細胞定向分化[18-19]。謝娟[20]研究表明，益氣活血中藥可以誘導BMSCs向缺血心肌趨化遷移，上調趨化因子受體4(CXCR4)表達，同時下調HES1 mRNA及HES5 mRNA的表達，其作用機制可能為通過抑制BMSCs的Notch信號通路來上調CXCR4的表達，從而發揮促遷移作用。杜紅陽等[21]研究認為，地黃具有滋陰補血、益精填髓功效，地黃多糖為地黃的主要成分之一，在誘導BMSCs向神經樣細胞分化過程中抑制了Notch1、JAG1蛋白和NICD蛋白的表達，Notch信號通路相關分子的mRNA水平均下降，地黃多糖可能通過抑制Notch通路活性從而促進BMSCs向神經樣細胞分化。

3 中藥基于Notch信號通路對CSCs的調控

CSCs可以自我更新、分化，但同時對化療和抗癌藥物具有很強的耐藥性，這些特征導致腫瘤治療過程中容易復發和轉移。研究發現，Notch1表達水平與CSCs標記物乙醛脫氫酶1(ALDH1)顯著相關，Notch信號通路可能與CSCs的增殖、分化、轉移和復發有關[22]。

槲皮素-3-甲基醚是一種存在于各種植物中的天然化合物，已被證明具有有效的抗癌活性。槲皮素-3-甲基醚能抑制細胞中球囊形成及干性相關基因(Sox2)和永生基因(Nanog)的表達，槲皮素能抑制CSCs生長，誘導細胞凋亡，并抑制人乳腺癌細胞的侵襲和遷移，其機制與抑制Notch1的表達，誘導PI3K和Akt的磷酸化有關[23]。楊秦梅等[24]發現，用姜黃素處理后的肺癌干細胞凋亡率顯著升高，Notch1和HES1蛋白的表達明顯下降，說明姜黃素能抑制肺癌干細胞的增殖，誘導其凋亡，機制可能與下調Notch信號通路傳導有關。有報道顯示馬齒莧提取物能夠顯著下調結腸癌細胞和癌癥干細胞中Notch1和β-catenin基因的表達，并呈劑量依賴性抑制結腸癌干細胞的生長，表明其可通過介導Notch信號傳導途徑和調節靶基因發揮作用[25]。異甘草素是從甘草中分離的黃酮類化合物。研究發現，異甘草素可抑制膠質瘤干細胞的生長并減少腫瘤球的形成，誘導膠質瘤干細胞分化為星形膠質細胞和神經元，并下調Notch1和HES1 mRNA和蛋白水平，其機制可能與Notch1信號傳導途徑的下調有關[26]。山姜被證實可以抑制膠質瘤干細胞的增殖和侵襲，同時誘導其凋亡，免疫印跡分析和熒光素酶測定顯示，Notch信號傳導被山姜抑制，可見山姜通過下調Notch通路來抑制神經膠質瘤干細胞的增殖分化[27]。白藜蘆醇是一種多酚植物抗毒素，具有顯著的藥理特性和調節不同癌癥中的多種靶標的能力[28]。研究發現，白藜蘆醇顯著激活膠質母細胞瘤細胞內Notch1通路，并呈時間依賴性恢復野生型p53表達，此外白藜蘆醇和Notch1抑制劑MRK-003同時治療會部分減弱細胞凋亡，并完全阻斷Notch1的活化和野生型p53的增加，證實了白藜蘆醇對膠質母細胞瘤細胞的抗增殖和促凋亡作用是通過上調Notch1信號通路實現的[29]。

4 中藥基于Notch信號通路對NSCs的調控

NSCs具有干細胞的特征，在給予誘導劑的條件下，能夠分化為成神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。許多中藥對NSCs的增殖和分化起著綜合調節作用[30]。其分化作用受多條信號通路的調控，其中Notch通路與NSCs的調節作用相關。

趙克非等[31]研究顯示，健脾益智膠囊(藥物組成：白術、黃芪、制何首烏、人參、石菖蒲、水蛭)能夠提高大腦中動脈栓塞大鼠海馬HES1 mRNA和蛋白表達，其促進缺血后神經干細胞的增殖、分化的功能可能與上調大鼠海馬中Notch1信號通路有關。蛇床子素可以促進NSCs向神經元和少突膠質細胞分化，減少Notch1的基因表達量，其機制可能與蛇床子素抑制Notch信號通路有關[32]。還有報道稱，蛇床子素促進NSCs增殖，從而有效挽救了海馬受損小鼠的神經元，并改善了認知功能障礙，發生機制與激活Notch途徑上調NSCs中自我更新基因Notch1和HES1 mRNA的表達有關[33]。六味地黃湯是中醫經典方劑，具有補腎滋陰、益精填髓功效，研究發現用六味地黃湯灌胃快速衰老小鼠一段時間后，能改善其認知功能，且小鼠腦組織中Notch1、HES1、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達增高，推測其作用機制可能與激活Notch1通路、促進NSCs增殖、分化有關[34]。腦泰方(藥物組成：川芎、黃芪、地龍、僵蠶)提取物能促進大鼠內源性NSCs增殖，提高Notch1蛋白表達水平，作用機制可能與激活Notch1信號傳導有關[35]。劉柏炎等[36]研究表明，齊墩果酸能顯著促進胎鼠NSCs增殖，并呈劑量依賴性增加，但達到一定劑量后有細胞毒性，增殖過程中JAG1 mRNA高表達，由于JAG1為Notch信號通路的主要配體之一，提示齊墩果酸促進NSCs的增殖可能與激活Notch信號通路有關[36]。

5 對其他干細胞的調控

丹參酚酸B(Sal B)通過下調細胞周期蛋白D1和c-Myc，同時抑制Notch1、Notch3、JAG2和下游靶基因HES1、HES5來增強胚胎干細胞向肝細胞分化，表明Sal B通過激活Wnt通路和抑制Notch途徑來實現對胚胎干細胞的調控[37]。有研究表明，扶正化瘀中藥(如丹參、絞股藍、冬蟲夏草等)似乎可以預防肝纖維化進展，改善肝功能，促進人胚胎干細胞向肝細胞分化，這一作用機制是通過激活Wnt、調節蛋白激酶(ERK)通路，抑制Notch途徑來介導[38]。實驗證實，苦參堿含藥血清可下調肝祖細胞JAG1和HES1 mRNA，上調肝細胞標記物白蛋白(Alb)的表達，表明苦參堿可誘導肝祖細胞向肝細胞分化。而這種效應可被含有0.1 mol/L甲狀旁腺激素(Notch信號通路激活劑)補充培養基逆轉，表明苦參堿可能通過抑制JAG 1/HES1信號通路誘導肝祖細胞的肝細胞分化[39]。消痰散結湯(藥物組成：半夏、天南星、茯苓、枳實、陳皮、全蝎、蜈蚣、雞內金、浙貝母、芥子、甘草)可以抑制胃癌干細胞增殖，通過下調Notch通路的傳導，部分減輕腫瘤血管生成[40]。

6 問題與展望

關于中藥通過Notch通路來調控干細胞的研究，國內外不乏相關報道，其中有幾個問題比較突出：①中藥品種多樣，數量豐富，但被納入研究領域的中藥并不多，缺乏探索精神和創新性；②許多中藥復方藥物數目眾多，成分復雜，單一分析一味湯劑的療效，不能精準定位具體的有效組分，某種程度上也是資源浪費；③被研究的干細胞種類較為單一，除BMSCs、CSCs、NSCs外，其他類型的干細胞如胚胎干細胞、造血干細胞、上皮干細胞等研究甚少；④有些中藥通過激活Notch通路發揮作用，而有些中藥則是抑制Notch通路來調控干細胞。總之，中藥是中醫學的瑰寶，將中藥與分子生物學、生理學、藥理學等學科聯系起來，是把中藥推向現代化的重要手段，也為中藥藥效機制的闡明提供了有效依據。