全國細菌耐藥監測網網點醫院微生物實驗室質量和能力要求

全國細菌耐藥監測學術委員會

為了保證全國細菌耐藥監測結果的準確性，不斷提高監測工作質量，遏制細菌耐藥性增長，特對影響細菌耐藥性監測結果準確性的因素提出規范性要求，包括檢驗前、中、后全過程，人員、設備、設施、環境、方法學等各方面。

1 人員

微生物實驗室負責人應滿足以下要求：①具有醫學及其相關專業或生物學本科及以上學歷，從事微生物檢驗工作至少3年，或具有醫學及其相關專業專科學歷，從事微生物檢驗工作至少5年；②具有中級或以上專業技術職稱；③具備細菌學檢驗質量控制、生物安全相關知識；④具有培訓、溝通、管理等能力。

負責細菌耐藥監測數據上報人員應從事細菌檢驗工作至少1年，能夠正確使用全國細菌耐藥監測信息系統完成數據上報工作，并應用統計軟件對本院細菌耐藥性監測數據進行分層分析。

從事細菌檢驗的新員工或離崗半年及以上員工經評估合格后方可獨立操作。

從事細菌檢驗人員應相對固定（至少固定2人），數量滿足工作需要，每年需參加專業學習，包括自行組織學習、線上學習、外出學習等形式。

2 設施與環境

設施和環境應與檢測內容相適應。

2.1 布局

微生物實驗室若為獨立單元，應劃分為實驗區和非實驗區。實驗區應具有安全運行、清潔、維護所需空間，有足夠的空間擺放隨時使用的物品；非實驗區應有存放私人物品的設施、工作人員用餐和休息的場所。微生物實驗室若為臨床實驗室的一部分而非獨立單元，可與其他實驗室共享非實驗區。

2.2 設施

2.2.1 溫度、濕度、通風 應依據所用分析設備和實驗過程的要求，制定環境溫度、濕度控制要求并記錄。應有溫度、濕度失控時的處理措施并記錄。

2.2.2 照明 避免陽光直射。燈光能夠分區控制，以便根據需要調節光線。

2.2.3 水槽 安裝足夠的水槽供染色、廢液處理和洗手等使用。洗手水槽應獨立設置，不可與處理標本的水槽混用。水龍頭應為非手觸式，備洗手液。實驗室出口附近應安裝洗手水槽，以供工作人員離開時洗手。

2.2.4 工作臺 工作臺面大小、高度適宜，材料應光滑、致密、耐用，易清潔、消毒，抗污染。放置重型設備的工作臺足夠牢固，減少震動。

2.2.5 其他 應配備個人防護裝備，如護目鏡、防護服、手套、口罩、帽子，以及必要的消防、防盜等安全設施。實驗室應配置不間斷電源（UPS）和/或雙路電源以保證關鍵設備（如需要控制溫度和連續監測的分析儀、培養箱、冰箱等）的正常工作。宜配備含乙醇速干手消毒劑。

2.3 生物安全

微生物實驗室是對病原菌進行分離、培養、鑒定等臨床檢測工作的特殊場所，其設計和管理應在風險評估的基礎上，確定實驗室生物安全水平，確保工作人員在安全的條件下開展工作，遵循安全、舒適、高效的原則，須滿足以下基本要求：①至少符合生物安全2 級（BSL2）標準；②盡可能減少病原菌對實驗室內部以及外部環境的污染；③有足夠空間放置儀器設備，工作人員能夠安全地從事檢驗工作和質量控制活動。

國家衛生健康委員會（原衛生部）制定的《人間傳染的病原微生物名錄》明確規定了各種病原體操作的防護要求，檢驗過程中發現高致病性病原體時，應按相關法規的要求處理。

由于實驗室可能接觸高于預期風險的標本，故具有潛在生物危害的標本應在生物安全柜中開蓋、處理。信息有限標本的風險評估可參考醫學、流行病學資料，如發病率、病死率、可疑傳播途徑、暴發調查資料、標本來源地信息。

3 設備和試劑

實驗室設備的種類和數量應能滿足臨床需要，至少包括：生物安全柜、CO2培養箱、普通培養箱（包括溫度可調培養箱）、冰箱、光學顯微鏡、細胞離心機、組織碾磨器具、游標卡尺（適用時），以及與細菌分離、培養、鑒定、藥物敏感性試驗相適應的試劑（含培養基、質控菌株等）。

3.1 設備校準和計量學溯源

新設備經性能驗證，且滿足要求方可用于患者標本檢測。

應遵循國家、行業要求制定設備和試劑校準、檢定周期，并保存記錄。鑒定儀、藥敏儀、血培養儀的校準應滿足制造商的要求，其他建議如下：①每12個月進行檢定或校準的設備宜包括生物安全柜（高效過濾器、氣流、負壓等參數）、CO2培養箱（CO2濃度顯示計、溫度顯示器或溫度計）、細胞離心機、壓力滅菌器、游標卡尺、普通培養箱（溫度顯示器或溫度計）、溫度計、移液器、微量滴定管或自動分配器。②每6 個月進行檢定或校準的設備應包括濁度儀。③保存儀器功能監測記錄的設備宜包括溫度依賴設施（冰箱、培養箱、水浴箱、加熱塊等每日記錄溫度）、CO2培養箱（每日記錄CO2濃度和溫度）、超凈工作臺（定期做無菌試驗）、壓力滅菌器（至少每個滅菌包外貼化學指示膠帶、內置化學指示卡，定期進行生物監測）。

3.2 設備維護與維修

制定預防性維護計劃并記錄的設備至少應包括：生物安全柜、CO2培養箱、鑒定儀、血培養儀、壓力滅菌器、超凈工作臺、顯微鏡和離心機。

如果設備故障影響了方法學性能，如自動化藥敏儀器的光學系統故障，在設備修復、校準后，實驗室應通過檢測質控菌株或已知結果標本的方式進行性能驗證。

3.3 試劑和耗材驗收

試劑和耗材驗收試驗應符合如下要求：①新批號及每一貨次試劑和耗材使用前，通過新舊批號平行實驗或常規質控等方法進行驗證，并記錄。②新批號及每一貨次試劑和耗材，如吲哚試劑，桿菌肽，奧普托辛，Ⅹ、Ⅴ、ⅩⅤ 因子紙片等使用陰性和陽性質控菌進行驗證。③新批號及每一貨次的藥敏試驗紙片使用前以標準菌株進行驗證。④新批號及每一貨次的染色劑（如革蘭染色）使用已知陽性和陰性（適用時）的質控菌株進行驗證。⑤新批號及每一貨次直接抗原檢測試劑（無論是否含內質控）使用陰性和陽性外質控進行驗證。⑥培養基外觀良好（平滑、水分適宜、無污染、適當的顏色和厚度，試管培養基濕度適宜），新批號及每一貨次的商品或自配培養基應檢測相應的性能，包括無菌試驗、生長試驗或與舊批號平行試驗、生長抑制試驗（適用時）、生化反應（適用時）等，應以質控菌株進行驗證。⑦一次性定量接種環每批次抽樣驗證。

3.4 自配試劑和耗材記錄

自配試劑或培養基，應記錄制備過程，內容至少包括：①培養基（試劑）名稱和類型；②配制日期和配制人員；③培養基（試劑）的體積；④分裝體積；⑤成分及其含量、制造商、批號；⑥最初和最終pH值（適用時）；⑦無菌措施，包括實施的方式、時間和溫度（適用時）；⑧儲存條件及時間。

4 檢驗前過程

4.1 標本采集手冊

實驗室應遵循行業標準或指南編寫、定期審核標本采集和運送標準化操作程序供醫務人員查閱并遵照執行（相關技術資料可參考有關文獻）。

“標本采集手冊”除符合通用要求外，還應明確規定以下內容：①不同部位標本的采集方法，如明確說明并執行血培養標本采集的消毒技術、采血量。診斷成人不明原因發熱、血流感染時應在24 h內不同部位至少采集2套，每套2瓶（需氧、厭氧各一瓶）；②合格的標本類型、送檢次數、標本量；③明確規定需要盡快運送的標本；④合適的運送培養基；⑤延遲運送標本的保存方法及期限；⑥安全運送方法（如密封容器、無標本外漏等）。

4.2 申請單信息

除一般要求外，應標明標本來源和種類，必要時說明感染類型和/或目標微生物、抗菌藥物使用信息。

4.3 標本采集和運送

應遵循實驗室制定的“標本采集手冊”采集和運送標本。醫務人員應記錄標本采集時間，并盡可能記錄患者自采標本的采集時間。

4.4 標本接收

實驗室接收的所有標本均應進行紙質或電子登記，記錄接收時間，拒收以下標本：①容器不適合或泄漏，如培養標本未置無菌容器或標本滲漏；②標本錯誤或不恰當，如培養標本含甲醛等固定液、Foley導尿管頭培養、拭子干涸；③送檢時間延遲或轉送溫度不適合。

5 檢驗過程

實驗室應遵循行業標準或指南制定合格標本（或不合格標本）標準、各種標本處理的標準化操作程序、標本保留期限（用于核對或必要的補充試驗），宜建立緊急檢查程序，明確需要緊急處理的標本類型、檢驗項目，并遵照執行（相關技術資料可參閱有關文獻）。

5.1 細菌培養和鑒定

所選擇的涂片、染色技術、培養基、培養環境應能識別、分離相應病原菌；鑒定方法應符合相關要求，如：通過革蘭染色、菌落形態、生長條件、代謝反應、生化和酶活性、血清學、抗菌藥物耐藥譜等特性鑒定。

組織標本應碾磨后檢驗；痰培養應先染色鏡檢評估標本合格性，至少接種血平板和巧克力平板；尿液常規進行定量培養（菌落計數），能分離、鑒定革蘭陽性和/或革蘭陰性細菌；腦脊液培養標本立即處理，常規進行離心、革蘭染色，至少接種血平板和巧克力平板，能分離常見苛養菌；陽性血培養瓶，根據直接涂片結果轉種相應的培養基及培養環境。血平板和巧克力平板，均應置CO2環境培養。

當流行病學或感染控制需要時，實驗室應進行相應檢測或將菌株送有條件的實驗室進行檢測。建議有條件的實驗室建立相關檢測技術，以滿足流行病學或感染控制需要。

5.2 抗菌藥物敏感性試驗

應遵循“全國細菌耐藥監測網技術方案”、行業標準、制造商建議，盡量包括本醫院臨床常用抗菌藥物，制定常規藥敏試驗方法的標準化操作程序，包括藥敏試驗操作步驟、各類病原體和/或標本的檢測藥物、質控方法和標準、結果報告和解釋，特殊耐藥性檢測方法，少見藥敏試驗結果的處理步驟等。

抗菌藥物敏感性試驗方法包括紙片擴散法、稀釋法（瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法）、濃度梯度擴散法（E試驗）或自動化儀器檢測。實驗室應提供與服務相適應，且滿足“全國細菌耐藥監測網技術方案”的抗菌藥物敏感性試驗。

應在技術方案、行業標準、制造商文件更新6個月內完成抗菌藥物敏感性試驗方法標準化操作程序的修訂并實施。

除常規藥敏試驗方法外，宜利用經評估的分子技術快速檢測、鑒定臨床分離菌株或標本（含血培養陽性培養基）中的病原體，以及細菌的耐藥性。

6 檢驗后過程

6.1 結果報告

盡快報告結果，為診斷、治療、預防提供信息。宜開展分級報告，如無菌體液、組織標本涂片或濕片鏡檢結果、快速鑒定結果、藥敏試驗結果等。

出現對患者處理具有重要意義的結果時，應立即通知臨床醫師或相關人員。如血培養陽性結果、腦脊液顯微鏡檢查及培養陽性結果、法定傳染病等。

應報告具有臨床意義的結果。結果報告應與檢驗內容一致，如糞便沙門菌、志賀菌培養，報告為“未檢出沙門菌、志賀菌”。

藥敏報告應注意標本類型、細菌種類等，如糞便分離的傷寒沙門菌只報告氨芐西林、一種氟喹諾酮類藥物和甲氧芐啶-磺胺甲唑。藥敏報告單除一般信息外，應至少包括細菌名稱、藥物名稱、折點、MIC值或抑菌圈直徑、結果解釋，不報告替代藥物的藥敏試驗結果。

疑似醫院感染暴發時，應立即報告醫院感染控制相關人員。

6.2 菌種保存

實驗室應遵照國家法令法規，如中華人民共和國國務院發布的《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等，制定菌種保存規定，嚴格管理菌種，保證有效、安全使用。

實驗室應保存質控菌株，包括標準菌株、經證實的其他來源菌株。

菌種應有專人保管，詳細記錄名稱、編號、來源、保存日期、傳代等，不得擅自處理或帶出實驗室，如確需帶離實驗室，應做詳細記錄。

6.3 檢驗后標本的處置

檢驗后標本、污染培養基等感染性廢棄物應在實驗區域內消毒或去污染。如果在處理前運送，也應置防穿刺、防滲漏容器，并適當標記和記 錄。

6.4 耐藥監測數據統計

至少每年進行一次本機構耐藥監測數據統計，并將結果發布給臨床及相關人員，發現新的流行趨勢時，應立即報告相關人員。

7 質量控制及質量改進

7.1 標本

全國細菌耐藥監測網網點醫院應根據本院實際開展標本質量控制和改進工作。每年至少制定一種標本質量改進目標，并定期向相關部門（醫務處、護理部和/或臨床科室等）反饋、評估。

實驗室應制定合格痰培養標本標準、不合格痰標本處理方法，并遵照執行。提倡實驗室對有意義的培養標本實施直接顯微鏡檢查及分級報 告。

7.2 抗菌藥物敏感性試驗

實驗室引進抗菌藥物敏感性試驗新方法時，應以標準菌株連續檢測20～30 d，每組藥物/細菌超出參考范圍（抑菌圈直徑或MIC值）的頻率應不超過（≤）1/20或3/30；也可采用替代質控方案，即連續5 d，每天對每組藥物/細菌重復測定3次，每次單獨制備接種物，15個數據超出參考范圍（抑菌圈直徑或MIC值）的結果應不超過（≤）1個，若失控結果為2～3個，則如前述，再進行5 d，每天3次重復試驗，30個數據失控結果應不超過（≤）3個。此后，應每周使用標準菌株進行質控。若檢測頻率低于每周1次，則每個檢測日應進行質控。采用自動或半自動儀器檢測MIC時，應按照制造商的要求進行質控。

7.3 使用中試劑

實驗室應制定使用中試劑質量控制周期和方法，滿足以下要求：①使用中的染色劑，宜每周（如革蘭染色，若檢測頻率低于每周1次，則實驗當日）、當日（如抗酸染色）或每次（如抗酸桿菌熒光染色）用已知陽性和陰性（適用時）質控菌株檢測。②凝固酶、過氧化氫酶、氧化酶、β內酰胺酶，實驗當日應做陰性和陽性質控，商業頭孢菌素試劑的β內酰胺酶試驗應遵循制造商的建議。診斷性抗血清試劑，實驗當日至少應做多價血清陰性和陽性質控。定性試驗試劑每次檢測時應至少包括陽性和陰性質控菌株。不含內質控的直接抗原檢測試劑，實驗當日應檢測陽性和陰性質控。

7.4 質控品

應貯存與診斷相配套的質控物，以便在染色、試劑（包括培養基）、試驗、鑒定系統和抗菌藥物敏感性試驗中使用。最理想的質控菌是標準菌株，但實驗室難以獲得與其檢測能力相應的所有標準菌株，可依次選擇標準菌株、能力驗證或室間質評菌株，以及其他來源的已知菌株用于質量控制。

藥敏試驗應選用標準菌株。藥敏試驗質控所用標準菌株和藥物的種類和數量應覆蓋向臨床報告藥敏試驗結果的菌種和藥物種類。實驗室應保存標準菌株的來源、傳代等記錄，并有證據表明標準菌株性能滿足要求，至少貯存以下標準菌株：大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、銅綠假單胞菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌ATCC 25923（紙片法）、金黃色葡萄球菌ATCC 29213（稀釋法）、肺炎鏈球菌ATCC 49619、糞腸球菌ATCC 29212（稀釋法）、流感嗜血桿菌ATCC 49247或ATCC 49766（取決于所測試藥物）。

7.5 檢驗結果一致性

實驗室應制定人員比對程序，規定由多名專業人員實施的手工檢驗項目的驗證方法和判斷標準，定期進行工作人員的能力比對，至少包括顯微鏡檢查、培養結果判讀、抑菌圈測量、結果報 告。

7.6 檢驗結果準確性

應有證據表明臨床檢驗及細菌耐藥監測結果的準確性，內容至少包括細菌分離（包括苛養菌）、鑒定、藥敏試驗。通常以參加能力驗證或室間質量評價活動且獲得合格結果來證明。實驗室應保留參加能力驗證/室間質評活動的原始記錄、結果和證書。

檢驗結果準確性評價應由從事常規工作的人員使用與患者標本相同的檢驗方法進行。禁止與其他實驗室核對檢測結果。對“不滿意”和“不合格”的評價結果需進行分析，采取糾正措施并記錄。