姜黃素調節β-catenin/TCF4通路對胃癌細胞體內外生長和轉移的影響①

陳錦萍 林鴻悅 曾 楊 黃書榮 吳偉崗

(福建醫科大學附屬泉州市第一醫院胃腸外科，泉州 362000)

胃癌(Gastric cancer,GC)是來源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，目前仍是世界范圍內發病率和死亡率最高的腫瘤之一；因發病快、早期診斷困難，多數患者確診時已為轉移性胃癌，5年生存率不足30%[1-3]。使用細胞毒性藥物進行化療雖然對胃癌發展起到一定的抑制作用，但也帶來較大的副作用，給患者造成巨大的身心痛苦，且在此過程中，胃癌細胞易產生耐藥性，故綜合效果欠佳[4]。因此，尋找具有抑制胃癌轉移能力的活性物質非常必要。植物提取物是天然的抗癌藥物，副作用較小，姜黃素(Curcumin,CM)就是從傳統中藥姜黃根莖中提取得到的多酚類化合物，在亞洲國家作為化妝品、食品添加劑和傳統草藥的應用已有數千年的歷史[5，6]。大量研究發現，姜黃素生物學活性廣泛，包括降血脂、抗癲癇、抗抑郁、抗癌等[7-10]。近年來，姜黃素的抗腫瘤生物學活性受到了國內外學者的重視，其機制主要與改變腫瘤微環境、誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞耐藥性有關[11-13]。而姜黃素對胃癌MGC-803細胞的體內外生長和轉移作用研究還較少。本文以人胃癌MGC-803細胞為研究對象，探討黃素對細胞增殖、凋亡、侵襲和上皮間質轉化的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 姜黃素(純度為98.7 %，批號110823-201706)購自中國食品藥品檢定研究院，使用前用二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)配成母液，-20℃保存；RPMI1640細胞培養液、0.25%胰酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司；DMSO購自Sigma公司；膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP生物素缺口末端標記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒、結晶紫染色液、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；基質膠(Matrigel)購自美國Invitriogen公司；放射免疫沉淀法(Radio-Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液購自南京碧云天生物技術公司；Ki67(ab16667)、增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)(ab92552)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartic protease 3,Caspase-3)(ab32351)、Bax(ab32503)、Bcl-2(ab182858)、波形蛋白(Vimentin)(ab92547)、神經鈣黏蛋白(Neural cadherin,N-cadherin)(ab76011)、Snail(ab216347)、上皮鈣黏蛋白(Epithelial cadherin,E-cadherin)(ab40772)、β-catenin(ab32572)、T細胞因子(T cell factor 4,TCF4)(ab217668)、c-Myc(ab32072)和β-actin(ab213262)一抗和二抗(ab150077)均購自英國Abcam公司；溴脫氧核苷尿嘧啶(Bromodeoxyu-ridine,BrdU)和免疫組化試劑盒均購自廣州銳博生物有限公司。

1.1.2儀器 超凈工作臺、低溫高速離心機、酶標儀、細胞恒溫培養箱購自美國Thermo公司；電泳儀、半干轉膜儀、FACS Calibur流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司；倒置光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.1.3細胞株 人胃癌MGC-803細胞株購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。用含有10% 胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養，根據細胞生長情況進行換液，融合率達到85%以上進行傳代培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2方法

1.2.1BrdU染色檢測細胞增殖 接種胃癌MGC-803細胞于6孔板內，每孔1×106個細胞，待細胞融合率達80%時，用含0.4 %FBS的培養液同步化孵育72 h，每組設3個重復孔。將細胞隨機分為4組，分別為Control(對照)組、CM(10 μmol/L)組、CM(20 μmol/L)組和DM(40 μmol/L)組[14]，用對應終濃度藥液處理24 h，加入終濃度為0.03 μg/ml的BrdU繼續孵育40 min。磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer,PBS)洗滌細胞3次，用多聚甲醛固定10 min，嚴格按照說明書進行細胞增殖檢測。鏡下觀察并計數BrdU陽性細胞數。

1.2.2克隆形成實驗檢測細胞存活情況 接種細胞于6孔板內，每孔1×106個細胞，待細胞融合率達80%，分組方法同1.2.1，加入對應終濃度藥物處理24 h。收集各組細胞，每組取1 000個細胞接種到6孔板中，培養10 d。用20%乙醇固定克隆后，0.4%結晶紫染色，鏡下觀察并計算克隆數。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡水平 接種細胞于6孔板內，每孔1×106個細胞，待細胞融合率達80%時，分組方法同1.2.1，加入對應終濃度藥物處理24 h。用胰酶收集各組細胞，調整密度至1×106個/ml。嚴格按照凋亡檢測試劑盒說明書操作，取100 μl加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI染色液，室溫避光孵育15 min后，上機檢測。

1.2.4Transwell檢測細胞侵襲能力 接種細胞于6孔板內，每孔1×106個細胞，待細胞融合率達80%，分組方法同1.2.1，加入對應終濃度藥物處理24 h。收集各組細胞，調整密度至3×105個/ml，接種于提前用Matrigel包被的Transwell小室上層，并加入不含胎牛血清的培養液培養，在Transwell小室下層加入正常細胞培養液，繼續培養48 h。結晶紫染色，鏡下隨機選取5個視野對染色細胞進行計數。

1.2.5劃痕閉合實驗檢測細胞遷移能力 接種細胞于12孔板內，每孔1×105個，待細胞融合率達80%時，用10 μl槍頭作橫線劃痕，PBS清洗去除脫落細胞。分組方法同1.2.1，加入10 μg/ml終濃度的絲裂霉素C抑制細胞增殖[15]，同時加入對應終濃度藥物處理24 h。鏡下拍照并計算劃痕閉合率。劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6異種移植瘤模型建立、小鼠存活率及腫瘤體積測定 5周齡SPF級雄性BALB/c小鼠，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK(京)2014-0001。小鼠飼養于無菌環境，溫度26～28℃，濕度50%～60%，光照時間10 h，自由采食飲水，適應性3 d后進行實驗。將胃癌MGC-803細胞調整至2×107ml-1，于小鼠腋下皮下接種0.2 ml。將小鼠隨機分為Control(對照)組、CM(0.5 mg/kg)組、CM(1 mg/kg)組和CM(2 mg/kg)組[16]，每組5只，分別灌胃生理鹽水、0.5、1和2 mg/kg的CM溶液，每天1次，連續14 d。每天觀察并記錄小鼠存活情況，每5 d測量一次腫瘤體積，于第30天摘取腫瘤組織保存備用。體積：V=長×寬2/2。

1.2.7TUNEL檢測腫瘤組織凋亡情況 取1.2.6保存的腫瘤組織，將各組腫瘤組織制作成4 μm厚度的石蠟切片，嚴格按照TUNEL染色試劑盒操作進行腫瘤組織的染色。鏡下隨機選取5個不同視野，計算每個視野凋亡小體率=凋亡小體數/總細胞數×100%，取平均數。

1.2.8免疫組化檢測腫瘤組織內Ki67表達水平 取1.2.6保存的腫瘤組織，將各組腫瘤組織制作成4 μm厚度的石蠟切片，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。Ki67表達陽性細胞核內有棕色顆粒沉著。鏡下隨機選取5個不同視野，每個視野Ki67陽性率=陽性細胞/總細胞數×100%，取平均數。

1.2.9蛋白印跡檢測細胞增殖、凋亡、上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及通路蛋白的表達 冰上提取各組胃癌細胞總蛋白，用BCA法檢測各組蛋白濃度并調成一致。每組取20 μg蛋白質用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后，轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質2 h，加入Ki67、PCNA、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TCF-4、c-Myc和β-actin一抗(1∶500)，4℃孵育過夜。第二天棄去一抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入對應二抗(1∶1 000)，室溫封閉1 h后，滴加電化學發光(Electrochemiluminescent,ECL)液于暗室曝光顯影。以β-actin為內參，根據灰度值，以β-actin灰度值來表示目的蛋白表達量。

2 結果

2.1CM抑制MGC-803細胞增殖 BrdU染色和克隆形成實驗檢測MGC-803細胞增殖能力，結果顯示：與對照組相比，CM組BrdU陽性細胞數量、細胞克隆數量降低(P<0.05或P<0.01，圖1A、B)，且呈CM濃度依賴性；Western blot檢測細胞增殖相關蛋白表達情況，結果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細胞中Ki67和PCNA相對蛋白表達水平降低(P<0.05或P<0.01，圖1C)，且呈CM濃度依賴性。

2.2CM促進MGC-803細胞凋亡 流式細胞術檢測MGC-803細胞凋亡水平，結果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細胞凋亡增加(P<0.05或P<0.01，圖2A)，且呈CM濃度依賴性；Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白表達情況，結果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細胞中Caspase-3、Bax相對蛋白表達水平降低，Bcl-2則增加(P<0.05或P<0.01，圖2B)，且呈CM濃度依賴性。

2.3CM抑制MGC-803細胞侵襲遷移能力 Transwell實驗和劃痕閉合實驗檢測MGC-803細胞侵襲遷移能力，結果顯示：與對照組相比，CM組侵襲細胞數量、劃痕閉合率降低(P<0.05或P<0.01，圖3A、B)，且呈CM濃度依賴性；Western blot檢測細胞EMT相關蛋白表達情況，結果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細胞中Vimentin、N-cadherin和Snail1相對蛋白表達水平降低，E-cadherin則增加(P<0.05或P<0.01，圖3C)，且呈CM濃度依賴性。

2.4CM抑制MGC-803細胞通路蛋白表達 Western blot檢測MGC-803細胞中通路蛋白表達水平，結果表明：與對照組相比，CM組MGC-803細胞中β-catenin、TCF4和c-Myc的相對蛋白表達水平降低(P<0.05或P<0.01，圖4)，且呈CM濃度依賴性。

圖1 MGC-803細胞增殖情況Fig.1 Proliferation of MGC-803 cellsNote:A.Cell proliferation was detected by BrdU;B.Colony formation of MGC-803 cells;C.Protein expression of Ki67 and PCNA were tested by Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

圖2 MGC-803細胞凋亡檢測Fig.2 Apoptosis detection of MGC-803 cellsNote:A.Apoptosis of MGC-803 cells were detected by flow cytometry;B.Protein expression of Caspase-3,Bax and Bcl-2 were tested by Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

圖3 MGC-803細胞侵襲遷移能力檢測Fig.3 Invasion and migration ability of MGC-803 cells were detectedNote:A.Cell invasion ability was detected by transwell assay;B.Cell migration ability was detected by scratch closure test;C.Protein expression of Vimentin,N-cadherin,Snail1 and E-cadherin were tested by Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

2.5CM對MGC-803細胞移植瘤生長及腫瘤組織中相關蛋白表達的影響 統計各組移植瘤小鼠存活率和移植瘤體積，結果表明：與對照組相比，CM組小鼠存活率增加，腫瘤體積減小(P<0.05或P<0.01，圖5A、B)，且呈CM濃度依賴性；TUNEL檢測腫瘤組織凋亡水平，結果表明：與對照組相比，CM組腫瘤組織凋亡率增加(P<0.05或P<0.01，圖5C)，且呈CM濃度依賴性；免疫組化檢測腫瘤組織中Ki67蛋白表達水平，結果顯示：與對照組相比，CM組腫瘤組織中Ki67陽性細胞數減少(P<0.05或P<0.01，圖5D)，且呈CM濃度依賴性。

圖4 MGC-803細胞通路蛋白表達情況Fig.4 Expression of signaling pathway protein in MGC-803 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

圖5 CM對移植瘤生長及腫瘤組織中相關蛋白表達的影響Fig.5 Effects of CM on growth of transplanted tumor and expression of related proteins in tumor tissuesNote:A.Percent survival of transplanted tumor mouse;B.Tumor volumes of each group were measured on day 30;C.Apoptosis level of tumor tissue was detected by TUNEL assay;D.Positive cells of Ki67 were tested by immunohistochemical method.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

3 討論

胃癌是中國第三大最常見的癌癥相關死亡原因之一，全球胃癌的死亡率高達50%[17]。隨著人們生活方式的改變，幽門螺旋桿菌感染、環境改變等因素導致了胃癌的年輕化趨勢[18]。目前，控制胃癌細胞轉移是胃癌治療亟待解決的問題，這將直接決定患者的預后狀況。中藥因其低毒、高效、來源廣泛、價格較低等優點，在近年來的腫瘤治療中表現出應用價值[19]。研究表明，姜黃素通過調節癌基因和抑癌基因及多種信號通路對多種腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移具有抑制作用，如頸部鱗癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胰腺腺癌等[20-23]。基于此，本文以人胃癌MGC-803細胞為研究對象，研究姜黃素對體內外增殖、凋亡和轉移的影響及其可能機制。

細胞增殖能力增強和凋亡抵抗是癌癥發生發展的兩大特點。Zhang等[24]研究表明，在膀胱癌中，姜黃素抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡發生。Liu等[25]采用CCK-8法和Ki67染色法流式細胞術檢測細胞增殖，結果發現姜黃素呈時間和濃度依賴性抑制了胃癌細胞SGC-7901的增殖能力。Ki67是一種細胞增殖關鍵蛋白，可作為癌癥無限增生的標志物，而PCNA在DNA復制、修復、細胞周期及凋亡等方面起著重要作用[26，27]。另外，Caspase-3、Bax和Bcl-2是細胞凋亡的關鍵調控因子，可影響腫瘤發展進程[28，29]。在本文中，姜黃素劑量依賴性減少胃癌MGC-803細胞的BrdU陽性率和克隆形成數量、侵襲細胞數量和劃痕閉合率，增加細胞凋亡率，其機制與影響增殖(Ki67、PCNA)和凋亡(Caspase-3、Bax和Bcl-2)相關蛋白的表達有關，從而影響胃癌MGC-803細胞的增殖和凋亡能力。

EMT對器官發育、創傷修復等意義重大，在增強腫瘤細胞凋亡抵抗、促進腫瘤細胞干樣特性獲得和降解細胞外基質中也起著重要作用，其有利于腫瘤細胞侵襲轉移，在癌癥的發展進程中發揮著重要作用[4]。E-cadherin是一種重要的細胞黏附因子，其表達下調或缺失是腫瘤EMT的關鍵步驟，伴隨著間充質標志物Vimentin和N-cadherin的表達上調，通過與β-catenin連接形成復合物維持上皮細胞穩定性，促進細胞間的相互作用；Snail是EMT的重要轉錄因子，當結合到E-cadherin的啟動子上時可抑制后者的基因轉錄，從而參與EMT進程[30，31]。本研究表明，姜黃素劑量依賴性降低N-cadherin、Snail、Vimentin，增加E-cadherin蛋白表達，維持細胞間的黏附，降低細胞間的極性喪失，進而抑制胃癌MGC-803細胞EMT進程。

既往研究表明，姜黃素可以通過多種信號通路影響腫瘤細胞耐藥性、增殖和凋亡等，如調控CXC趨化因子/NF-κB信號途徑逆轉直腸癌細胞的奧沙利鉑耐藥[13]，Wnt3a/β-catenin/EMT 信號通路抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲[4]。C-Myc是一種重要的癌基因，通過調節許多基因靶點，參與包括細胞增殖、轉移、血管生成和凋亡的多個生物學過程，其高表達與多種不同種類癌癥預后不良相關[25]。當β-catenin轉移到核內時，可競爭性結合TCF4形成β-catenin/TCF4復合物，激活TCF4下游的轉錄因子，包括癌基因cycD和c-Myc，最終導致細胞異常增殖和腫瘤發生[32]。本研究發現，姜黃素處理細胞后，β-catenin、TCF4和下游的c-Myc蛋白表達均受到抑制，說明姜黃素有效下調β-catenin/TCF4信號通路，進而抑制人胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲和EMT的發生。

此外，本文在胃癌異種移植瘤中發現，姜黃素增加了小鼠存活率和腫瘤細胞凋亡水平，降低了腫瘤體積和腫瘤組織中Ki67的表達量。實驗結果表明，姜黃素抑制了人胃癌MGC-803細胞的體內外增殖、侵襲轉移，并誘導其凋亡，其機制可能與抑制β-catenin/TCF4信號通路密切相關，但在體內實驗中缺少證明。但有研究已表明[33]，在膀胱癌原位移植瘤模型中，姜黃素制劑顯示出膀胱癌治療的前景。

綜上所述，本文初步探討了姜黃素對人胃癌MGC-803細胞體內外增殖、凋亡、侵襲和間質轉化的作用。結果發現，姜黃素對人胃癌MGC-803細胞的調節作用可能與抑制β-catenin/TCF4通路活化有關。本文的研究為姜黃素在胃癌治療中的應用提供了實驗數據，下一步計劃研究β-catenin/TCF4信號通路在胃癌移植瘤模型中的作用及對腫瘤細胞干樣特性的影響。