CAR T細胞治療在血液惡性腫瘤中的進展與挑戰

王 瑤 韓為東 (中國人民解放軍總醫院生物治療科，北京 100853)

CAR分子由識別抗原的單鏈抗體(scFv)與T細胞活化域(通常包括CD3 Zeta鏈)組成[1-3]。這些分子通過逆轉錄病毒或者慢病毒等基因工程手段整合到T細胞上。第一代CAR僅具有一個CD3 Zeta信號域而缺少T細胞持續應答[4，5]。而第二代CAR具有CD3 Zeta信號域以及其他共刺激分子(通常為CD28或者4-1BB)，使CAR T暴露于抗原后能夠有效地擴增[6]。第二代CAR結構的持久性成為當前CAR T細胞“活體藥物”產生的基礎[4]。CAR被設計成與特定抗原結合，引發CAR T細胞活化，而沒有傳統上由特異性T細胞受體和主要組織相容性復合物(major histocompatibility complexes，MHC)賦予的雙重限制[7,8]，由于其識別不受MHC限制的獨立性使之具有與T細胞或TCR T完全不同的抗腫瘤優勢。現已證明，靶向CD19抗原的CAR T細胞具有較高的誘導緩解率[9]。除了B細胞惡性腫瘤之外，CAR T最新在骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤以及CLL等惡性血液腫瘤中的進展也同樣迅速。此外，針對CD19靶點CAR T治療的后續問題也逐漸暴露，立足于解決CAR T治療后復發和CAR T本身效能不足引起的療效欠佳的臨床問題，國際上同樣有很多最新的研究結果。 這里，我們總結了CAR T在多種血液惡性腫瘤治療中的進展和更新，仍然存在有待克服的挑戰。

1 B型急性淋巴細胞白血病(B-ALL)

2012年4月，首個B-ALL的兒童被實施靶向CD19的CAR T(CAR T-19)細胞治療[10,11]，盡管出現了威脅生命的細胞因子釋放綜合征，但該兒童仍獲得了持續完全緩解(>6年)。隨后，CAR T-19細胞在治療復發和/或難治的表達CD19的B細胞惡性腫瘤的早期試驗中取得了空前的成功，許多患者獲得了長期緩解并可能治愈[12-14]。美國FDA批準了兩種不同的抗CD19 CAR T細胞產品用于治療B-ALL和彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，分別是包含4-1BB共刺激分子的Tisagenlecleucel(tis-cel)(kymriah,諾華)和包含CD28共刺激分子的axicabtagene ciloleucel(yescarta,凱特)。CAR T細胞療法的出現改變了復發難治性(R/R)B-ALL的治療模式，將成人R/R ALL的完全緩解(CR)率從傳統治療方法的29%(18%～44%)提高到80%以上[15-17]。最新關于tis-cel的多中心數據顯示[16]，治療ALL的整體CR率為81%，報道時尚未達到中位生存期，CAR T在患者體內持續存在超過20個月。而包含另一種共刺激分子CD28的CAR T-19治療53例R/R ALL，CR率為83%，整體中位生存期(OS)為12.9個月，其中骨髓原始白血病細胞<5%患者的OS為20.1個月。毫無疑問，CAR T-19治療B-ALL是迄今為止最成功的癌癥治療模型。對比兩種不同共刺激分子，4-1BB的CAR T治療的患者未觀察到腫瘤負荷與療效的線性關系，CD28的CAR T腫瘤負荷與預后相關。有研究提示4-1BB體現在體內持續存在時間的優勢，CD28體現在更強更快速的細胞溶解能力[18,19]。但目前仍沒有任何平行數據明確兩種共刺激分子的CAR T臨床治療效果哪個更有優勢。

與所有癌癥治療一樣，CAR T細胞治療也會產生相應的不良反應。①B細胞缺乏是CAR T-19治療后最常見的不良反應，臨床應用補充免疫球蛋白可以降低由于體液免疫缺失帶來的不良后果，B細胞缺乏在體內CAR T-19消失后可恢復。②CRS是CAR T-19治療后另一個常見并可預期的不良反應。在ALL治療中發生率為29%～77%等，其嚴重程度與腫瘤負荷相關[20,21]，在CAR治療后無臨床反應的患者中并不常見。CRS的發作與CAR T細胞的藥代動力學特征相關，發生時間與體內CAR T細胞的擴增峰值時間存在關聯。嚴重情況下，CRS可發展為危及生命的毛細血管滲漏，同時伴有低氧和低血壓；并與吞噬性淋巴細胞增生及巨噬細胞活化綜合征有許多相同的特征[22]。妥珠單抗(Tocilizu-mab，Actemra)通常可有效治療CAR T細胞誘導的嚴重CRS。③除CRS外，輕度到危及生命的神經毒性均有被報道，神經毒性的發生與白血病細胞是否有中樞系統浸潤無關[23]。神經毒性在ALL的CAR T-19治療中發生率約為40%(15%～60%)，可以從以輕度混亂、震顫和語言困難到完全性失語，癲癇、昏迷和腦水腫等多種形式表現出來。目前尚不清楚神經毒性引起的腦水腫是否是CRS的極端表現或者是獨立于CRS的不良反應。但CAR T-19引起的神經毒性通常是可逆轉的。雖然有研究表明單核細胞或內皮損傷可能與CRS發生有關，導致神經毒性發作，但由于缺乏研究CRS及神經毒性的動物模型，因此對CAR T細胞治療引發不良反應的機制了解甚少。

為了獲得長期的疾病緩解，一些研究中心將異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)作為CAR T-19治療后的鞏固療法。有研究顯示，CAR T細胞劑量水平較低(<1×105kg-1)可能是CAR T治療后疾病迅速復發的原因，對于治療劑量較低后橋接HSCT治療的患者，OS明顯優于未實施HSCT的患者[24]。而CAR T治療獲得深層MRD陰性緩解的患者，采用HSCT的后續治療并不能提高生存率[17]；另一方面，HSCT也可能無法消除CAR T治療后CD19陰性的ALL腫瘤細胞的增長[25]，因此CAR T治療橋接HSCT是否有意義仍然存在爭議。

CD22在B細胞和大多數B-ALL細胞表面廣泛表達[26]，CAR T-19治療后ALL細胞CD19丟失是治療復發的常見機制，但CD19丟失后ALL細胞通常會保留CD22，因此靶向CD22的治療是CAR T-19失敗后或者預防CD19陰性復發的一個治療策略。但臨床試驗結果顯示，CAR T-19治療復發并包含CD19弱/無表達的患者，單獨CAR T-22有效率低于CAR T-19治療，平均緩解期僅為6個月，CAR T-22治療緩解時間與是否采用過CAR T-19治療、CD19表達強弱以及能否達到MRD陰性緩解有相關性[27]。除了單獨CAR T-22臨床試驗外，同時靶向CD19/CD22的雙靶點CART和雞尾酒療法靶向CD19及CD22的CAR T細胞輸注臨床試驗也在進行[23]。目前有關雙靶點CAR T的臨床試驗結果摘要報道了臨床安全性，相對高的細胞治療劑量能夠在短期內使患者獲得CR。CAR T-22治療的CRS和神經毒性發生率與CAR T-19治療比較接近，由于沒有完整的長期觀察報道，治療后是否會出現CD19和CD22雙靶點陰性復發尚不明確。

2 B細胞型非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)

CAR T-19細胞對化療難治性/侵襲性B-NHL同樣產生了顯著影響。自2010年首次報道CAR T-19在B-NHL中取得成功之后[28]，綜合三個包括美國賓夕法尼亞大學、美國國家癌癥研究所(NCI)以及美國斯隆凱瑟琳癌癥中心開展的Ⅱ期臨床試驗結果，約40%的B-NHL患者可以通過CAR T-19獲得持續完全CR[29-31]。三家機構的CAR T-19細胞產品分別是以NCI研究基礎的axi-cel；賓夕法尼亞大學研究基礎的tis-cel和斯隆凱瑟琳研究基礎的liso-cel。其中axi-cel為CD28共刺激分子，而另外兩個CAR T-19是4-1BB共刺激分子；與axi-cel和t-cel不同，liso-cel將最終CAR T-19中的CD4與CD8細胞比例人工定位到1∶1。Ⅱ期臨床試驗包括的腫瘤類型有彌漫大B淋巴瘤(DLBCL)，高級別B細胞淋巴瘤(HGBL)，原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBL)和轉化型濾泡淋巴瘤(tFL)。axi-cel的治療CR率為54%，中位PFS為5.9個月；t-cel的治療CR率為40%，中位PFS僅為2.9個月；liso-cel的治療CR率為59%。t-cel在ALL的治療效果顯著，在B-NHL中似乎療效較弱于其他研究機構的CAR T-19；雖然其CR率較低，但體現了與眾不同的持續性，超過80%的CR患者能夠維持超過1年的完全緩解，50%首次治療評價為部分緩解(PR)的患者，在一年內進一步獲得了CR。除CD19靶點的CAR T治療外，靶向CD20的CAR T細胞治療同樣在B-NHL中也獲得了相似的CR率。來自中國解放軍總醫院的CAR T-20治療B-NHL Ⅱa期的臨床試驗觀察結果顯示，治療CR率為54%，中位PFS為10個月，最長一名患者持續緩解時間超過57個月，這也是全球范圍內CAR T治療報道的緩解時間最長的患者[32]。

與B-ALL的CAR T治療一樣，B-NHL采用CAR T-19或CAR T-20獲得顯著療效的同時伴隨著CRS和神經毒性的發生。不同臨床試驗顯示出CRS的發生率為39%～77%，超過3級以上的CRS為1%～23%；神經毒性發生率為15%～68%，3級以上神經毒性發生率為1%～18%。不同于ALL的治療，B-NHL的CAR T治療還包括其他特殊的不良反應，包括毛細血管滲漏綜合征、呼吸功能受損、消化道出血、溶瘤綜合征等[31-33]。已有研究結果顯示CAR T治療前采用化療淋巴細胞清除術會有效降低腫瘤負荷、CRS的發生程度以及延長疾病緩解時間。

雖然CAR T治療針對復發難治型B-NHL獲得40%～58%的CR率，但相比CAR T治療ALL獲得的超過80%的緩解率，CAR T在NHL的治療中還有提升的空間。一方面，對于消化道占位、神經中樞占位以及超大腫瘤負荷的患者，由于CAR T治療可能帶來致命性的不良反應而被排除在外。另一方面，CAR T治療后淋巴瘤的復發除了靶抗原丟失外還有CAR T細胞本身的耗竭。由于淋巴瘤具有類似實體腫瘤的腫瘤微環境，CAR T細胞更容易出現因為大負荷腫瘤抗原長期存在引發的耗竭，有臨床試驗開展CAR T細胞聯合免疫檢查點抑制劑治療B-NHL以降低腫瘤的復發。今后對于B-NHL、CAR T的后續研究方向更多集中在提高疾病緩解率，降低腫瘤復發率和不良反應控制率上。

3 多發性骨髓瘤

CAR T治療難治性多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是細胞治療領域內另外一個研究熱點。B細胞成熟抗原(BCMA；也稱為TNFRSF17)在惡性漿細胞上高度均勻表達，同時BCMA的表達水平隨著MM的發展而增加，因此BCMA是CAR T治療MM的理想靶點[34,35]。2016年首次報道了靶向BCMA的CAR T細胞治療MM臨床試驗結果，此研究開始于2013年，第一次證實了CAR T-BCMA對MM的有效性及安全性[34]。隨后，CAR T-BCMA治療MM的臨床試驗被多個中心開展。美國賓夕法尼亞大學報道的包含4-1BB共刺激分子的CAR T-BCMA顯示聯合高水平細胞劑量聯合環磷酰胺(Cy)的臨床反應率最高(64%)，3級以上的CRS和神經毒性發生率為32%和12%[36]。另外兩個備受關注的CAR T-BCMA細胞產品分別是來自藍鳥生物(Bluebird Bio)的bb2121和中國的南京傳奇的LCAR-B38M。bb2121的Ⅰ期臨床試驗結果顯示出更高的臨床反應率(85%)，CR率為45%，中位PFS為11.8個月。同時bb2121有相對低的不良反應率，3級以上的CRS和神經毒性發生率僅為3%和6%[37]。LCAR-B38M是針對BCMA雙表位包含4-1BB共刺激分子的CAR T細胞，2019年最新臨床試驗結果顯示，17例難治MM患者總緩解率為 88.2%，嚴格完全緩解率(sCR)為76%，3級以上CRS發生率為35%[38]。在CAR T-BCMA的臨床試驗治療中，CRS發生程度與骨髓瘤細胞表面BCMA豐度有相關性，CAR T-BCMA擴增能力與治療預后相關，之前接受過HSCT的患者具有更持久的臨床應答反應。除了單獨靶向BCMA之外，2019年徐州醫學院附屬醫院報道了同時輸注CAR T-19和CAR T-BCMA治療21例MM患者的臨床試驗。結果顯示出超高的臨床緩解率(95%)，治療CR率為43%[39]。雙重靶點的CAR T細胞組合可能是復發或難治性MM另一個有前途的治療選擇。鑒于針對MM的CAR T細胞治療臨床試驗的快速推進，BCMA應該是繼CD19之后第二個獲得批準上市應用的CAR T細胞產品的靶點。除了BCMA靶點外，包括靶向NY-ESO-1、Kappa輕鏈、CD44亞型變異體6(CD44v6)、CD56、CD38和CD138 的CAR T細胞治療MM的基礎研究和臨床試驗也在同步進行，但相對于BCMA靶點，抗上述靶點的CAR T細胞治療臨床MM患者病例較少，尚不能確定臨床治療效果[40]。

4 慢性淋巴細胞白血病

慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是常見的B細胞慢性淋巴細胞增生性疾病，主要影響老年人。雖然CLL的5年生存率是79.2%，但在許多患者中CLL仍然是無法治愈的疾病，尤其是難治復發性CLL預后非常差[41]。CLL是最早應用CAR T-19治療的疾病之一[42]，但應用經驗遠不如ALL和B-NHL廣泛。從2011年首例應用CAR T-19治療CLL的患者開始，截至2018年6月份，全球不同研究中心大概報道了總計134例CLL患者接受CAR T-19治療[43]，盡管與ALL治療中類似的CAR T-19細胞，治療結果卻令人失望。臨床反應率約有50%～70%，但CR率只有20%～30%，遠遠低于同類CAR T-19治療ALL和B-NHL的臨床治療結果[42]。對于HSCT后的復發CLL患者，供者來源的CAR T-19治療效果優于自體CAR T-19，且未見GVHD發生的報道[3,44]。CAR T-19治療CLL的不良反應與其他血液惡性腫瘤不良反應類似，由于每個報道患者數量均未超過30例，因此很難有準確的定位。CRS發生率為50%～100%，>3級的CRS發生率為25%～60%；神經毒性不常見(0～35%)，且少見3級以上神經毒性的報道。目前研究顯示CLL對CAR T細胞治療反應較低的原因多歸結于CLL患者固有的免疫導致T細胞表面耗竭指標(包括PD-1、CD244和CD160)異常增高、缺乏記憶細胞以及CD8陽性T細胞增殖能力弱和細胞毒性能力低[45,46]。針對CLL固有免疫存在的特征，有研究機構采用CAR T聯合BTK抑制劑-伊魯替尼進行CLL的治療，雖然病例較少，但整體緩解反應率超過80%。雖然伊魯替尼對CLL免疫系統的影響尚不明確，但有研究表明依魯替尼具有促進CAR T細胞的擴增，維持和促進細胞毒作用[47]。除了CD19靶點外，靶向受體酪氨酸激酶樣孤兒受體(ROR1)的CAR T治療CLL的臨床試驗在進行中。雖然CAR T在CLL治療中結果并不理想，但針對CAR T治療后獲得CR的CLL患者卻表現出非常好的預后，且復發率低，因此CLL患者的CAR T細胞療法主要挑戰是提高反應率和CR率。

5 T細胞惡性腫瘤 (T-cell malignancies)

雖然T細胞惡性腫瘤的總體預后因疾病類型而異，但與B細胞惡性腫瘤相比，通常要差得多。雖然CAR T在B細胞惡性腫瘤中取得了突破性進展，但對于T細胞惡性腫瘤存在很多障礙。對T細胞進行基因工程編輯以殺死惡性T細胞，而保留正常的T細胞過程更為復雜和具有挑戰性[48]：①從患者體內分離出完全純凈的正常T細胞用于制備CAR T細胞是技術難題。有文獻已經報道單個白血病母細胞在CAR T制備的同時意外被修飾，回輸給患者導致白血病復發死亡的臨床案例[49]。而對于T細胞惡性腫瘤患者采用自體CAR T療法所面臨的腫瘤細胞被修飾的風險極高。②T細胞腫瘤缺乏特異的腫瘤抗原。大多數T細胞惡性腫瘤表達的CD5、CD7或者CD3等，均是正常T細胞抗原。雖然在B細胞腫瘤的CAR T治療的不良反應中，正常B細胞會同時被清除，但B細胞缺乏不是致命的，可以通過補充丙種球蛋白彌補。但T細胞缺乏對于人類來說是致命的，因此目前只有少數在正常T細胞上表達受限的抗原被評估為治療T細胞惡性腫瘤的CAR靶點。包括CD30、CD37、CD1a和TRBC1[50-53]。但是，這些抗原僅在一小部分T細胞惡性腫瘤中表達，不能被廣泛應用。③存在“自相殘殺”[53]。由于CAR T細胞靶向的抗原均在正常T細胞表面表達，因此在制備過程中，會發生嚴重的自相殘殺而導致CAR T細胞制備數量嚴重不足。

針對這些障礙，目前針對T細胞惡性腫瘤大部分在臨床前研究。通過采用Casper技術敲除T細胞表面靶向抗原避免“自相殘殺”[54]；采用NK細胞或者γδT細胞來源制備CAR細胞來降低“自相殘殺”和腫瘤T細胞污染的風險；為了降低T細胞長期缺乏帶來的致命性風險，采用瞬時基因修飾技術或者安裝自殺基因等方式避免CAR T在體內形成記憶性而造成對正常T細胞持久殺傷[48]。

6 其他血液惡性腫瘤

急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)如同T細胞惡性腫瘤一樣，CAR T細胞治療在AML中也同樣缺乏特異的腫瘤抗原。目前已知的AML細胞膜上表達的腫瘤抗原在很多正常髓系細胞表面也表達，如CD33在成熟的中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞上表達，CD123在淋巴樣祖細胞上表達。動物模型已經證實采用CAR T細胞靶向CD33或CD123治療，AML細胞被清除的同時正常造血系統也被根除[55,56]。2014年全球首例靶向CD33的CAR T細胞治療在中國解放軍總醫院開展，1例AML患者經過CAR T-33治療后獲得了短暫的AML細胞清除，但同時合并重度骨髓抑制[57]。美國希望之城(City Hope)研究小組將活性降低的CAR T-123用于治療AML的臨床試驗，但同樣只有少數患者獲得了短期緩解，CAR T細胞活性降低似乎不能帶來有價值的治療效果。此外有研究機構嘗試應用mRNA電穿孔技術制備CAR T-123細胞，以消除CAR T細胞在體內長期存在而帶來的對造血系統長期的不良反應；或者在CAR T-123細胞治療后進行HSCT聯合治療；以及在CAR T-123載體中添加EGFR分子，細胞治療期間可以應用抗EGFR抗體消除體內的CAR T-123細胞來降低對正常造血系統的毒性[58,59]。今后CAR T細胞針對AML的治療更傾向于清除腫瘤細胞和維持正常造血系統的平衡，在安全性基礎上提高長期緩解率。

霍奇金淋巴瘤(HL)/間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)：經典HL和ALCL缺乏CD19的表達，針對這兩種腫瘤，中國解放軍總醫院和美國貝勒醫學院分別用靶向CD30的CAR T開展臨床試驗研究[50,60]。兩家機構在CAR T-30設計上包括scFv、共刺激信號、臨床方案和劑量均不同，但都表明了CAR T-30針對HL和ALCL有一定的抗腫瘤作用，不良反應發生率較低，多集中在1～2級。盡管兩項研究均顯示出良好的耐受性和部分腫瘤抑制效果，但與CAR T-19治療效果相比還相差較遠。目前仍有幾項不同載體設計的CAR T-30針對復發/難治性淋巴瘤中的臨床試驗在進行，期望通過CAR結構設計和臨床聯合方案提高對HL/ALCL的治療效果。

7 展望

雖然CAR T細胞療法正在成為治療血液惡行腫瘤一個有力的治療手段，但對于CAR T治療腫瘤其實剛剛開始，許多重要的生物學問題仍有待解決。包括優化CAR信號，確定最佳的腫瘤特異抗原，優化CAR T細胞的制造方法，提高CAR T細胞療法的安全性，最佳組合的選擇策略，以提高改善CAR T細胞的治療潛力，擴大更多有效的治療腫瘤類型。解決CAR T治療后的復發、先天性抵抗以及腫瘤微環境、耗竭等各種問題，將勢在必行。遺傳修飾能滿足提高CAR T本身效能不足或者降低耗竭，以及改進歸巢至腫瘤及維持體內持久性，可以設想作為將來在CAR T研究的一個方向。