用于關(guān)節(jié)軟骨再生的植入物評價規(guī)范

2020-07-23 發(fā)布 2020-07-23 實施

中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會 發(fā) 布

目 次

前言……………………………………………………………………………………………………………… 546

引言……………………………………………………………………………………………………………… 547

1 范圍………………………………………………………………………………………………………… 548

2 規(guī)范性引用文件…………………………………………………………………………………………… 548

3 術(shù)語和定義………………………………………………………………………………………………… 549

4 軟骨植入材料/支架材料（載體）…………………………………………………………………………… 550

4.1 概述…………………………………………………………………………………………………… 550

4.2 一般評價項目………………………………………………………………………………………… 550

4.3 特殊性質(zhì)軟骨植入材料/支架材料的評價指標……………………………………………………… 551

5 細胞………………………………………………………………………………………………………… 552

5.1 概述…………………………………………………………………………………………………… 552

5.2 細胞的質(zhì)量評價……………………………………………………………………………………… 552

5.3 細胞制備工藝控制與細胞制劑的評價……………………………………………………………… 554

6 組織工程化軟骨的制備工藝和終產(chǎn)品的評價…………………………………………………………… 554

6.1 制備工藝控制………………………………………………………………………………………… 554

6.2 力學(xué)特性……………………………………………………………………………………………… 554

6.3 效能測試……………………………………………………………………………………………… 554

6.4 輔助材料的質(zhì)量控制及生物相容性評價…………………………………………………………… 555

6.5 產(chǎn)品的穩(wěn)定性評價…………………………………………………………………………………… 555

6.6 效力或性能評價……………………………………………………………………………………… 555

6.7 細胞的體內(nèi)動態(tài)……………………………………………………………………………………… 555

7 非臨床研究及臨床前動物實驗研究……………………………………………………………………… 555

7.1 非臨床研究…………………………………………………………………………………………… 555

7.2 臨床前動物實驗研究. ………………………………………………………………………………… 556

8 臨床試驗研究……………………………………………………………………………………………… 556

附錄 A（資料性附錄） 臨床前大動物實驗研究的考慮要點……………………………………………… 557

參考文獻………………………………………………………………………………………………………… 559

前 言

本標準按 GB/T 1.1-2009《標準化工作導(dǎo)則》給出的規(guī)則起草。

本標準的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。

本標準由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會提出。

本標準由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會歸口。

本標準起草單位：中國食品藥品檢定研究院、中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會骨組織庫分會、中國人民解放軍總醫(yī)院國家骨科與運動康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)研究中心。

本標準主要起草人：徐麗明、孟淑芳、郭全義、陳亮、邵安良、魏利娜、孫雪蓮。

引 言

軟骨一旦損傷，難以自身修復(fù)，病情逐漸進展，必然出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎。針對嚴重的骨關(guān)節(jié)炎的治療，關(guān)節(jié)置換手術(shù)成了無奈的選擇。隨著生物材料和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，利用組織誘導(dǎo)性材料或與細胞組合的組織工程軟骨修復(fù)技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨損傷的早期治療提供了有效的治療手段，可以減緩嚴重骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。目前，以治療關(guān)節(jié)軟骨損傷為目的的再生型軟骨植入物包括：單獨應(yīng)用的軟骨修復(fù)生物材料、配合微骨折技術(shù)使用的軟骨修復(fù)生物材料以及結(jié)合自體軟骨細胞（也有用兒童異體軟骨細胞的報道）或者間充質(zhì)干細胞（自體或同種異體間充質(zhì)干細胞）的組織工程軟骨。

美國 FDA 于 2007年發(fā)布了“預(yù)期用于膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)或替代產(chǎn)品的研究豁免申請（IDEs）和研究性新藥應(yīng)用申請（INDs）行業(yè)指南”，于 2011年發(fā)布了修訂版本。FDA 把軟骨修復(fù)或替代產(chǎn)品作為高風險醫(yī)療器械監(jiān)管，要求申請人在擬開展新產(chǎn)品臨床試驗及進行臨床使用前需要獲得 FDA 的審批。日本厚生勞動省醫(yī)藥食品局審查管理科，醫(yī)療器械審查管理室在 2010年（平成 22年）發(fā)布了“關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨再生醫(yī)療產(chǎn)品的評價指標”指南文件，闡述了以損傷關(guān)節(jié)軟骨的治療為目的的人軟骨細胞加工醫(yī)藥品，或者人間充質(zhì)干細胞加工醫(yī)藥品，在滿足基本技術(shù)要求基礎(chǔ)上，對其質(zhì)量、安全性和有效性評價時需要考慮的事項。

目前我國結(jié)合自體軟骨細胞的組織工程軟骨作為醫(yī)療技術(shù)已在臨床應(yīng)用多年，有數(shù)個軟骨修復(fù)材料的研發(fā)已處在注冊前準備中，有的已經(jīng)進入了臨床試驗研究階段，也有數(shù)家企業(yè)正在將復(fù)合軟骨細胞使用的支架材料或載體按照創(chuàng)新醫(yī)療器械進行申報。因此，無論是作為醫(yī)療技術(shù)應(yīng)用，還是作為醫(yī)療器械產(chǎn)品研發(fā)，再生型關(guān)節(jié)軟骨（以膝、踝關(guān)節(jié)軟骨為主）修復(fù)材料均在臨床應(yīng)用或處于研發(fā)熱潮。然而，針對再生型關(guān)節(jié)軟骨植入物的質(zhì)量評價，我國目前還沒有一套相對全面的指導(dǎo)性文件來規(guī)范和指導(dǎo)行業(yè)的健康發(fā)展。本規(guī)范參考美國和日本關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨類產(chǎn)品的質(zhì)量評價要求，結(jié)合我國的相關(guān)標準和技術(shù)文件，闡述再生型關(guān)節(jié)軟骨植入物的評價規(guī)范，填補了我國在該領(lǐng)域的空白，有助于推進和指導(dǎo)軟骨再生醫(yī)療的發(fā)展。

用于關(guān)節(jié)軟骨再生的植入物評價規(guī)范

1 范圍

本標準給出了用于關(guān)節(jié)軟骨再生的植入物評價項目和相關(guān)可參考的標準及評價方法、組織工程化軟骨的制備工藝和終產(chǎn)品的評價要求、臨床前動物實驗研究以及臨床研究或臨床試驗的考量。本標準適用于以膝、踝等關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療為目的的再生型植入物，包括各種單純的軟骨植入材料、配合微骨折技術(shù)使用的軟骨修復(fù)膜以及結(jié)合來源于人體的軟骨細胞或者間充質(zhì)干細胞的組織工程軟骨。

本標準不適用于使用人 ES 細胞或 iPS 細胞及異種細胞、組織來源的細胞制備的產(chǎn)品以及使用基因修飾過的細胞制備的產(chǎn)品。

注：對于特定的產(chǎn)品，本規(guī)范中所建議的某些方法可能不完全適用時，可根據(jù)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)指南，進行個案（Case-by-case）分析。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T 16886.1 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 1 部分：風險管理過程中的評價與試驗

GB/T 16886.3 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 3 部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗

GB/T 16886.4 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 4 部分：與血液相互作用試驗選擇

GB/T 16886.5 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 5 部分：體外細胞毒性試驗

GB/T 16886.6 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 6 部分：植入后局部反應(yīng)試驗

GB/T 16886.9 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 9 部分：潛在降解產(chǎn)物的定性和定量框架

GB/T 16886.10 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 10 部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗

GB/T 16886.11 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 11 部分：全身毒性試驗

GB/T 16886.13 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 13 部分：聚合物醫(yī)療器械降解產(chǎn)物的定性和定量

GB/T 16886.16 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 16 部分：降解產(chǎn)物和可溶出物的毒代動力學(xué)研究設(shè)計

GB/T 16886.17 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 17 部分：可瀝濾物允許限量的建立

GB/T 16886.18 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 18 部分：材料化學(xué)表征

GB/T 16886.19 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 19 部分：材料物理化學(xué)、形態(tài)學(xué)和表面特性表征

GB/T 16886.20 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 20 部分：醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗原則和方法

GB/T 35823 實驗動物 動物實驗通用要求

GB/T 36988 組織工程用人源組織操作規(guī)范指南

YY/T 0513.1 同種異體修復(fù)材料 第 1 部分：組織庫基本要求

YY/T 0606.10 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第 10 部分：修復(fù)或再生關(guān)節(jié)軟骨的植入物體內(nèi)評價指南

YY/T 0606.15 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第 15 部分：評價基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的實驗方法：淋巴細胞增殖試驗

YY/T 0606.25 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第 25 部分 動物源性生物材料 DNA 殘留量測定法：熒光染色法

YY/T 0771.1 動物源醫(yī)療器械 第 1 部分：風險管理應(yīng)用

YY/T 0771.2 動物源醫(yī)療器械 第 2 部分：來源、收集與處置的控制

YY/T 0771.3 動物源醫(yī)療器械 第 3 部分：病毒和傳播性海綿狀腦病（TSE）因子去除與滅活的確認

YY/T 0771.4 動物源醫(yī)療器械 第 4 部分：傳播性海綿狀腦病（TSE）因子的去除和/或滅活及其過程確認分析的原則

YY/T 1435 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 水凝膠表征指南

YY/T 1453 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 I 型膠原蛋白表征方法

YY/T 1561 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 動物源性支架材料的殘留 α-Gal 抗原檢測

YY/T 1562 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 生物材料支架細胞活性試驗指南

YY/T 1571 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 透明質(zhì)酸鈉

YY/T 1576 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 可吸收生物材料植入試驗

YY/T 1616 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 生物材料支架的性能和測試指南

YY/T 1636 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 再生膝關(guān)節(jié)軟骨的體內(nèi)磁共振評價方法

YY/T 1654 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 海藻酸鈉

YY/T 1699 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 殼聚糖

《中華人民共和國藥典》

ISO 13019-2018 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 用于評價軟骨形成的糖胺多糖（sGAG）的定量測定（Tissue-engineered medical products—Quantification of sulfated glycosaminoglycan (sGAG) for evaluation of chondrogenesis）

3 術(shù)語和定義

YY/T 0606.10 和 YY/T 1445-2016 中界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。為便于理解和使用，部分術(shù)語和定義摘錄自 YY/T 1445-2016。

3.1

支架 scaffold

用于替代、修復(fù)或再生組織的支持物，具有促進細胞遷移、結(jié)合、輸送，或生物活性因子輸送功能。

[YY/T 1445-2016，3.11]

3.2

軟骨再生 cartilage regeneration

具有與正常軟骨相似結(jié)構(gòu)與功能的組織的形成過程。

[YY/T 1445-2016，3.10]

3.3

軟骨修復(fù) cartilage repair

受損的軟骨或其替代物通過細胞增殖和新細胞外基質(zhì)合成的愈合過程。

[YY/T 1445-2016，3.11]

3.4

輔助材料 Ancillary materials

是在細胞生產(chǎn)制備過程中與細胞或組織直接接觸，但不在細胞或細胞治療產(chǎn)品中殘留的材料。

4 軟骨植入材料/支架材料（載體）

4.1 概述

本部分包括直接作為軟骨植入材料的產(chǎn)品和結(jié)合細胞使用的組織工程支架材料或載體。

4.2 一般評價項目

4.2.1 物理性能

軟骨植入材料產(chǎn)品或者支架材料/載體的物理性能可根據(jù)材料的來源和預(yù)期的臨床使用選擇適用的評價指標，可按照 YY/T 1616、GB/T 16886.19 進行物理性能的表征。可從如下指標中選擇（但不限于）適用的物理性能指標：

a）形態(tài)、結(jié)構(gòu)與組成：對軟骨植入材料產(chǎn)品或者支架材料/載體的形態(tài)（如膜狀、凝膠狀等）、結(jié)構(gòu)和組分進行完整描述，如適用可用圖像分析進行結(jié)構(gòu)表征，并闡述組分間相互的物理、化學(xué)作用。

b）如果是多孔材料，宜進行孔隙率、透氣性等表征。

c）力學(xué)性能：如：粘彈性、耐負荷性、伸展特性等。鑒于很多軟骨修復(fù)材料的粘彈性等力學(xué)性能是植入體內(nèi)后，在體內(nèi)微環(huán)境和局部生理性力學(xué)作用下隨著軟骨的再生和成熟逐漸形成的，因此，力學(xué)性能可以結(jié)合動物實驗中再生軟骨的樣品進行評價。

d）其他：如吸水性、密度、表面性質(zhì)、可見異物、膜透氣性（膜狀材料時）、粒度和粒度分布（顆粒狀時）、結(jié)晶性（結(jié)晶狀時）等。

4.2.2 化學(xué)性能

描述軟骨植入材料產(chǎn)品或者支架材料/載體的化學(xué)性能，按照 GB/T 16886.18、GB/T 16886.19 及 YY/T 1616，根據(jù)材料的性質(zhì)選擇必要的化學(xué)性能指標進行表征。

以下給出一些舉例，適用時，可按《中華人民共和國藥典》的相應(yīng)試驗方法和要求進行檢測，并根據(jù)風險分析給出可接受限值。如：

a）雜質(zhì)鑒定；

b）分子量；

c）殘留物（溶劑殘留）；

d）重金屬及其微量元素；

e）其他指標：如：黏度、干燥失重、水分等。

f）如果是動物源性脫細胞基質(zhì)（ECM）類材料，可按照 YY/T0606.25，采用殘留 DNA 檢測進行脫細胞工藝評價和終產(chǎn)品的檢測；按照 YY/T 1561，采用 Gal 抗原殘留量檢測進行去除抗原工藝評價。

4.2.3 生物學(xué)性能

對于軟骨植入材料產(chǎn)品，可按照《中華人民共和國藥典》的相應(yīng)試驗方法，進行下列項目的檢測：

a）無菌；

b）細菌內(nèi)毒素；

c）熱原。

對于預(yù)期用于復(fù)合細胞的支架材料/載體，還需在終產(chǎn)品階段進行生物學(xué)性能檢測。

4.2.4 生物學(xué)評價

對于軟骨植入材料產(chǎn)品，可按照 GB/T 16886.1 在充分的風險分析基礎(chǔ)上選擇適用的評價項目，按照 GB/T 16886 相關(guān)的標準進行生物相容性評價，具體相關(guān)的評價項目可按照如下相應(yīng)的標準進行。

a）體外細胞毒性，按照 GB/T 16886.5 進行；

b）全身毒性，按照 GB/T 16886.11 進行；

c）血液相容性（如溶血性），按照 GB/T 16886.4 進行；

d）皮內(nèi)刺激，按照 GB/T 16886.10 進行；

e）皮膚致敏，按照 GB/T 16886.10 進行；

f）局部植入反應(yīng)，按照 GB/T 16886.6 進行；

g）遺傳毒性，按照 GB/T 16886.3 進行；

h）免疫原性，按照 GB/T 16886.20 進行。

對于預(yù)期用于復(fù)合細胞的支架材料/載體，有些項目（如免疫原性）需要結(jié)合細胞的風險分析考慮是否對終產(chǎn)品進行評價。

4.3 特殊性質(zhì)軟骨植入材料/支架材料的評價指標

4.3.1 可降解或/和可吸收材料

多數(shù)再生型軟骨修復(fù)材料是可降解或/和可吸收的。可按照如下標準進行降解產(chǎn)物的表征與評價。

a）按照 GB/T 16886.9 進行潛在降解產(chǎn)物的定性和定量分析；

b）按照 GB/T 16886.13 進行聚合物降解產(chǎn)物的定性和定量分析；

c）按照 GB/T 16886.16 進行降解產(chǎn)物與可溶出物毒代動力學(xué)研究；

d）按照 GB/T 16886.17 建立可瀝濾物允許限量；

e）按照 YY/T 1576 進行可吸收材料植入試驗，分析其體內(nèi)降解特性。

4.3.2 動物源材料

很多再生型軟骨修復(fù)材料是來源于動物組織，經(jīng)脫細胞、去除抗原等工藝制備而成，或動物組織提取的膠原。可按照 YY/T 0771.1-4 系列標準進行外源因子污染的防控和風險評價及免疫原性評價。產(chǎn)品制備工藝中增加病毒去除和滅活工藝，并按照《動物源性醫(yī)療器械注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（2017年修訂版）的附錄 1“動物源性醫(yī)療器械病毒滅活/去除有效性驗證的原則”的要求，進行病毒滅活工藝驗證；同時，參考附錄 2“動物源性醫(yī)療器械免疫原性研究、評價與控制的原則”、GB/T 16886.20 及 YY/T0606.15 進行免疫毒理學(xué)評價。膠原類材料的表征按照 YY/T 1453 選擇適用的項目。

在選擇免疫學(xué)評價項目和設(shè)計試驗方案時應(yīng)充分考慮人與實驗動物的種屬差異。例如：α-半乳糖基抗原（簡稱 Gal 抗原）是動物組織、器官移植到人體引起超急性免疫排斥反應(yīng)的主要靶抗原，廣泛存在于牛、豬和其他低等動物體內(nèi)，人體由于有 2 個堿基錯位變異而不表達 Gal 抗原，但人血清中存在高滴度的抗-Gal 抗體，因此當人體接受含有 Gal 抗原的組織或生物材料時就會引起補體介導(dǎo)的抗體依賴型細胞毒性效應(yīng)，引起免疫排斥及免疫毒理反應(yīng)。因此，采用野生型動物不能客觀地評價動物源性生物材料對人體的免疫原性風險。有研究證實利用 Gal 抗原缺失小鼠皮下植入野生型豬的軟骨，引起了特異性抗 Gal 抗體的顯著性升高，而植入 Gal 抗原缺失豬的軟骨則與陰性對照組無顯著性差異。因此，Gal 抗原缺失動物可能是評價動物源性生物材料免疫原性的合適模型。如果結(jié)合植入材料特異性抗體檢測，可以同時檢測特異性抗 Gal 抗體之外的材料特異性抗體。Gal 抗原缺失小鼠已被廣泛應(yīng)用于異種免疫原性評價。

在選擇體外免疫學(xué)試驗時，要充分考慮樣品制備的合理性，比如使用浸提液用于實驗樣品時要充分分析和證明抗原物質(zhì)是否全部被有效浸提出來。應(yīng)客觀地分析實驗體系的局限性。建議參考最新研究文獻， 合理選擇體外免疫學(xué)試驗方法，客觀地評價異種免疫原性風險。

4.3.3 水凝膠類材料

有些再生型軟骨植入材料是水凝膠狀態(tài)的樣品。水凝膠起始聚合物成分可影響水凝膠的最終性能，因此需要對其進行表征，尤其是本身具有多樣性的天然聚合物。

起始生物材料表征可按照 YY/T 1453、YY/T 1571、YY/T 1654 和 YY/T 1699。

終產(chǎn)品表征可按照 YY/T 1435，如：表征交聯(lián)程度，在某些情況下，可簡單地通過計算成膠后浸出物的比例來反映水凝膠交聯(lián)程度，并可同時提供潛在的有害浸出物的信息；可利用合適的體外模型，評估水凝膠在體內(nèi)的反應(yīng)；另外，可通過凝膠化時間、溶脹速率、基質(zhì)降解等進行動力學(xué)評價；通過表征水凝膠的環(huán)境穩(wěn)定性、力學(xué)性能、細胞包埋等評價其物理與化學(xué)特性及穩(wěn)定性；通過細胞遷移、營養(yǎng)與廢物的傳遞、生物活性物質(zhì)的釋放速率檢測進行物質(zhì)傳遞特性的評價。

對于含有天然聚合物成分和生物制品、生物源初始材料制備的水凝膠應(yīng)進行外源因子污染風險評估及控制，必要時增加病毒去除滅活工藝，并進行工藝驗證。

降解行為是許多水凝膠產(chǎn)品發(fā)揮功能所必需的，當需要水凝膠作為持久的屏障或支持物時，不應(yīng)發(fā)生非預(yù)期的降解。如果用于軟骨的再生修復(fù)時預(yù)期伴隨有宿主新的軟骨組織再生，則需要評價其降解速率和新生組織再生替代的時間匹配性。進行降解研究時，宜模擬體內(nèi)對水凝膠降解有直接影響的條件參數(shù),在相應(yīng)臨床前模型中評估水凝膠的降解。此外，在選擇合適的檢測方法時宜考慮降解的潛在機制，包括水解、酶降解、氧化降解，以及本體降解和表面降解，這會對所需的測量頻率和靈敏度產(chǎn)生影響。

4.3.4 同種異體材料

對于同種異體組織來源的再生型軟骨植入材料，如同種異體來源的軟骨組織，經(jīng)適當處理后用于軟 骨植入物，或經(jīng)粉碎等處理后重新構(gòu)建的三維軟骨支架材料。可按照《同種異體植入性醫(yī)療器械病毒滅 活工藝驗證技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（2011年修訂版）設(shè)計病毒去除與滅活工藝，并進行工藝驗證。可按照 GB/T 36988 和 YY/T 0513.1（2019年修訂版）標準進行供體篩查、樣品制備、儲存等風險管理和質(zhì)量 控制。

5 細胞

5.1 概述

對于含細胞的組織工程軟骨或者組合產(chǎn)品（細胞和支架材料單獨包裝，使用前將兩者混合后進行局部植入/注入），建議按照以下我國細胞相關(guān)指導(dǎo)原則或規(guī)范和 GB/T 36988 標準的要求及參考相關(guān)國際標準（如 ISO 13022、ISO 18362），也可參考國際藥品監(jiān)管機構(gòu)發(fā)布的與基于人源細胞的醫(yī)藥產(chǎn)品的相關(guān)管理法規(guī)或技術(shù)指導(dǎo)原則。以下列出了細胞質(zhì)量評價的主要指標，但用于每一種產(chǎn)品所使用的人源細胞需根據(jù)其來源供體、細胞特性及其潛在風險、制備方式、終產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其風險降低程度、制劑狀態(tài)、預(yù)期用途、作用途徑或使用方式等參數(shù)進行充分評估后，制定其質(zhì)量評價項目及標準。

5.2 細胞的質(zhì)量評價

5.2.1 概述

一般來說，細胞的質(zhì)量評價包括與支架復(fù)合前的質(zhì)量評價及終產(chǎn)品中細胞的質(zhì)量評價，主要包括細胞的生物學(xué)特性、微生物污染、生物學(xué)有效性及其安全性指標。可根據(jù)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，最適樣本原則，在生產(chǎn)工藝的不同階段設(shè)置合理的評價指標。如對自體來源、傳代極少且不能建庫、使用無生物源性材料培 養(yǎng)的細胞，微生物污染檢測主要考慮細菌、真菌及支原體污染。異體來源可以建立細胞庫的細胞（如臍帶間充質(zhì)干細胞），則需對細胞庫進行充分的內(nèi)、外源因子污染的檢查；而在與支架復(fù)合前或復(fù)合后外源因子的檢查主要考慮從細胞庫復(fù)蘇到產(chǎn)品完成前可能潛在的外源因子污染風險。

此外，為降低細胞供體材料所帶來的可傳播性疾病的風險，可按照 GB/T36988 以及軟骨植入的特定要求，制定或建立合格供體的質(zhì)量要求，包括供體篩查、檢測項目及可接受標準。

5.2.2 生物學(xué)特性評價指標

主要包括：細胞鑒別、細胞數(shù)量及存活率、純度和均一性、增殖活性、細胞去分化狀態(tài)（如 I 型膠原和 II 型膠原的表達情況）及染色體檢查（異體來源或根據(jù)需要個案考慮）。

細胞鑒別試驗需能證明所用細胞與其他種屬細胞、其他個體細胞無交叉污染（必要時除外，但需有充分的評估）并能夠體現(xiàn)細胞特異性，如細胞表型、特定因子或特定基因表達、分化特性等。對于自體來源的細胞，個體來源鑒別也可通過全生產(chǎn)過程采用唯一標識的可溯源系統(tǒng)替代，但在發(fā)生錯誤時，僅個體來源鑒別數(shù)據(jù)能夠作為個體溯源依據(jù)。

細胞數(shù)量及活力的檢測可根據(jù)檢測的目的選擇合適的方法，如在細胞分離、培養(yǎng)或與支架材料復(fù)合前，細胞數(shù)量及活力采用血球計數(shù)法、全自動細胞計數(shù)法或細胞增殖試驗等進行檢測。而對終產(chǎn)品中支架材料內(nèi)細胞活性的評價可按照 YY/T 1562 進行支架材料中細胞的存活率、密度、形態(tài)學(xué)特征評價。

對于細胞純度，可根據(jù)供體材料的組織來源特點、細胞分離制備工藝及其工藝清除驗證的結(jié)果、質(zhì)量研究結(jié)果及其可能存在的安全性風險，對供體材料分離的細胞、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品的目的細胞及其與目的細胞相關(guān)雜質(zhì)設(shè)定合理的純度要求指標，即非目的細胞的比例或數(shù)量，如：骨原細胞、血管內(nèi)皮細胞、纖維原細胞、異常分化的體細胞樣細胞、未分化或者去分化細胞、異常增殖細胞、性質(zhì)變異細胞；應(yīng)設(shè)定混入細胞存在時其安全性確認試驗及其判斷標準，且需對安全性確認試驗的方法學(xué)進行充分驗證，證明當有非目的細胞存在時該試驗可檢出其安全性風險。

如軟骨植入物為細胞制劑，在進行細胞純度檢測的同時，還應(yīng)建立工藝相關(guān)雜質(zhì)的評價指標，如添加因子的殘留量、培養(yǎng)包被基質(zhì)的殘留量等。

5.2.3 微生物學(xué)安全性評價指標

主要包括：細菌、真菌、支原體、細胞內(nèi)、外源性病毒因子及細菌內(nèi)毒素。如細胞培養(yǎng)過程中使用了植物來源的成分，還需進行螺原體檢查；如存在分枝桿菌污染的風險，還需對細胞進行分枝桿菌檢查。

細胞內(nèi)、外源因子檢測的種類應(yīng)根據(jù)污染風險評估的結(jié)果確定，如自體還是異體來源、細胞培養(yǎng)過程中所用的所有生物源性材料中可能潛在的污染風險、細胞培養(yǎng)及傳代或擴增過程中可能引入的污染風險等。對于自體來源的細胞，可在手術(shù)前對供體進行可傳播性疾病病原體檢測，如為陽性，后續(xù)細胞分離培養(yǎng)等操作應(yīng)對操作者及環(huán)境采用足夠的防護隔離措施。對于異體來源的細胞，除必須對供體進行篩查及檢測外，通常建議再采用高靈敏的核酸檢測方法對培養(yǎng)后的細胞進行可傳播性病原體或其他人源病毒污染的檢測。對于細胞培養(yǎng)過程中使用了牛源性材料或豬源性材料的細胞，除對原材料本身進行放行檢驗外，建議對每批原材料培養(yǎng)的至少一個批次的細胞進行一次牛源或豬源病毒的檢測。

5.2.4 生物學(xué)有效性評價指標

主要包括：軟骨組織再生潛能、種子細胞的成軟骨能力評價。如：細胞的 II 型膠原蛋白表達水平（基因水平和蛋白質(zhì)水平）；細胞或結(jié)合體外構(gòu)建的軟骨植入物或植入到動物體內(nèi)后的軟骨植入物及其再生軟骨的糖胺多糖（GAG）含量檢測，檢測方法按照 ISO 13019-2018 進行。有效性評價方法如可行，盡可能采用定量檢測方法，并驗證其定量檢測能力。

5.2.5 安全性評價指標

主要包括：異常免疫反應(yīng)、非預(yù)期分化及過度形成/異常增生、成瘤性/促瘤性等。對于細胞的成瘤性和過度增生，應(yīng)評價細胞團在局部的物理性障礙造成對宿主正常生理功能的影響，惡性腫瘤、良性腫瘤及過度增生的可能性。成瘤性評價方法可包括：軟瓊脂集落形成、端粒酶活性、免疫缺陷動物的成瘤試驗（包括組織病理區(qū)分軟骨形成）或其他更敏感的方法。細胞核型分析有時也可作為成瘤性風險評價的指標。

超過培養(yǎng)期的細胞，應(yīng)評價是否有非預(yù)期目的形質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖速度的異常亢進。

使用間充質(zhì)干細胞時，含有軟骨細胞分化潛能的細胞及分化的軟骨細胞的產(chǎn)品，需要設(shè)計 2 種或 2 種以上的試驗方法評價其成瘤性，并根據(jù)產(chǎn)品的特性及當時的技術(shù)水平說明試驗選擇的合理性。如使用自體來源的細胞，是否進行成瘤性評價可通過對細胞特性、工藝、使用方法等評估的基礎(chǔ)上確定。

關(guān)于特殊情況分析，由于供體的年齡和原發(fā)疾病可能會有一定頻度的染色體異常，因此，出現(xiàn)染色體異常檢測結(jié)果時需要分析是否有其他原因，如：供者的背景、培養(yǎng)條件等。疑有成瘤性時，應(yīng)注意分析原因，如：原材料、制備方法和原發(fā)性腫瘤。

5.3 細胞制備工藝控制與細胞制劑的評價

a）細胞采集：應(yīng)建立細胞采集工藝及質(zhì)控標準，如采集物大小、分離細胞的數(shù)量及活力、目的細胞的含量等；

b）細胞制備工藝及其過程控制：應(yīng)進行細胞分離、培養(yǎng)、擴增或誘導(dǎo)分化的工藝研究，確定細胞擴增培養(yǎng)時間及條件以及最大傳代水平，以確保細胞在規(guī)定的培養(yǎng)時間內(nèi)不會去分化（如軟骨細胞），或者不會出現(xiàn)多分化能力的減弱（如間充質(zhì)干細胞）、增殖速度異常等，并設(shè)定相應(yīng)的過程控制評價指標，保證植入（人體）前細胞的功能；

c）細胞制劑的評價：細胞與支架材料或載體單獨包裝（臨床使用前負載或混合）時，細胞作為制劑應(yīng)設(shè)定如下檢測項目：外觀、裝量（細胞數(shù)）、pH 值、滲透壓、存活率、無菌檢測、支原體檢測、內(nèi)毒素檢測和添加物殘留量檢測等；

d）由于細胞量的限制，或者產(chǎn)品復(fù)雜特性不能對終產(chǎn)品進行充分的評價時，應(yīng)證實中間產(chǎn)品（或細胞原材料）的特性與終產(chǎn)品質(zhì)量的相關(guān)性，闡述能夠作為終產(chǎn)品評價指標的合理性。

6 組織工程化軟骨的制備工藝和終產(chǎn)品的評價

6.1 制備工藝控制

含細胞組織工程化軟骨的制備可按照 GB/T 36988 和參照 ISO 13022 及 ISO 18362 的要求進行制備過程質(zhì)量控制，建立質(zhì)量體系，進行風險管理。

6.2 力學(xué)特性

含細胞組織工程化軟骨，宜考慮設(shè)定與軟骨組織類似的力學(xué)特性，如：耐負荷性、彈性、伸展特性要求。

注：由于軟骨產(chǎn)品植入體內(nèi)隨著體內(nèi)力學(xué)的刺激才會接近正常軟骨的力學(xué)，人體軟骨的力學(xué)來源于兒童到成年的連續(xù)受力，逐漸形成。因此，力學(xué)特性可能需要通過動物試驗獲得數(shù)據(jù)。

6.3 效能測試

a）設(shè)定以軟骨再生為目的組織工程軟骨的有效性評價試驗，如：粘彈性試驗（動物試驗獲取的體內(nèi)軟骨修復(fù)組織）；

b）或者確定體內(nèi)有效性的代替指標（Surrogate marker）用于效能試驗。如：II 型膠原/I 型膠原的基因表達比，作為軟骨細胞的分化指標。選擇使用替代指標時，需要預(yù)先評價替代指標與體內(nèi)有效性的相關(guān)性；

c）預(yù)期在體內(nèi)增殖、分化的細胞，宜設(shè)定發(fā)揮預(yù)期機能的傳代數(shù)和分裂次數(shù)。

6.4 輔助材料的質(zhì)量控制及生物相容性評價

制備工藝中與細胞接觸的任何材料或者輔助材料，如局部封閉用的膜、黏著劑等，應(yīng)進行質(zhì)量、安全性和生物相容性評價；與受體及制品中細胞的相互作用評價；終產(chǎn)品整體與治療部位周邊組織的相互作用評價。

細胞制備、培養(yǎng)過程中使用的輔料可參照 ISO/TS 20399-1 和 ISO/TS 20399-3 進行質(zhì)量控制；按照 GB/T 16886 系列標準進行生物相容性評價。

用于組織工程軟骨支架的生物材料、支持膜、制備工藝中與細胞接觸的任何材料或者輔料，如局部封閉用的膜、黏著劑等，應(yīng)參照第 4 條款進行質(zhì)量、安全性和生物相容性評價；與受體及制品中細胞的相互作用評價；終產(chǎn)品整體與治療部位周邊組織的相互作用評價。

6.5 產(chǎn)品的穩(wěn)定性評價

含細胞組織工程化軟骨或者其中細胞和支架材料作為 2 種組分，單獨包裝時（臨床使用時將細胞與支架材料混合或者負載于支架材料）的組合產(chǎn)品，應(yīng)設(shè)定細胞組分在保存、流通期間以細胞存活率、代表效能的代謝指標為考察項目的穩(wěn)定性試驗，從而確定儲存方法和有效期。特別是宜充分評價細胞凍存和解凍后培養(yǎng)的可能期間的設(shè)定及對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

考察超過規(guī)定標準的制備期間和保存期間的長期保存時穩(wěn)定性極限的可能范圍。

應(yīng)設(shè)定運輸條件的要求，包括：容器、運輸液、溫度等，并闡述其設(shè)定的合理性。

6.6 效力或性能評價

可通過主要藥效學(xué)/概念驗證研究（primary pharmacodynamic/proof-of concept study）評價細胞的功能、作用持續(xù)性和其他預(yù)期臨床效果實現(xiàn)的可能性。評價方法可以利用動物源性細胞或者組織，在軟骨損傷模型上進行評價。

6.7 細胞的體內(nèi)動態(tài)

為評價治療細胞預(yù)期之外的體內(nèi)分布，在科學(xué)和技術(shù)允許的范圍內(nèi)進行實驗動物研究，包括體內(nèi)分布、吸收、游走（移行）、附著等體內(nèi)動態(tài)試驗。不進行試驗時應(yīng)說明其合理性。

7 非臨床研究及臨床前動物實驗研究

7.1 非臨床研究

需要有充足的非臨床研究數(shù)據(jù)為做臨床試驗的產(chǎn)品提供科學(xué)的依據(jù)，并且證明產(chǎn)品進行人體臨床研究的安全性。非臨床研究可結(jié)合源于動物實驗、實驗室實驗或兩者相結(jié)合的藥理和毒理學(xué)數(shù)據(jù)，選擇適當?shù)脑囼瀬碜C明產(chǎn)品的有效性和安全性。非臨床研究的方法要依據(jù)準確的產(chǎn)品成分分析，建議在一項研究中結(jié)合動物實驗及必要的實驗室實驗來設(shè)計實驗方案，以保證實驗結(jié)果的有效性。

一個產(chǎn)品由多種成分復(fù)合而成時，應(yīng)對每種獨立的成分進行描述和分析。關(guān)鍵的非臨床試驗的評估產(chǎn)品應(yīng)與臨床試驗中使用的產(chǎn)品規(guī)格型號及版本相同。如果使用了不同規(guī)格型號及版本，則應(yīng)提供原理來說明產(chǎn)品的眾多規(guī)格型號的不同和為什么從一個不同規(guī)格型號產(chǎn)品分析得來的非臨床數(shù)據(jù)用于支持臨床研究的合理性。用于動物實驗研究的產(chǎn)品版本應(yīng)與臨床試驗所用版本及注冊申報的終末版定型產(chǎn)品一致。

7.2 臨床前動物實驗研究

按照《醫(yī)療器械動物實驗研究技術(shù)審查指導(dǎo)原則 第一部分：決策原則》（2019），確定所研發(fā)產(chǎn)品是否需在活體動物上進行在體實驗。按照《醫(yī)療器械動物實驗研究技術(shù)審查指導(dǎo)原則 第二部分：實驗設(shè)計、實施質(zhì)量保證》（征求意見稿，2020.01），GB/T 35823 及 YY/T 0606.10 開展臨床前動物實驗研究。軟骨治療效果的評價方法，可參考國際軟骨評級體系(ICRS)進行臨床觀察的評分及按照 YY/T 1636（附錄 A）體內(nèi)核磁方法進行評價。

關(guān)于動物實驗通常用來評價關(guān)節(jié)軟骨再生型植入物有效性的指標、實驗方案設(shè)計的考慮要點和研究內(nèi)容及主要信息詳見附錄 A。

無論是進行什么評估，宜比較修復(fù)或再生軟骨組織與正常組織的性質(zhì)（例如，從一個未操作的關(guān)節(jié)軟骨收集的組織）。修復(fù)組織不可能與正常軟骨的特性完全一致，宜說明這些差異存在的原因和繼續(xù)臨床試驗的可行性。

8 臨床試驗研究

按照《醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》的要求開展臨床試驗研究。應(yīng)考慮疾病類型、目的效能及期待的臨床效果，并結(jié)合非臨床研究資料進行綜合評價。臨床試驗研究時，期待的理想的臨床效果是全部或部分透明軟骨的再生，而不是纖維化軟骨。橫向弛豫時間成像（T2 Mapping）和磁共振軟骨延遲增強成像（dGMERIC）核磁技術(shù)可以很好地評價再生軟骨的膠原蛋白及水分含量和成熟軟骨特有的糖胺多糖（GAG）含量。可按照 YY/T1636 進行為期至少一年的臨床跟蹤評價。

附 錄 A

（資料性附錄）

臨床前大動物實驗研究的考慮要點

A.1 有效性評價指標

動物實驗通常用來評價軟骨再生植入物的有效性指標如下：

a）生物反應(yīng)：對于產(chǎn)品的生物反應(yīng)及一個組合產(chǎn)品中每個組分的生物活性，可以通過動物實驗的研究證明終產(chǎn)品中的某個組分有臨床效果。

b）耐久性：即評估軟骨損傷修復(fù)的時間、產(chǎn)品的耐磨損性能、降解特性和隨著時間推移承受生理負載的性能。通過大動物實驗評估耐久性通常需要最少一年的時間，建議設(shè)定充足的完全愈合時間。這個持續(xù)時間通常要足夠評價治療的有效性。研究持續(xù)期間宜基于產(chǎn)品的特性、型號和有效數(shù)據(jù)的數(shù)量。例如，一個產(chǎn)品降解需要較長的時間，就需要長期跟進獲得降解曲線。

c）局部和全身毒性：局部毒性可能是由于產(chǎn)品與關(guān)節(jié)的成分相互作用，或產(chǎn)品降解產(chǎn)物的作用。系統(tǒng)性全身毒性可能是由于細胞或粒子或降解物遷移至關(guān)節(jié)以外的空間。產(chǎn)品潛在的致瘤性和不適當?shù)姆只瘯霈F(xiàn)在關(guān)節(jié)區(qū)域內(nèi)外。因此，常規(guī)的材料浸提液方法可能無法客觀地評價這些風險，需要結(jié)合局部原位植入的動物實驗進行全面評價。

d）劑量效應(yīng)：例如，礦物組成、細胞數(shù)和其他能影響損傷修復(fù)的特性。劑量效應(yīng)可根據(jù)組織學(xué)和生物學(xué)分析，通常在大動物實驗中獲得數(shù)據(jù)。

A.2 實驗方案設(shè)計的考慮要點

評價軟骨再生植入物的動物實驗方案設(shè)計時宜重點考慮以下因素：

a）創(chuàng)面尺寸和部位：動物實驗應(yīng)按適當比例模仿臨床數(shù)據(jù)。如果在臨床上需要多種器械聯(lián)合使用，那么這一點也需要在動物實驗設(shè)計中考慮到。此外，動物實驗中損傷部位應(yīng)設(shè)置在與植入人體的相似部位。

b）研究終點：動物實驗應(yīng)設(shè)計恰當?shù)难芯拷K點來反映臨床試驗的情況。可結(jié)合次級臨床終點的評價，如：組織學(xué)評價和按照 ISO 13019-2018 進行再生軟骨組織糖胺多糖含量檢測。可按照 YY/T 1636 的附錄 A 及參考美國 ASTM 標準（F3224-2017），使用磁共振影像技術(shù)（MRI）評估。在動物實驗中為了減少每個時間點處死的動物可以適當使用關(guān)節(jié)鏡和（或）磁共振技術(shù)評估局部組織再生與修復(fù)情況。局部取材時總體觀察指標中應(yīng)包含軟骨組織的完整性。

c）動物模型的選擇：盡管可能很難找到完美的關(guān)節(jié)軟骨損傷的動物模型，選擇和確定動物模型的適應(yīng)性需要充分論證。可參考 YY/T 0606.10 及文獻（Kitamura et al.）中描述的許多評價關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)或替代產(chǎn)品的臨床前實驗動物模型。但是，不是所有的方法都適用于一種特定的軟骨修復(fù)或替代產(chǎn)品。評價軟骨修復(fù)試驗時最常使用的大動物模型是山羊、綿羊，犬、豬也被用于評價軟骨修復(fù)的模型（YY/T 0606.10，Kitamura et al.，Ahern et al.，郝春香等，張雨等）。選擇模型時需要比較動物模型損傷大小和負載，年齡，骨發(fā)育成熟度，關(guān)節(jié)軟骨損傷類型（如：類型、大小、深度等）和關(guān)節(jié)軟骨損傷的位置。應(yīng)闡述關(guān)節(jié)軟骨損傷的準備方法，創(chuàng)面的總體描述和組織學(xué)評價，并描述各種機械性能（力學(xué)）評價及其適用性。

d）可以同時使用大型、小型動物進行組合研究以評估產(chǎn)品的降解、耐久性、安全性和有效性。

e）對于含有人體細胞的產(chǎn)品，在動物體內(nèi)進行研究時通常需要使用免疫抑制劑，防止對產(chǎn)品產(chǎn)生排斥反應(yīng)，或者針對所選擇的實驗動物使用同源細胞產(chǎn)品。同源細胞產(chǎn)品是指源于同種動物的細胞用于實驗，其與最終應(yīng)用于臨床的細胞產(chǎn)品的特性和生物活性相似。在使用同源細胞做毒理實驗前，應(yīng)在初步研究中描述與人源細胞產(chǎn)品類比的水平。

f）在設(shè)計含細胞等活性成分的軟骨再生修復(fù)產(chǎn)品的非臨床試驗時，可參照有關(guān)細胞治療產(chǎn)品的指導(dǎo)性文件。

參考上述條件，任何一種大型動物物種都可能適合研究的設(shè)計，以支持關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)或替代產(chǎn)品安全性和有效性。然而，在選擇動物模型的物種時仍需要慎重考慮，該模型應(yīng)能反映臨床預(yù)期效果，闡述非臨床研究動物模型的選擇依據(jù)和合理性。可先進行預(yù)實驗來分析產(chǎn)品對選擇的動物物種的適用性。可能需要許多不同的動物試驗研究和/或物種研究，針對單一產(chǎn)品的功能和潛在毒性方面建立合適的模型。而且實驗數(shù)量需要根據(jù)產(chǎn)品的相關(guān)結(jié)構(gòu)和生物特性而定，而不是根據(jù)產(chǎn)品組成而定。

A.3 動物實驗研究的主要信息

動物實驗研究應(yīng)包括如下主要信息：

a）完整的動物實驗方案，無論是不利的還是有利的，只要是有關(guān)評價被研究產(chǎn)品的安全性和有效性的信息。

b）動物實驗報告中至少要包含：研究目的，動物模型的合理性，構(gòu)建模型的詳細方法，包括制備、尺寸和軟骨損傷的位置、固定的時期、實驗動物的步態(tài)分析報告、列出的所有參數(shù)適用性，病理學(xué)，組織學(xué)和放射學(xué)評價，詳細描述動物實驗的產(chǎn)品與臨床試驗的產(chǎn)品之間的不同之處。

再生型關(guān)節(jié)軟骨植入物產(chǎn)品在植入初期往往不能完全承受負荷（如一種由骨膜或柔性支架固定的細胞產(chǎn)品），最終在體內(nèi)形成承重組織。對于這些產(chǎn)品，可在合適的動物模型上于再生的軟骨組織成熟后，在離散時間點上描述（測試）各種力學(xué)特性。應(yīng)該首先評估產(chǎn)品在加載的關(guān)節(jié)內(nèi)維持其位置的能力(對固定或界面強度的分析)，然后繼續(xù)評估這個特性，同時對新形成的組織進行評估，以確定其承受應(yīng)用負荷的能力。這些測試的樣本可能包括從動物模型或其他適當?shù)臉颖局幸浦驳脑偕M織。當臨床產(chǎn)品和測試產(chǎn)品之間存在差異時，應(yīng)該解釋為什么結(jié)果與該產(chǎn)品的臨床安全性有關(guān)。