睪丸發育相關基因1在腫瘤中的效應和機制

趙俞喬關滄海吳昊天胡增濤姜興明

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院普通外科,哈爾濱 150086)

長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200 bp 的非編碼調控RNA 分子,因其缺乏開放性閱讀框而不具備或僅具備有限的蛋白質編碼能力,曾被認為是基因轉錄的“噪音”[1]。近年來長鏈非編碼RNA 相關的生理功能逐漸被闡明,越來越多的證據表明其參與染色質重塑、轉錄后調控、蛋白質翻譯和組蛋白乙酰化等諸多生物學進程,并在多種人體惡性腫瘤中異常表達且與腫瘤細胞增殖及侵襲轉移密切相關[2-4]。睪丸發育相關基因1(testis developmental related gene 1,TDRG1)是一個長度為1939 nt 的lncRNA,定位于人類染色體6p21.2 區域,能夠編碼100 個不具備任何已知蛋白結構域的氨基酸;最初認為該基因是一種僅在睪丸組織中表達的睪丸特異表達基因并推測其功能與精子發生相關[5-6]。目前研究表明:TDRG1 不僅在再生障礙性貧血中發揮作用[7],并且在多種惡性腫瘤中呈現異常表達,對腫瘤診斷、治療和預后評估等方面有潛在的應用前景。本文就TDRG1 在腫瘤發生發展中的生物學效應和分子機制作一綜述。

1 TDRG1 與惡性腫瘤

1.1 TDRG1 與宮頸癌

宮頸癌是全球癌癥相關死亡的第三大原因[8-9]。范陽等[10]利用實時熒光定量聚合酶反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)對60 例宮頸癌患者腫瘤組織和鄰近正常組織中的TDRG1 表達進行檢測,結果顯示TDRG1的表達在宮頸癌組織中呈明顯上調;TDRG1 表達情況與臨床數據的分析結果表明TDRG1 的高水平表達與癌腫分化程度及淋巴結轉移密切相關;Kaplan-Meier 和log-rank 分析證實TDRG1 過表達患者的總體預后更差;多因素分析證明高表達TDRG1 是宮頸癌患者預后不良的危險因素[10]。在上述研究的基礎上,Zhao 等[11]同樣發現TDRG1 在宮頸癌中的異常高表達;并利用小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA)在克隆形成實驗、MTT 及 Transwell 實驗中敲低TDRG1 的表達后發現宮頸癌的增殖和遷移侵襲受到明顯抑制。流式細胞術結果顯示對照組細胞凋亡率由12.80%增加至36.8%,而siRNA處理的實驗組細胞凋亡率由33.5%增加至53%,細胞凋亡率明顯提高且細胞周期被阻滯于G1 期。生物信息學分析、qRT-PCR 檢測和雙熒光素酶實驗結果表明TDRG1 與miR-330-5p 間存在特異性結合位點(GUCCCAGAG)且兩者表達水平呈負相關(R=5.119,P＜0.0001),miR-330-5p 抑制劑能夠部分逆轉TDRG1 siRNA 對宮頸癌進展的影響。Western blot 結果顯示:miR-330 - 5p 靶基因ELK1(ETS transcription factor ELK1)的表達與TDRG1 呈正相關而與miR-330-5p 呈負相關。上述實驗結果提示:TDRG1 通過充當miR-330-5p 的競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)上調促癌基因ELK1 的表達來促進宮頸癌的惡性進程。此外,Jiang等[12]的研究表明TDRG1 的高水平表達與 FIGO(international federation of gynecology and obstetrics)分期以及癌腫浸潤深度密切相關,同時發現TDRG1的另一海綿吸附靶點miR-326;進一步研究發現,miR-326 能 與 促 癌 基 因MAPK1 的 3’-UTR(untranslated region)相結合,抑制TDRG1 可降低MAPK1(mitogen-activated protein kinase 1)的表達,即TDRG1 能夠通過TDRG1/miR-326/MAPK1 軸調節宮頸癌的發生和發展。

1.2 TDRG1 與上皮性卵巢癌

研究指出lncRNAs 在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)中的作用與機制對腫瘤治療和患者預后評估有重要作用[13-15]。Chen 等[16]利用qRT-PCR 定量檢測95 例上皮性卵巢癌患者的組織樣本后發現:相比于正常卵巢組織,EOC 腫瘤組織內TDRG1 呈明顯上調,并且其表達水平與腫瘤的分化程度密切相關(P=0.043)。體外細胞實驗中構建質粒表達載體外源性上調TDRG1 能夠促進腫瘤細胞的增殖和遷移侵襲能力并抑制細胞凋亡發生,利用siRNA 干擾TDRG1 的表達則會得到與上述相反的結果。生物信息學預測和雙熒光素酶報告實驗證實TDRG1 與miR-93 之間存在結合位點,并且兩者在腫瘤組織內的表達水平呈負相關;Western blot 實驗結果顯示TDRG1 能夠上調miR-93 靶基因腫瘤轉移關鍵基因RhoC(ras homolog family member C)及RhoC下游因子(P70S6K、Bcl-xL、MMP-2)的表達進而促進EOC 的侵襲轉移。

1.3 TDRG1 與子宮內膜癌

近年來子宮內膜癌的發病率由于肥胖癥和代謝性疾病患者增加而趨于年輕化[17]。Sun 等[18]的研究證實在子宮內膜癌腫瘤組織和腫瘤細胞中TDRG1 呈上調表達,利用siRNA 外源性沉默TDRG1表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖和遷移侵襲,并且發生凋亡的細胞比例明顯升高。Western blot 檢測結果表明在腫瘤細胞中轉染siRNA 后與腫瘤侵襲和轉移密切相關的MMP-2(matrix metallopeptidase 2)和MMP-9(matrix metallopeptidase 9)表達降低,同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 并誘導細胞凋亡標志物Bax 和裂解型caspase3 的表達;TDRG1 過表達能夠上調腫瘤細胞中 p-pi3k、p-AKT 和p-mTOR 的蛋白表達水平而外源性沉默TDRG1 后上述蛋白表達下降,這提示PI3K/AKT/mTOR 信號通路參與TDRG1對子宮內癌膜惡性生物學行為的調控。進一步的RIP(RNA binding protein immunoprecipitation) 和Western blot 實驗結果表明:TDRG1 能夠直接與VEGF-A(vascular endothelial growth factor A)結合并促進其表達,高表達VEGF-A通過上調抗凋亡蛋白 PI3K、Bcl-2、MMP-2 和 survivin 的表達從而發揮促癌作用。綜上,TDRG1 可以調控VEGF-A和相關基因的表達來促進子宮內膜癌的增殖和遷移侵襲[19]。

1.4 TDRG1 與胃癌

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤,也是癌癥致患者死亡的主要原因[20-21]。Ma 等[22]利用 qRTPCR 測定42 例胃癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織中TDRG1 的表達水平,結果顯示胃癌組織中TDRG1呈顯著高表達;根據TDRG1 表達水平將胃癌患者分為TDRG1 高表達組和TDRG1 低表達組,同時對胃癌患者的臨床病理數據進行統計學分析,數據結果發現TDRG1 高表達與腫瘤的臨床分期、遠處轉移及患者較差的預后密切相關。隨后的體外細胞實驗,通過MTT、細胞劃痕實驗和Transwell 實驗檢測,結果表明上調TDRG1 表達后胃癌腫瘤細胞SGC-7901和MGC-803 的增殖及遷移侵襲能力明顯提高;在裸鼠成瘤實驗中過表達TDRG1 的體內移植瘤的生長速度加快。生物信息學分析和RNA 免疫沉淀實驗證實TDRG1 可以海綿吸附抑癌基因miR-873-5p 來降低其表達;雙熒光素酶實驗證實miR-873-5p 與促癌基因HDGF(heparin binding growth factor)間存在靶向結合調控關系,定量檢測結果顯示胃癌腫瘤組織內兩者表達呈負相關。綜上,胃癌中高表達的TDRG1 通過對miR-873-5p/HDGF軸的調控來促進腫瘤的惡性生物學行為。

1.5 TDRG1 與非小細胞肺癌

肺癌約占所有腫瘤的19.4%,而非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的近 80%[23-24]。Hu 等[25]收集了 34 例非小細胞肺癌的病理組織樣本,利用qRT-PCR 檢測發現TDRG1 在NSCLC 組織中的表達與癌旁組織相比顯著提高。MTT 實驗結果顯示TDRG1 的特異性siRNA 轉染A549 和H1975 細胞后,腫瘤細胞的增殖受到明顯抑制,而過表達TDRG1 能促進非小細胞肺癌細胞的生長。細胞劃痕實驗和Transwell實驗證實沉默腫瘤細胞內TDRG1 的表達能夠明顯抑制細胞遷移和侵襲轉移。Western blot 實驗發現腫瘤細胞內TDRG1 的表達與E-cadherin 呈負相關而與N-cadherin 呈正相關,這表明TDRG1 能夠促進上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進程。進一步實驗證實 miR-206 與TDRG1的3’-UTR 存在 10 個互補序列同時與ZEB1(zinc finger e-box binding homeobox 1)也存在特異性結合位點;上述實驗研究結果提示TDRG1 能通過靶向結合miR-206 進而上調促癌基因ZEB1的表達。

2 結語及展望

TDRG1 作為一種新發現的lncRNA,其在腫瘤內功能的相關研究尚處于初始階段,不同腫瘤內TDRG1 的異常表達水平以及更深層面的調控機制有待于后續的進一步探索。相信隨著實驗技術的發展,TDRG1 在腫瘤發生發展中作用機制的相關研究將更加深入,并且為腫瘤的早期診斷、綜合治療及患者預后評估指明新的方向。