甜葉菊創新性提取和分離純化方法的研究進展

張濤俊 周瑩婷 何建敏 魏淵

( 1.江蘇華泰重工裝備有限公司，江蘇 丹陽 212300；2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013 )

0 引言

甜葉菊(學名：Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl.)是菊科、甜菊屬的多年生草本植物，原產于南美巴拉圭和巴西交界的高山山脈，當地人們常將甜葉菊的葉子作為佐料加入到食物和飲料中。甜葉菊葉片提取物中的甜菊糖苷(Steviol Glycosides,SGs)是作為甜味劑的主要成分，其中口感最佳且含量最高的兩種糖苷是Rebaudioside-A(RA)和Steviolside(Ste)。甜菊糖苷制得的精品為白色粉末，具有低熱量和高甜度的優點，是食品及藥品工業的原料之一。本篇綜述圍繞甜葉菊的創新性提取技術和純化方法展開描述并與傳統方法進行比較，主要目的旨在增加對甜葉菊的了解，并概述目前最新出現的創新性研究進展。

1 創新性提取技術

1.1 高速剪切勻漿技術和渦輪萃取法

高速剪切機的原理是在電機驅動下內外切割器以相向方向高速旋轉，產生強大的高剪切力，快速的粉碎物料，同時使物料和提取溶劑激烈的碰撞，在超短時間內完成提取過程。而后，為了進一步升高提取效率降低能耗，研究人員開發出了渦輪增壓萃取技術。渦輪增壓提取的原理是將空氣壓縮至容器中，增大容器中壓力，并產生具有攪拌作用的氣流，充分分散溶劑以促進物料的傳質。結合高速剪切勻漿技術，更加短時高效的提取物料中的有效成分。Martins.P.M 對甜葉菊的渦輪萃取工藝進行優化，研究了物料粒徑、提取溶劑和物料比等因素對甜菊糖苷SGs、RA 和Ste 得率的影響。最后確定的最佳萃取工藝為：乙醇濃度70%、物料粒徑780μm、物料比1:10、提取18min、溫度23℃、渦輪機轉數20000r/min。同動態浸漬法對比，優化后萃取工藝18min 的得率與動態浸漬法1h 的得率相當[1]。表明，渦輪萃取法短時高效且低能耗，是一項很有應用前景的提取方法。

1.2 加壓熱水提取法

為了避免和減少甜葉菊提取過程中有機溶劑的使用，更加環保和安全的生產甜菊糖苷SGs, á.Németh 開發了加壓熱水提取法，其優點在于可以調節提取過程中的壓力，在高于溶劑沸點的溫度下萃取，高溫在增加甜菊糖苷SGs 溶解度的同時，不斷改變的壓力還可以增加溶劑穿過物料孔隙時的擴散速度。而后，因為葉片溶脹幾乎完全吸收了提取溶液水，傳統的離心過濾達不到分離要求，因此采用了壓榨法分離提取液。最后，選用噴霧干燥得到粗提取物。且對比未干燥的提取液，噴霧干燥后粉末穩定性提高，且目標產物甜菊糖苷SGs 的口感更好。此外Formigoni.M 等人還發現使用乙醇預處理后提取出的甜菊糖苷SGs 比未處理過直接提取的SGs 的雜質含量更低，且純度更高。因此可以考慮在使用加壓熱水提取法前，預先用乙醇處理甜葉菊葉片，最后制得的目標產物SGs 不僅純度高口感好，產率也會顯著提升。

1.3 微波輔助亞臨界水提取法

亞臨界水是將水加熱到沸點至臨界點100～374℃，系統壓力在2.6bar左右使其依舊保持液體狀。液態水的性質發生改變，溶解溶質的能力增強，擴散速率提高，極性、粘度和表面張力下降。微波輔助的協同作用在于驟然系統溫度，達到產生亞臨界水的要求，且加強水分子穿透物料。而且，微波輔助亞臨界水提取在1min 內的SGs 提取率與70%乙醇超聲45min 的提取率相當。這表明它在工業大規模生產中具有很大的應用前景。此外Rouhani 等人還開發了超聲輔助甘油萃取法，具有類似的協同增強原理，即超聲技術的熱效應和空化效應促進甘油對植物細胞壁的滲透作用，提取過程綠色無污染，也很適用于食品行業的生產。

1.4 快速固-液動態萃取技術

快速固-液動態萃取技術是使用Naviglio 萃取器，采用循環加壓萃取法結合浸漬法的一種高效提取方法。Naviglio 萃取器原理是固體物料內部和萃取液體之間存在負壓梯度，迫使固體物料中可溶性組分溶出。而循環加壓可以誘導固體物料表面形成新的擴散通道，且變化的壓力可以驅動萃取劑在擴散通道中往復運動，增強溶質和溶劑的相互作用。Gallo.Monica 通過實驗對比其與80℃熱水浸漬法的得率，結果表明80℃熱水浸漬法下甜菊糖苷SGs 的提取率更高，但是在能耗方面，快速固-液動態萃取技術在室溫下即可進行，因此耗能更低。且80℃熱水浸漬法的雜質率更高，提取的SGs 的純度也低于前者。

2 分離與純化

2.1 鈣-二氧化硅微球

二氧化硅微球是多用于藥物控釋研究的載體材料，因其具有獨特的多孔外殼結構，強負載性、較大比表面積和高滲透性的優點，近年來也開始用于雜質純化。Ca2+是提取過程中理想的除雜離子。而鈣-二氧化硅微球結合了二者的優點，具有非常好的雜質吸附能力。Meric.GamzeGunduz 等人采用溶膠-凝膠微膠囊化方法將Ca2+添加到二氧化硅微球里制備出可循環使用且高效吸附的鈣-二氧化硅微球，考察了在甜菊糖苷SGs提取過程中的影響，并比較了三次循環使用后的除雜效果，發現其不會損失SGs，在多次使用后還會依舊保持優秀的除雜能力。反觀只能在低PH 環境下使用的海藻鈉珠，雖然除雜效率高但是甜菊糖苷SGs 的損失率也很高。實驗還表明，鈣-二氧化硅微球的除雜率與使用有機溶劑除雜的效果相當[2]，但考慮到環保和安全問題，在甜菊糖苷SGs 生產中優先推薦使用鈣-二氧化硅微球。

2.2 超濾膜

使用膜分離法最大的困擾便是膜污染后，總是需要清洗膜表面或更換新膜才能繼續過濾，致使過濾的時間延長效率降低。而要使膜表面在保持無污垢狀態下持續過濾，就需要通過壓力調節滲透通量使其低于能產生污垢的臨界通量。Camilo 為了縮短過濾時間，使用高性能切向流以使過濾過程保持在可持續穩定狀態，還可分散積累在膜表面的溶質提高擴散分布。且使用連續脫硝技術以快速高效的清洗污染后的膜表面。該分離方法為二次過濾，先用0.2μm 的微孔濾膜初濾甜葉菊水提液中的不溶性雜質，再用15/3KDa 膜進行二次超濾(3KDa 的膜除雜率略高于15KDa 但RA 和ste 的回收率略低，15KDa 膜上雜質保留量相對更少易清洗，但是總體上二者區別不大，可以替換使用)。測試在過濾效率相同時，這種可持續通量下兩次膜分離法比單濃度法和連續重濾法過濾效率更高且耗時更短。此外，在Das.Ariji 研究中還發現膜孔增大，滲透通量不一定會增加。原因在于膜孔內吸附的溶質和雜質也相應增多，且膜上形成的動態濾餅層造成了嚴重的濃度差極化，導致滲透通量嚴重下降。此時，就只能通過加壓和增流來改善膜的滲透通量。同時為了提高防污性能且不增加過濾過程中甜菊糖苷SGs 的損失率，Roy.Anirban 使用二甲基乙酰胺DMAC 將親水的醋酸纖維素材料和疏水的聚丙烯腈材料混合制成聚合物共混膜，考慮到溶液的滲透性與膜親水性成正比，最佳混合比例為10:10(重量百分比)，并篩選出90KDa 的膜分子量最佳，SGs 的損失率最低且穩態通量最高。

2.3 生物大分子絮凝劑

生物大分子絮凝劑是由微生物代謝產生并分泌至細胞外的具有絮凝和滲透作用的高分子物質，包括糖蛋白、多糖、纖維素、蛋白質和DNA 等。王菁莎等人在甜菊糖苷提取過程中，對比傳統鹽類絮凝劑FeCl3和KAl(SO4)2·12H2O 與生物大分子絮凝劑多糖螯合物的透光率和除雜率：鹽類絮凝劑都對目標產物不具有選擇性，除雜過程中會造成SGs 損失，而且二次吸附和Cl-等有色離子也會對透光率產生一定的影響；生物大分子絮凝劑多糖螯合物溶于水后，顯現出獨特的金屬離子-多齒體的空間結構，可吸收提取液中的大分子雜質而不影響SGs 的含量，絮凝機制尚不清晰，應該與絮凝劑的結構、帶電荷、構象、離子鍵和氫鍵形成相關[3]。綜合實驗結果，生物大分子絮凝劑的不僅用量最少，除雜效率最高，而且不會造成目標產物SGs 的含量變化，是優良高效的除雜劑。

2.4 吸附樹脂

2.4.1 非極性大孔樹脂與甜葉菊母糖液

甜葉菊商業用途很廣，在生產工業結晶出RA、ste 等主要甜菊糖苷SGs 后，余留的母糖液多是廉價出售或直接廢棄。而實驗檢測發現母糖液中仍有60%的SGs 成分，但是因為含雜質量高，苦味較重，因此考慮可以進一步純化利用。Liu Yaxian 等人研究了以非極性大孔吸附樹脂NDR-1 進一步純化母糖液的工藝，通過添加電解質NaCl 和醇類精確的調節溶劑極性。發現10%～30%乙醇與雜質類極性相溶所以解吸雜質的能力最強，但解吸甜菊糖苷的效果不好。這是因為SGs 和雜質的結構不同，因此在極性洗脫劑中的被解吸的臨界值不同。

2.4.2 季氨基改性吸附樹脂

工業上要得到純凈的甜菊糖苷SGs 提取流程非常繁瑣，其中除雜、脫鹽脫色和精除雜就要使用4 種以上的不同類型的樹脂，洗脫溶劑的用量非常大，操作過程也非常耗時耗力。Rongfu等人通過將季氨基引入到吸附樹脂中，成功合成了同時具吸附功能和脫色功能的高分子改性樹脂，可以將樹脂除雜、脫鹽脫色步驟壓縮至一步，減少了洗脫溶劑的用量，更加高效、經濟和環保。分析季氨基改性的原理，是通過加強SGs 與樹脂的疏水締合作用增強樹脂吸附能力，且季氨基暴露在水中的部分能給予樹脂離子交換能力用于脫鹽脫色。但是需注意的是隨著季氨基的引入量增大，改性后的樹脂脫色能力增強，但對SGs 的吸附能力會減弱。

3 結語

工業上生產甜菊糖苷時，可以使用一些現代工藝如高速剪切法、亞臨界水、超聲和微波輔助技術，結合渦輪機等高效生產設備，可以顯著的提升甜菊糖苷SGs 的提取效率，且對比傳統提取工藝也相對更加的綠色安全。此外，近年來生物大分子絮凝劑、高分子膜和二氧化硅微球等材料，也開始逐漸涉入雜質純化鄰域，這也體現了各個研究鄰域的互通性。當代科技水平在迅猛發展，我國又是糖消耗大國，需求促進了科技創新，而且甜菊糖苷SGs 的提取和分離純化方面也存在巨大的發展空間，未來必定會有更優更高效更環保的生產技術和提取手段。但是，目前工業生產也存在一大迫切需要解決的問題，即減少生產過程中提取溶劑的消耗，若能達到‘無溶劑提取’則會更大化經濟價值，這也必然成為今后甜葉菊鄰域的研究重點。