丹桃金提取物對慢性鉛中毒模型小鼠肝、腎氧化應(yīng)激損傷的改善作用研究

張永昕 曹春芽 龔明

摘 要 目的：研究丹桃金（丹參、桃仁、郁金）提取物對慢性鉛中毒模型小鼠腎、肝氧化應(yīng)激損傷的改善作用。方法：將72只小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照組（二巰基丁二酸，70 mg/kg）和丹桃金提取物低、中、高劑量組（20、40、60 g/kg），每組12只。除正常對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射醋酸鉛溶液20 mg/kg（隔日1次，連續(xù)20 d）建立慢性鉛中毒模型。建模完成后，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積水，每日1次，連續(xù)20 d。末次給藥后，稱定小鼠體質(zhì)量，計算臟器（腎臟、肝臟）系數(shù)，采用全自動生化檢測儀檢測血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）水平，蘇木精-伊紅染色法觀察肝、腎組織病理學(xué)特征，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測肝、腎組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組和丹桃金提取物各劑量組小鼠體質(zhì)量（高劑量組除外）和SOD（高劑量組除外）、GSH-Px水平均顯著降低，腎臟系數(shù)（高劑量組除外）、肝臟系數(shù)（低、中、高劑量組除外）和BUN（高劑量組除外）、Scr、AST（高劑量組除外）、ALT、MDA水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），腎小球、腎小管上皮細(xì)胞萎縮，肝細(xì)胞排列松散及部分細(xì)胞壞死。與模型組比較，陽性對照組和丹桃金提取物各劑量組小鼠體質(zhì)量和SOD、GSH-Px水平均顯著升高，腎臟系數(shù)、肝臟系數(shù)和BUN、Scr、AST、ALT、MDA水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;且丹桃金提取物中、高劑量組小鼠肝、腎組織病理學(xué)變化顯著改善。結(jié)論：丹桃金提取物對慢性鉛中毒模型小鼠肝、腎氧化應(yīng)激損傷均有改善作用，其作用機(jī)制可能與消除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)抗氧化防御能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞 丹桃金提取物;慢性鉛中毒;氧化應(yīng)激;抗氧化;小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the improvement effects of Dantaojin （Salvia miltiorrhiza， Persicae Semen， Curcumae Radix） extract on oxidative stress of liver and kidney in chronic lead poisoning model mice. METHODS： Totally 72 mice were randomly divided into normal control group， model group， positive control group （dimercaptosuccinate， 70 mg/kg）， Dantaojin extract low-dose， medium-dose and high-dose groups （20， 40， 60 g/kg）， with 12 mice in each group. Except for normal control group， other groups were given intraperitoneal injection of lead acetate solution 20 mg/kg （every other day， consecutive 20 days） to establish chronic lead poisoning model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically， normal control group and model group were given constant volume of water intragastrically， once a day， for consecutive 20 days. After last medication， body weight of mice was weighed， and organ coefficients （kidney and liver） were calculated. Serum levels of ALT， AST， BUN and Scr were determined by automatic biochemical detector. HE staining was used to observe histopathological features of liver and kidney. ELISA method was used to determine the levels of GSH-Px， SDO and MDA in liver and renal tissue. RESULTS： Compared with normal control group， body weight （except for high-dose group）， the levels of SOD （except for high-dose group） and GSH-Px were all decreased significantly in model group and Dantaojin extract groups， while the renal coefficients （except for high-dose group）， liver coefficients （except for low-dose， medium-dose and high-dose group）， the levels of BUN （except for high-dose group）， Scr， AST （except for high-dose group）， ALT and MDA were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The epithelial cells of glomerulus and renal tubules were atrophied， the arrangement of hepatocytes was loose and some cells were necrotic. Compared with model group， body weight， the levels of SOD and GSH-Px were increased significantly in positive control group and Dantaojin extract groups， while the renal and liver coefficients， the levels of BUN， Scr， AST， ALT and MDA were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Histopathological features of liver and renal tissue were improved significantly in Dantaojin extract medium-dose and high-dose groups. CONCLUSIONS： Dantaojin extract could improve oxidant stress injury in liver and renal tissue， the mechanism of which may be associated with eliminating reactive oxygen radicals， inhibiting lipid peroxidation and enhancing antioxidant defense ability.

KEYWORDS ? Dantaojin extract; Chronic lead poisoning; Oxidative stress; Anti-oxidation; Mice

隨著國民經(jīng)濟(jì)水平的不斷提升以及工業(yè)化生產(chǎn)中鉛的大量使用，致使鉛污染已成為目前主要的環(huán)境問題之一。人體與鉛接觸后，鉛可經(jīng)呼吸道、消化道進(jìn)入并蓄積于人體內(nèi)，對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p害[1]。慢性鉛中毒的臨床表現(xiàn)是非特異性的，主要包括學(xué)習(xí)記憶力下降，貧血，心臟、肝臟、睪丸等器官功能損傷[2-6]。已有研究表明，氧化應(yīng)激是鉛中毒的機(jī)制之一，鉛能增加細(xì)胞活性氧，改變抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化水平，破壞機(jī)體抗氧化防御體系，引起細(xì)胞的氧化損傷[7-9]。目前，臨床上使用的藥物主要以依地酸二鈉鈣、二巰丁二酸鈉為代表，其機(jī)制主要是通過鰲合體內(nèi)的鉛以促進(jìn)其排泄，但是此類藥物易引發(fā)人體電解質(zhì)紊亂的不良反應(yīng)[10]。已有研究表明，中藥對疾病的治療具有多組分、多靶點、多環(huán)節(jié)、毒副作用小的特點[11-12]，因而從中藥中尋找預(yù)防與治療慢性鉛中毒的安全藥物具有廣闊的前景。

傳統(tǒng)的化瘀解毒方由丹參、桃仁、郁金、炙大黃、甘草、綠豆、土茯苓、昆布、金銀花、木通、澤瀉和金錢草組成，具有化瘀行滯、解毒利濕、祛邪的功效，臨床上將其用于防治職業(yè)性鉛中毒取得了良好的效果[13]。為簡化組方成分，本課題組對其中丹參、桃仁、郁金等3種主要藥材進(jìn)行研究。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子，郁金為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling、姜黃Curcuma longa L.、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang或蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Val.的干燥塊根[14]。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參可改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)中樞作用，并具有抗氧化活性[15];桃仁具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化的藥理作用[16-17];郁金具有抑制中樞神經(jīng)、改善血液流變性、抗自由基損傷、保護(hù)肝臟等作用[18]。基于此，本文研究了丹桃金（丹參、桃仁、郁金）提取物對慢性鉛中毒模型小鼠腎、肝氧化應(yīng)激的改善作用，旨在為臨床治療鉛中毒提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7600型全自動生化檢測儀（日本Hitachi公司）;NE600型光學(xué)顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丹參、桃仁、郁金藥材均購自懷化龍源大藥房連鎖有限公司，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院周群副教授鑒定分別為S. miltiorrhiza的干燥根和根莖、P. persica的干燥成熟種子、C. wenyujin的干燥塊根。醋酸鉛（上海滬試化工有限公司，批號：20170321）;二巰基丁二酸原料藥（DMSA，陽性對照，美國Sigma公司，純度：98%）;蘇木精-伊紅（HE）染液[基爾頓生物科技（上海）有限公司，批號：20170713];天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號：20170522）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號：20170526）、血清尿素氮（BUN，批號：20170812）、血肌酐（Scr，批號：20170520）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號：20170815）、丙二醛（MDA，批號：20170514）、超氧化物歧化酶（SOD，批號：20170720）檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純化水。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠72只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2016-0041。

2 方法

2.1 丹桃金提取物的制備

分別取丹參14.0 g、桃仁7.0 g、郁金8.5 g（藥材比例參考化瘀解毒方和2015年版《中國藥典》設(shè)置），共3份，加9倍量（mL/g）70%乙醇回流提取1.5 h，提取液分別濃縮至質(zhì)量濃度2、4、6 g/mL（以生藥總量計），備用。

2.2 DMSA、醋酸鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取DMSA和醋酸鉛適量，分別以水溶解、稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為7、2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.3 分組、造模與給藥

將小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照組和丹桃金提取物低、中、高劑量組，每組12只。除正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其余各組小鼠均腹腔注射醋酸鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mg/kg，隔日1次，連續(xù)20 d，建立慢性鉛中毒模型。建模完成后，陽性對照組小鼠灌胃DMSA標(biāo)準(zhǔn)溶液70 mg/kg，丹桃金提取物低、中、高劑量組小鼠分別灌胃丹桃金提取物20、40、60 g/kg（以生藥量計），正常對照組和模型組小鼠均灌胃等體積水，每日1次，連續(xù)20 d。各藥物組的給藥劑量均根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置。

2.4 標(biāo)本采集與處理

末次給藥后，小鼠禁食不禁水24 h，稱定其體質(zhì)量后，于眼眶取血0.1 mL，處死，迅速摘取小鼠的腎臟和肝臟，用生理鹽水洗凈，吸干水分，稱定質(zhì)量。取左腎和部分肝組織，用10%甲醛溶液固定，用于組織病理學(xué)觀察;右腎以及剩余部分肝組織低溫（-20 ℃）冷凍保存，用于進(jìn)行氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測。

2.5 小鼠臟器系數(shù)計算

按如下公式計算各組小鼠的肝/腎臟系數(shù)：肝/腎臟系數(shù)（%）=肝/腎臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

2.6 小鼠血清生化指標(biāo)測定

取“2.4”項下血樣，以3 000 r/min離心3 min，分離血清，采用全自動生化檢測儀測定各組小鼠的腎臟指標(biāo)（BUN、Scr）和肝臟指標(biāo)（ALT、AST）水平。嚴(yán)格按試劑盒說明書方法操作。

2.7 小鼠組織病理學(xué)特征觀察

取“2.4”項下用10%甲醛溶液固定后的腎組織和肝組織適量，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后，切片（厚度約3 μm），二甲苯溶液脫蠟，HE染色，脫水，封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠腎組織和肝組織病理學(xué)特征。

2.8 小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

取“2.4”項下低溫冷凍保存的腎組織和肝組織適量，放置至室溫，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）以酶標(biāo)儀檢測各組小鼠腎組織和肝組織中GSH-Px、SOD、MDA水平。嚴(yán)格按照各試劑盒說明書操作。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和雙尾t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量與臟器系數(shù)

與正常對照組比較，模型組和丹桃金提取物低、中劑量組小鼠的體質(zhì)量均顯著降低，腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)（低、中劑量組除外）均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組和丹桃金提取物各劑量組小鼠的體質(zhì)量均顯著升高，腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。丹桃金提取物對模型小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響見表1。

3.2 小鼠血清腎臟指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組和丹桃金提取物各劑量組小鼠血清BUN（高劑量組除外）和Scr水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和丹桃金提取物各劑量組小鼠血清BUN和Scr水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。丹桃金提取物對模型小鼠血清BUN和Scr水平的影響見表2。

3.3 小鼠血清肝臟指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組和丹桃金提取物各劑量組小鼠血清AST（高劑量組除外）和ALT水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和丹桃金提取物各劑量組小鼠血清AST和ALT水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。丹桃金提取物對模型小鼠血清AST和ALT水平的影響見表3。

3.4 小鼠組織病理學(xué)特征

3.4.1 腎臟 正常對照組小鼠腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，組織無明顯病理學(xué)變化。模型組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)模糊，腎小球、腎小管上皮細(xì)胞呈萎縮狀態(tài)。與模型組比較，陽性對照組和丹桃金提取物中、高劑量組小鼠腎組織病理學(xué)變化均明顯改善;丹桃金提取物低劑量組小鼠腎組織病理學(xué)變化雖有改善，但不明顯。各組小鼠腎組織病理學(xué)特征顯微圖見圖1。

3.4.2 肝臟 正常對照組小鼠肝細(xì)胞排列緊密、結(jié)構(gòu)完整，均無腫脹，組織無明顯病理學(xué)變化。模型組小鼠肝細(xì)胞排列松散，出現(xiàn)細(xì)胞空泡，有部分細(xì)胞壞死。與模型組比較，陽性對照組和丹桃金提取物中、高劑量組小鼠肝組織病理學(xué)變化均明顯改善;丹桃金提取物低劑量組小鼠肝組織病理學(xué)變化雖有改善，但不明顯。各組小鼠肝組織病理學(xué)特征顯微圖見圖2。

3.5 小鼠組織內(nèi)SOD、GSH-Px、MDA水平

與正常對照組比較，模型組和丹桃金提取物各劑量組小鼠腎組織和肝組織中SOD（高劑量組除外）和GSH-Px水平均顯著降低，MDA水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和丹桃金提取物各劑量組小鼠腎組織和肝組織中SOD和GSH-Px水平均顯著增加，MDA水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。丹桃金提取物對模型小鼠腎組織和肝組織中SOD、GSH-Px、MDA水平的影響見表4、表5。

4 討論

鉛經(jīng)呼吸道、消化道進(jìn)入人體，其主要分布在血液、腎臟、肝臟中，最終破壞器官與組織的生理功能[19-20]。腎臟和肝臟作為敏感靶器官，鉛進(jìn)入機(jī)體內(nèi)會引起其一系列生理、生化指標(biāo)的變化。臨床上以AST、ALT作為肝臟的檢測指標(biāo)，以BUN、Scr作為腎臟的檢測指標(biāo)。當(dāng)鉛誘導(dǎo)肝臟功能受損時，肝臟中的AST、ALT進(jìn)入血液，使得血清中AST、ALT水平升高;當(dāng)腎功能受損時，腎小球濾過功能降低則會導(dǎo)致BUN、Scr水平升高。本研究組織病理學(xué)特征和腎臟、肝臟指標(biāo)觀察/檢測結(jié)果均顯示，鉛能誘導(dǎo)小鼠腎臟、肝臟損傷，提示鉛中毒模型建立成功。經(jīng)丹桃金提取物處理后，上述指標(biāo)均有所改善，提示其能一定程度地改善鉛誘導(dǎo)的小鼠腎臟、肝臟的損傷。

已有研究顯示，SOD、GSH-Px抗氧化酶系在氧化應(yīng)激中具有重要的防御作用[21-22]。SOD可催化超氧陰離子，清除多余的超氧根離子[23];GSH-Px能保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化物的損傷[24]。MDA作為脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，能改變細(xì)胞膜流動性、通透性[25]。由此可見，上述指標(biāo)可直接反映機(jī)體清除自由基的能力。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，丹桃金提取物可提升模型小鼠腎組織和肝組織中的GSH-Px和SOD水平，降低MDA水平，表明丹桃金提取物可能是通過消除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)抗氧化防御能力來改善小鼠腎、肝組織因鉛中毒所造成的損傷。

綜上所述，丹桃金提取物對慢性鉛中毒模型小鼠肝、腎氧化應(yīng)激損傷均有改善作用，其作用機(jī)制可能與消除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)抗氧化防御能力有關(guān)。

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（收稿日期：2020-04-08 修回日期：2020-11-26）

（編輯：鄒麗娟）