高密度脂蛋白對內皮祖細胞數量、功能的影響及其分子作用機制

郭琪 盛云龍 陳淑芳 段爽 宋智敏 楊娜娜

高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）在膽固醇逆向轉運（reverse cholesterol transport，RCT）中發揮重要作用，低于正常水平的高密度脂蛋白是動脈粥樣硬化的重要危險因素。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在血管內皮的損傷修復中發揮重要作用，低于正常水平的內皮祖細胞也是動脈粥樣發生發展的危險因素。內皮祖細胞水平與高密度脂蛋白水平同步變化，兩者之間可能存在直接的相互作用。內皮血管損傷被認為是動脈粥樣硬化的使動因素，高密度脂蛋白水平、內皮祖細胞水平各自與動脈粥樣硬化存在明顯的負相關關系，提示兩者在疾病發展中的重要作用。研究表明，高密度脂蛋白能夠提高內皮祖細胞的數量及功能，促進其分化，抑制衰老和凋亡，從而增強內皮祖細胞介導的血管內皮修復作用。提高高密度脂蛋白或其有效成分的水平能夠發揮上述作用，遏制或延緩動脈粥樣硬化的發生發展。

為了闡明高密度脂蛋白與內皮祖細胞之間的作用及作用機制，筆者以“高密度脂蛋白，內皮祖細胞”為檢索詞檢索中文期刊數據庫，以“HDL，EPCs”“high density lipoprotein，endothelial progenitor cells”為檢索詞檢索PubMed 數據庫，對搜索到的文獻進行篩選整理。隨后對篩選出的43 篇相關性較強的文獻進行總結闡述。內容如下。

1 內皮祖細胞與動脈粥樣硬化

1.1 內皮祖細胞的特征與確定 內皮祖細胞是一種造血干細胞，在體內分布廣泛，可從骨髓、外周血、臍帶血甚至脂肪組織中獲得，具有分化生成內皮細胞和血管平滑肌細胞的潛能。缺氧環境能夠誘導內皮祖細胞生成新生血管，增強缺血缺氧組織的血供，這種細胞數量減少也被考慮為臨床前動脈粥樣硬化的危險因素。內皮祖細胞能夠吞噬乙酰化低密度脂蛋白（acety-lated low density lipoprotein，ac-LDL），也能夠結合荊豆凝集素-1（ulex europaeus agglutinin-1，UEA-1），實驗中常用Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 標記內皮祖細胞。

根據內皮祖細胞發育的階段和特征可以把內皮祖細胞分為早期內皮祖細胞和晚期內皮祖細胞。早期內皮祖細胞又稱為髓內皮祖細胞（myeloid EPCs）；晚期內皮祖細胞又稱為內皮集落形成細胞（endothelial colony forming cells，ECFCs）。晚期內皮祖細胞成血管能力更強，具有部分內皮細胞的特征和功能，能夠表達內皮型一氧化氮合酶。

1.2 內皮祖細胞的功能及其在動脈粥樣硬化過程中的作用 動脈粥樣硬化的發病機制尚未得到完全闡明，多種學說從不同角度對動脈粥樣硬化進行了闡述。動脈粥樣硬化的危險因素有高脂血癥、代謝綜合征以及繼發高脂血癥的其他疾病，硬化斑塊中還可發現大量的膽固醇結晶及壞死物質，提示發病過程中存在大量血漿脂質向血管內皮以下浸潤。炎癥等因素可以加重內皮細胞損傷，破壞內皮損傷-修復平衡，使血管內膜通透性升高，加速脂質沉積從而導致動脈粥樣硬化[1]。

促進內皮修復是防治動脈粥樣硬化的靶點。血管內皮細胞具有分裂增殖能力，參與血管內皮修復。但成熟內皮細胞能力有限，對于較大規模的內皮損傷無能為力。較大的血管內膜損傷修復可由內皮祖細胞完成。在內皮（血管）修復過程中，內皮祖細胞能夠對血管內皮損傷做出反應，從骨髓中動員增殖分化，遷移至內皮損傷位點發育為成熟內皮細胞。內皮細胞損傷壞死脫落釋放的內皮細胞源微?？赡苁莾绕ぃㄑ埽┬迯瓦^程的誘發因素[2]。

內皮祖細胞還能夠發育成血管平滑肌細胞。血管平滑肌細胞自身是粥樣硬化斑塊纖維帽的重要成分，也是纖維帽基質成分的主要生產者。血管平滑肌細胞及胞外基質組成的纖維帽保護作用遠弱于血管內皮，不能防止血漿內脂質在血管壁內沉積。血管平滑肌細胞自身的增殖和分泌功能反倒會使硬化斑塊擴大，加劇動脈狹窄，不利于動脈粥樣硬化的治療和預后。調控內皮祖細胞的定向分化也可視作動脈粥樣硬化預防治療的靶點。

內皮祖細胞能夠出芽生成新生毛細血管，這一過程可由缺血缺氧組織誘導。內皮祖細胞沿動脈供血毛細血管進入動脈血管壁，在相對缺氧的粥樣硬化斑塊內部形成毛細血管。增強血供，加強斑塊內炎癥反應，降低斑塊的穩定性。硬化斑塊中存在有大量促血栓物質，斑塊內新生毛細血管網使斑塊內的促血栓物質與血液交通，造成血液高凝狀態，促進血栓形成并加劇動脈狹窄。

2 高密度脂蛋白與動脈粥樣硬化

高密度脂蛋白由脂質和蛋白質組成。脂質包括膽固醇和膽固醇酯，蛋白質包括載脂蛋白A1（apolipoprotein A1）、載脂蛋白A2（apolipoprotein A2）和少量的載脂蛋白E。高密度脂蛋白參與膽固醇逆向轉運，調節內皮細胞代謝，具有抗炎作用[3]，具有重要的抗動脈粥樣硬化作用，是抗動脈粥樣硬化過程中的重要成分。

動脈粥樣硬化斑塊中存在泡沫細胞，內含有大量膽固醇及膽固醇酯，是膽固醇逆向轉運過程的主要來源。高密度脂蛋白與泡沫細胞表面的ATP 結合盒轉運蛋白A1（ATP binding cassette A1，ABCA1）分子結合，攝取細胞內的膽固醇及膽固醇酯，并改變外形，從餅狀變成球狀，這也是成熟的過程。成熟高密度脂蛋白回流入肝，與肝細胞表面的清道夫B1 受體（scavenger receptor class B type 1，SR-B1）結合，被肝細胞胞吞吸收，這一過程由高密度脂蛋白中的Apo A1 分子介導。

高密度脂蛋白能夠調節內皮細胞代謝。高密度脂蛋白能夠與內皮細胞表面的SR-B1 結合，升高內皮細胞eNOS 的表達水平[4]，并通過溶血磷脂受體S1P3 加強內皮依賴的血管舒張過程[5]。這一升高eNOS 水平的過程能被抗Apo A1 抗體或抗SR-B1 抗體阻斷。

高密度脂蛋白具有抗炎作用，能從多個途徑抑制內皮細胞凋亡。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是硬化斑塊炎癥反應中重要的細胞因子，能夠上調內皮細胞CPP-32 樣蛋白酶，導致內皮細胞凋亡。高密度脂蛋白能遏制TNF-α 誘導升高的CPP-32 蛋白酶，抑制內皮細胞凋亡。高密度脂蛋白能夠維持內皮細胞線粒體膜電位，減少內皮細胞內活性氧的生成，抑制內皮細胞氧化應激，減少細胞色素C 的釋放，抑制線粒體途徑的細胞凋亡[6]。

高密度脂蛋白的質量及來源對生理效應有重要影響。從2 型糖尿病患者體內提取的高密度脂蛋白與內皮細胞的親和力明顯下降，不能促進內皮依賴的血管舒張功能。這種高密度脂蛋白的脂質過氧化水平顯著高于正常人體內的高密度脂蛋白，可能是功能喪失的重要原因[7]。

載脂蛋白A1 是高密度脂蛋白的標志蛋白質，載脂蛋白A1 抗體能夠阻斷高密度脂蛋白的細胞代謝調節作用。單純使用Apo A1 也能發揮高密度脂蛋白的部分作用。純化的載脂蛋白A1 沒有明顯表現出HDL 的全面活性，因此常用開發的載脂蛋白A1 模擬肽（apolipoprotein A1 mimetic peptide）發揮類似的作用。載脂蛋白A1 模擬肽D-4-F 已經具備了部分高密度脂蛋白的作用及抗動脈粥樣硬化潛能，能夠抑制病毒感染繼發的炎癥反應。載脂蛋白A1 模擬肽又被稱為高密度脂蛋白模擬肽。

3 高密度脂蛋白與內皮祖細胞

高密度脂蛋白含量、總膽固醇/高密度脂蛋白膽固醇比值、甘油三酯/高密度脂蛋白膽固醇比值也與患者的心血管風險密切相關。內皮祖細胞數目與高密度脂蛋白濃度直接相關，但是與低密度脂蛋白含量無關[8]。高密度脂蛋白與內皮祖細胞之間獨立存在的相關關系提示高密度脂蛋白對內皮祖細胞的直接作用及對心血管風險的影響。

3.1 高密度脂蛋白對內皮祖細胞生長特性的影響

3.1.1 高密度脂蛋白促進內皮祖細胞增殖 實驗顯示，健康人體內提取的高密度脂蛋白能夠促進臍帶血源的內皮祖細胞增殖，在一定范圍內，這種促增殖作用具有時間依賴性和濃度依賴性[9]。隨著濃度的升高，高密度脂蛋白對內皮祖細胞的促增殖作用越來越強，當升高到一定程度時，高密度脂蛋白對內皮祖細胞增殖表現出兩重性，在250 μg/mL 以下促進增殖，250 μg/mL 以上抑制增殖。人體內幾乎不可能達到這一濃度，因此抑制作用可忽略不計。臨床試驗中發現，高密度脂蛋白膽固醇確能夠升高人體內的循環內皮祖細胞水平[10]。重組高密度脂蛋白也能發揮相似的作用。

高密度脂蛋白通過縮短細胞增殖周期，促進內皮祖細胞增殖。細胞增殖指數能反映細胞周期，具體計算方式為（S+G2）/（G1+S+G2）。實驗顯示，經過HDL 刺激的內皮祖細胞細胞增殖指數為21.4%，而未經刺激的對照組細胞增殖指數僅為15.3%，提高了40%。細胞增殖指數提高可以反映細胞分離周期縮短[11]。

3.1.2 高密度脂蛋白促進內皮祖細胞分化及抗原表達 高密度脂蛋白能夠促進人外周血單個核細胞（mononuclear cells，MNC）分化成為內皮祖細胞。高密度脂蛋白孵化的MNCs 的DiLDL/lectin 陽性率比空白對照組高出37 個百分點，MNCs 中的eNOS的mRNA 和蛋白質分子含量也得到了顯著升高[12]。DiLDL/lectin 陽性和較高的eNOS 水平是內皮祖細胞的重要特性。這些證據提示高密度脂蛋白加速了人外周血單個核細胞向內皮祖細胞的轉化過程。

3.1.3 高密度脂蛋白促進內皮祖細胞的成血管作用和遷移能力 制取大鼠血管損傷動物模型，再將hEPCs 或者rEPCs 注入模型的血管損傷部位做短暫停留，發現損傷部位內皮細胞的增生及血管修復能力明顯增強，且后者的促進作用要強于前者。E1E2E3 缺失的腺病毒LDL 受體載體（AdLDLr）能夠降低C57BL/6 LDL 受體缺乏小鼠（LDLr-/-）的總體血脂水平，而E1E2E3 缺失的腺病毒人Apo-1 載體（AdA-1）能升高HDL 水平，這些小鼠體內分離出的EPCs 的遷移能力均有明顯增強。NOS 抑制劑（L-NMA）能夠抑制上述作用，提示HDL 發揮促進EPC 遷移的能力可能依賴于NO 合酶的活性，雖然目前尚無證據證明在降低血脂和使用HDL 基因轉移子后NOS 的活性增強[13]。

3.1.4 氧化高密度脂蛋白對內皮祖細胞的反作用 除極高濃度，常規高密度脂蛋白對內皮祖細胞表現為促進作用，從糖尿病患者體內提取的高密度脂蛋白會降低人體體循環內皮祖細胞的水平，提示經過不同來源的高密度脂蛋白具有異質性，人工氧化修飾的高密度脂蛋白具有與之相似的效應。氧化高密度脂蛋白能夠提高內皮祖細胞內ROS 水平，促進內皮祖細胞凋亡，抑制成血管能力和遷移能力[14]。

3.1.5 內皮祖細胞內化吸收高密度脂蛋白 高密度脂蛋白能通過細胞表面途徑刺激內皮祖細胞，內皮祖細胞也能夠通過胞吞作用消化高密度脂蛋白，后一作用可能涉及內皮祖細胞對營養成分的攝取，即通過吸收高密度脂蛋白上的物質組建細胞自身結構。

內皮祖細胞通過胞吞作用攝取高密度脂蛋白，并進行胞內轉運。進入內皮祖細胞的高密度脂蛋白首先存在于與內體同源的內吞囊泡和多囊小體中，隨后發展成溶酶體。含有高密度脂蛋白的溶酶體排列成行，相互之間連續不斷，形成珍珠串樣排列。多囊小體小體內及小體膜上的局限性強染色區域提示高密度脂蛋白在多囊小體中分布并不均勻。多囊小體中還存在有連接多個小囊的復合膜結構。

高爾基體數量增多并移動至細胞核周圍，標記物并未出現在高爾基體內，但高爾基體內反應產物數目升高。內皮祖細胞能夠胞吞高密度脂蛋白，形成早期內體后以囊泡轉運的方式在細胞內轉運。高密度脂蛋白在溶酶體中降解，降解產生的膽固醇和膽固醇油鹽酸進入高爾基體，參與組成細胞膜、內質網、高爾基體及線粒體的膜結構，或以脂滴的形式貯存于細胞內[15]。

3.2 高密度脂蛋白對內皮祖細胞的作用通路

3.2.1 高密度脂蛋白通過SR-B1 受體作用于內皮祖細胞 SR-B1 是清道夫受體超家族的重要成員，該受體高度表達于成熟內皮細胞表面，能夠接受高密度脂蛋白激動，上調內皮細胞eNOS 水平，促進內皮細胞依賴的血管舒張過程，在預防動脈粥樣硬化中發揮重要作用。SR-B1 受體不僅表達于成熟內皮細胞表面，也表達于成熟內皮細胞的前體細胞—內皮祖細胞表面。高密度脂蛋白與內皮祖細胞表面的SR-B1 結合形成復合體，激動下游信號分子，調節內皮祖細胞的結構與功能。SR-B1 受體是內皮祖細胞接受高密度脂蛋白分子刺激的重要受體，是高密度脂蛋白調節血管內皮活性的重要物質基礎。

3.2.2 高密度脂蛋白調節磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphoinostide 3-kinase，PI3K）/Akt 通 路 rHDL促進單個核細胞迅速分化成EPCs，細胞中的PI3K和Akt 水平也顯著升高[16]。PI3K/Akt 通路抑制劑（LY29400210）降低PI3K/Akt 通路活性，抑制促分化作用。提示HDL 是通過此途徑參與調節內皮祖細胞的分化過程。PI3K 具有磷脂酰肌醇激酶的活性和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，是細胞重要的信號調節分子。Akt（蛋白激酶B）是PI3K 的下游分子，與PI3K 聯合構成PI3K/Akt 通路。

3.2.3 高密度脂蛋白升高cyclin D1 水平 HDL 可以促進Akt 的磷酸化過程和cycling D1 的表達，并且在一定范圍內呈時間依賴性和劑量依賴性。在應用了PI3K/Akt 通路抑制劑（LY29400210 10 umol/L）處理后，cyclin D1 蛋白水平開始下降。cyclin D1 是PI3K/Akt 通路的下游分子，可能是高密度脂蛋白促增殖作用的中間產品。

3.2.4 高密度脂蛋白調節pro-MMP-9 水平 骨髓溶解產生的基質細胞衍生因子（SDF-1）能夠上調MMP-9 的 表 達。MMP-9（matrix metallopeptidase-9）又稱金屬基質蛋白酶，能夠促進基質細胞釋放可溶性的Kit-ligand（sKitL），促進內皮細胞和造血干細胞（HSCs）從靜息狀態轉向增殖狀態。sKitL 的釋放可以使骨髓再填充細胞轉移到任意的血管龕內，幫助干細胞或者祖細胞的分化與重建。MMP-9 在骨髓源內皮祖細胞召集動員入血過程中發揮重要作用[17]。HDL 能夠降低人外周血內皮祖細胞內pro-MMP-9 表達水平。pro-MMP-9 是MMP-9 的前體蛋白，經過活化之后發揮蛋白酶作用。提示HDL 能夠促進細胞內原有的pro-MMP-9 向MMP-9 轉化，促進血管新生。HDL 降低pro-MMP-9 水平還可理解成限制細胞溶解細胞外基質的能力，通過這一途徑促進內皮祖細胞黏附及成血管，提高新生血管的穩定性。

3.2.5 高密度脂蛋白上調整合素水平 高密度脂蛋白通過上調β2 和α4 整合素水平發揮作用，提高內皮祖細胞的黏附能力。整合素是細胞間的整聯蛋白，在細胞間的黏附、固定及形態維持中發揮重要作用。激肽釋放酶能夠通過上調整合素αvβ3 水平提高內皮祖細胞黏附能力，提示其與高密度脂蛋白具有協同作用[18]。

3.2.6 高密度脂蛋白升高eNOS 水平 eNOS 是內皮一氧化氮合酶，主要分布于內皮細胞中，利用L-精氨酸和氧生成NO 和L-瓜氨酸。一氧化氮對內皮祖細胞有重要的促進作用，NO 及NO 產生既在促進缺氧組織血管生成過程中、在包括內皮祖細胞在內的干細胞的動員遷移過程中發揮重要作用[19]，eNOS 水平升高可能是內皮祖細胞介導內皮修復的重要環節。高密度脂蛋白能夠提高內皮祖細胞eNOS 表達水平，提高NO 的合成水平，從而促進內皮祖細胞增殖、遷移、分化和成血管。敲除NOS 基因上述功能消失。

3.2.7 高密度脂蛋白降低Caspase-3 水平 高密度脂蛋白能夠降低細胞Caspase-3 水平，從而抑制細胞凋亡。Caspase-3 是Caspace 家族的重要成員，在細胞凋亡過程中發揮重要作用。Caspase（半胱天冬酶/cysteinyl aspartate specific proteinase）活性位點含有半胱氨酸殘基，作用位點為其他蛋白質的天冬氨酸殘基，是細胞內重要的蛋白水解酶家族。

3.2.8 氧化高密度脂蛋白調節CD36/p38 MAPK/NF-κB 通路 內皮祖細胞內存在CD36/p38 MAPK/NF-κB 通路，對氧化高密度脂蛋白激活該通路促進內皮祖細胞凋亡，發揮抑制作用。氧化高密度脂蛋白能夠上調內皮祖細胞CD36 水平，抗CD36 抗體降低氧化高密度脂蛋白對于內皮祖細胞的抑制作用。氧化高密度脂蛋白能升高p38 MAPK 蛋白的磷酸化水平。氧化高密度脂蛋白能夠升高NF-κB 水平。CD36 抗體能降低p38 MAPK 磷酸化水平，還能降低NF-κB 表達水平[20]。CD36 又稱為清道夫受 體B3（scavenger receptor class B member 3，SRB3），是清道夫受體家族的重要成員。清道夫受體家族在人體脂質代謝中發揮重要作用。MAPK 全稱為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），包括4 個家族，p38 是其中之一。MAPK 家族通過磷酸化發揮信號轉導作用，是細胞內重要的信號分子。NF-κB 使細胞基因轉錄的重要調節分子，它的升高預示著細胞凋亡水平的升高。

高密度脂蛋白及內皮祖細胞在數量上同步變化，在動脈粥樣硬化發生、發展、轉歸中均發揮重要作用。高密度脂蛋白能夠增加內皮祖細胞的數量、增強功能，兩者之間存在直接的相互作用。研究高密度脂蛋白相互作用內皮祖細胞的分子機制可以為預防和治療動脈粥樣硬化提供新的研究方向。