防己諾林堿對結腸癌細胞惡性生物學行為及HIF-1α/VEGF/Akt通路的相關性研究①

望永鼎 劉文華 翟一飛 張 濤

(商丘醫學高等?？茖W校外科，商丘 476000)

結腸癌是發生在結腸部位的消化道惡性腫瘤，發病率已經是惡性腫瘤的第3位，死亡率已達第4位，并且其發病率和死亡率還呈逐年上升的趨勢，因此有必要尋找新的治療藥物[1]。防己諾林堿(Fangchinoline，FAN)是防己科防己干燥根中生物堿的主要提取物，其是一種結構復雜的雙芐基異喹啉類生物堿，具有抗炎鎮痛、利尿消腫和抑制腫瘤等作用[2]。防己諾林堿可以通過多種信號通路來抑制多種腫瘤的發展：防己諾林堿通過抑制Akt和Akt介導的信號級聯反應的激酶活性來抑制人膠質母細胞瘤細胞的生長和侵襲[3]；防己諾林堿通過抑制FAK的磷酸化來抑制黑色素瘤細胞的生長和轉移[4]；防己諾林堿通過抑制PI3K和下游信號通路抑制人骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和腫瘤發生等[5]。但是防己諾林堿對結腸癌作用并不清楚。低氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是一種異源二聚體轉錄因子，主要作為細胞氧平衡和缺氧誘導基因表達的中心調節子；血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)能夠促進腫瘤新血管的生成和通透性的增加，是HIF-1α的靶基因之一；蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)是一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，執行血管生成，細胞代謝等各種細胞功能[6-9]。本文主要研究防己諾林堿對結腸癌的作用以及與HIF-1α/VEGF/Akt通路的相關性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 PRMI1640細胞培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購于深圳市偉通生物科技有限公司；BCA試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Transwell小室購自美國 Corning 公司；Ki67、 PCNA、 E-cadherin、N-cadherin、 HIF-1α、VEGF、 Akt單克隆一抗和二抗均購自英國Abcam公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.1.2儀器 MD全自動顯微鏡購自美國Molecu-lar Devices公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠。

1.1.3細胞 結腸癌細胞HT-29購自上海賽默生物科技發展有限公司；

1.1.4動物 40只裸鼠購自河南省醫療器械，許可證：SYXK(豫)2017-0010。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HT-29細胞培養于PRMI1640細胞培養基(含 10% FBS、1% 青霉素、1% 鏈霉素)中，在37℃、CO25%、飽和濕度90%的恒溫箱中培養到貼壁生長到 80%，便可消化傳代培養。

1.2.2實驗分組及處理 設置Blank cells 組，FAN(5 μg/ml)組、FAN(10 μg/ml)組和FAN(20 μg/ml)組；Blank cells 組HT-29細胞正常培養；FAN(5 μg/ml)組、FAN(10 μg/ml)組和FAN(20 μg/ml)組HT-29細胞分別用5、10、20 μg/ml FAN處理48 h。

1.2.3克隆形成實驗 將HT-29細胞介入6孔板，約3×102個/孔。貼壁后分別加入含有5、10和20 μg/ml FAN的培養基孵育，2 d更換更換一次培養液。15 d后，棄去培養基，用4% 的多聚甲醛固定細胞，然后用結晶紫染色。拍照并計算克隆形成率：克隆形成率(%)=細胞克隆數均值/鋪板細胞總數×100%。

1.2.4Western blot檢測 將處理后的細胞沖洗后加入RIPA蛋白裂解液，離心之后取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每個樣本取30 μg進行SDS-PACE，半干法將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫下用10% 脫脂奶粉封閉1 h；然后加入對應的一抗(Ki67、 PCNA、 E-cadherin、N-cadherin、 HIF-1α、VEGF、 Akt均稀釋1∶500，GAPDH為1∶1 000)4℃過夜；接著用磷酸緩沖液沖洗后加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫下孵育2 h；最后，ECL 顯影后掃描，蛋白相對表達量以GAPDH 為內參校正后，經Quantity-One軟件分析。

1.2.5Transwell檢測 取對數期的HT-29細胞，用胰蛋白酶消化后，離心棄上清，按照不同分組分別加入含有不同濃度FAN的不含有胎牛血清的細胞培養液懸浮細胞(濃度為2×105個/ml)，取200 μl加入上室，在外室加入500 μl含有 10%胎牛血清的細胞培養液。培養 48 h 后，將小室取出，用 90%的乙醇溶液固定；然后用 PBS 洗滌后；接著1%的結晶紫染色；最后，在顯微鏡下隨機選擇視野并計算侵襲細胞數目。

1.2.6體內實驗 用1 ml注射器吸取配制好的細胞懸液0.2 ml，向小鼠的右側腋窩皮下注射，在注射局部可觸及明顯皮丘后迅速退針。接種5 d后，小鼠右腋下可觸及直徑約5 mm的皮下結節，提示建模成功。將40只造模成功的小鼠隨機分為4組，每組10只。每天腹腔注射0、5、10和20 μg/ml FAN 2 ml，培養32 d。檢測移植瘤體積：V=(長×寬2)/2；免疫組化檢測Ki67和VEGF；Western blot檢測HIF-1α、VEGF和Akt的表達。

1.2.7免疫組化檢測 將組織用中性甲醛溶液固定后，用石蠟包埋；然后將石蠟包埋的組織塊切片；接著石蠟切片脫蠟水化，阻斷過氧化物酶，抗原修復，血清封閉分別加入Ki67和VEGF單抗，4℃過夜，加入二抗，加入生物素蛋白工作液，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片；最后在顯微鏡下觀察統計。

1.2.8HE染色 將腎組織和肝組織放置4%甲醛固定后用酒精梯度脫水，然后用石蠟包埋切片。將石蠟切片經過二甲苯脫蠟、酒精覆水、蘇木精染色、乙酸分化、返藍、伊紅染色后，脫水固定裝片，顯微鏡下觀察。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方面方差分析及t檢驗，P<0.05，為差異有統計學意義。

2 結果

2.1防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29生長的影響 通過克隆形成實驗發現：與Blank cells組相比，FAN組的結腸癌細胞HT-29克隆形成率顯著降低，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29的克隆形成(P<0.01，圖1A)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29克隆形成率逐漸降低，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29克隆形成的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖1A)。

通過Western blot檢測增殖標記蛋白Ki67和PCNA的表達結果顯示：與Blank cells組相比，FAN組的結腸癌細胞HT-29Ki67和PCNA的表達量顯著下調，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29的增殖(P<0.01，圖1B)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29的Ki67和PCNA表達量逐漸降低，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29增殖的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖1B)。

2.2防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29侵襲的影響 通過Transwell檢測細胞侵襲情況可知：與Blank cells組相比，FAN組的結腸癌細胞HT-29侵襲細胞數目顯著減少，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29的侵襲能力(P<0.01，圖2)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29侵襲細胞數目逐漸減少，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29侵襲能力的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖2)。

2.3防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29 上皮-間質轉化的影響 通過Western blot檢測VEGF、E-cadherin和 N-cadherin的表達發現：與Blank cells組相比，FAN組的結腸癌細胞HT-29的VEGF和N-cadherin表達量顯著下調，E-cadherin表達量顯著上調，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29上皮-間質轉化(P<0.01，圖3A)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29的VEGF和N-cadherin表達量逐漸降低，E-cadherin表達量逐漸上調，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29上皮-間質轉化的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖3A)。通過顯微鏡觀察發現：與Blank cells組相比，FAN組的結腸癌細胞HT-29的排列緊密，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29上皮-間質轉化；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29的排列逐漸變得緊密，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29上皮-間質轉化的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖3B)。這與Western blot檢測VEGF、E-cadherin和 N-cadherin的表達結果相一致。

圖1 防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29生長的影響Fig.1 Effect of feninoline on growth of colon cancer cell line HT-29Note:A.Cell growth was detected by a colony formation assay;B.Ki67 and PCNA expression was detected by Western blot;**.P<0.01 versus Blank cells group.

圖2 Transwell檢測細胞侵襲情況(40倍)Fig.2 Detection of cell invasion by Transwell(40 times)Note:**.P<0.01 versus Blank cells group.

2.4防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29的作用通路 通過Western blot檢測HIF-1α、VEGF和Akt的表達結果可知：與Blank cells組相比，FAN組的結腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量顯著下調，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HIF-1α、VEGF/Akt信號通路的激活(P<0.01，圖4)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量逐漸降低，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29HIF-1α/VEGF/Akt信號通路激活的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖4)。

2.5防己諾林堿在體內對結腸癌細胞HT-29的影響 通過移植瘤體積測定發現：所有組的移植瘤體積隨著天數增多在不斷變大，但是FAN組的移植瘤體積與Blank組相比整體較小，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞在體內的生長(圖5A、B)。通過免疫組化檢測Ki67和VEGF發現：與Blank組相比，FAN組的結腸癌細胞Ki67和VEGF陽性細胞所占百分比顯著減少，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29的增殖(P<0.01，圖5C)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29的Ki67和VEGF陽性細胞所占百分比逐漸減少，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29增殖的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖5C)。這與體外實驗結果相一致。通過Western blot檢測HIF-1α、VEGF、Akt的表達結果發現：與Blank組相比，FAN組的結腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量顯著下調，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路的激活(P<0.01，圖5D)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量逐漸降低，說明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29HIF-1α/VEGF/Akt信號通路激活的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖5D)。這和體外實驗檢測結果完全一致。通過HE染色可知，Blank組大鼠的肝腎組織均結構完整清晰，細胞界限分明，無腫脹、系膜增生、充血、炎癥細胞浸潤等病理特征，與Blank組相比，FAN組肝腎組織無明顯變化，說明該劑量的防己諾林堿對肝、腎無損傷，可以安全應用(圖5E)。

圖3 上皮-間質轉化情況Fig.3 Epithelial-mesenchymal transitionNote:A.The expression of VEGF,E-cadherin and N-cadherin was detected by Western blot;B.The morphology of epithelial to mesenchymal transition was observed by microscope;**.P<0.01 versus Blank cells group.

圖4 Western blot檢測HIF-1α、VEGF、Akt的表達Fig.4 Detection of HIF-1α,VEGF,Akt expression by Western blotNote:**.P<0.01 versus Blank cells group.

圖5 防己諾林堿在體內對結腸癌細胞HT-29的影響Fig.5 Effect of hexinoline on colon cancer cell line HT-29 in vivoNote:A.Tumor status of different groups;B.Tumor volume of different groups;C.Detection of Ki67 and VEGF by immunohistochemistry (400 times);D.Detection of expression of HIF-1α,VEGF,Akt by Western blot;E.Liver and kidney damage were observed by HE staining;**.P<0.01 versus Blank group.

3 討論

細胞的惡性生長增殖是腫瘤形成的重要原因，抑制腫瘤細胞的惡性生長增殖是抑制腫瘤發展的關鍵，如，Yao等[10]發現山奈酚通過抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖來抑制食管鱗狀細胞癌發展。防己諾林堿可抑制乳腺腺癌、肺癌等腫瘤細胞的增殖[11]。同樣，本研究發現防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29的克隆形成。并且發現，防己諾林堿顯著下調結腸癌中Ki67和PCNA的表達量。Ki67和PCNA是眾所周知的評估細胞增殖的標記物。這進一步證明防己諾林堿可以抑制結腸癌細胞HT-29的增殖。

結腸癌在確診時通常伴有局部和遠處的侵襲轉移，且腫瘤術后復發轉移是導致結腸癌患者死亡的主要原因，所以，檢測藥物對結腸癌細胞的侵襲能力影響是治療結腸癌的關鍵[12]。Tian等[13]研究發現防己諾林堿靶向P13抑制胃癌細胞SGC7901的增殖和侵襲，推測防己諾林堿具有抑制結腸癌細胞侵襲的能力。本研究發現，防己諾林堿明顯減少結腸癌細胞侵襲數目，證明防己諾林堿對結腸癌細胞HT-29的侵襲能力具有抑制作用。

上皮間質轉化是以得到間充質干細胞特性、喪失上皮細胞特性為主要特征的生理病理現象，是腫瘤細胞發生侵襲轉移的重要證據[14]。如，Dinicola等[15]報道尼古丁通過上皮向間質轉化增加結腸癌細胞的遷移和侵襲。雖未有研究報道防己諾林堿對腫瘤細胞上皮間質轉化的影響，但本研究結果發現防己諾林堿顯著下調結腸癌細胞HT-29的VEGF和N-cadherin表達量、上調E-cadherin表達量，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29上皮-間質轉化。

HIF-1α/VEGF/Akt信號通路和癌癥的發展息息相關，如，He等[16]報道沒食子酸通過PTEN/HIF-1α/VEGF/Akt信號通路抑制卵巢癌發展，Lee等[17]發現京尼平通過抑制HIF-1α積累和VEGF表達抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移，從而抑制結腸癌。已有研究發現防己諾林堿通過Akt/GSK-3beta/cyclin D1信號通路抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[18]。本研究發現防己諾林堿顯著下調結腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路。

在體外實驗時，我們已經發現防己諾林堿可以抑制結腸癌細胞HT-29的生長和增殖、侵襲能力、上皮-間質轉化，并且抑制結腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路，從而抑制結腸癌的發生和發展。為了取得更好的證據，進行了裸鼠體內實驗。結腸癌體內實驗模型通常是采用皮下注射構建模型[19]，本文也采用此方法構建了結腸癌移植瘤模型。通過腫瘤體積測定發現，給防己諾林堿的裸鼠的腫瘤體積顯著較小，這說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞在體內的生長。通過免疫組化檢測Ki67和VEGF發現，防己諾林堿顯著降低結腸癌細胞HT-29 Ki67和VEGF陽性比率，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HT-29的增殖。通過Western blot檢測HIF-1α、VEGF、Akt的表達結果發現，防己諾林堿顯著下調結腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量，說明防己諾林堿抑制結腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路。這些結果與體外實驗結果一致。眾所周知，防己諾林堿大劑量或長期使用就會對肝腎有一定毒性，其中以肝損害為重，且損害程度與藥物劑量有一定正比關系，但我們通過HE染色實驗發現該劑量藥物對肝腎并無損害。

綜上所述，防己諾林堿無論是在體內還是體外都可以抑制結腸癌細胞HT-29的生長和增殖、侵襲能力、上皮間質轉化，并且抑制結腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路，從而抑制結腸癌的發生和發展。這為防己諾林堿開發了新的應用市場，同時也為結腸癌的治療提供新的參考數據。