宮內感染動物模型的研究進展

黃清梅白發明朱云蕾韋冰梅陳玉君

(廣西醫科大學第二附屬醫院兒科,南寧 530007)

宮內感染是指病原微生物侵入羊膜腔引起的羊水、胎盤(蛻膜、絨毛膜和羊膜)及胎兒的感染。宮內感染是引起早產的主要原因,約占早產原因的50%[1-4]。 宮內感染引起的早產可增加新生兒敗血癥、新生兒呼吸窘迫綜合征、新生兒壞死性小腸結腸炎、支氣管肺發育不良、動脈導管未閉、腦出血、聽力障礙、腦性癱瘓等疾病的發生風險[5-7]。 然而,關于宮內感染的發病機制及其引起的早產兒多臟器損傷的機制目前尚未明確。 因此,建立重復性高、穩定性好的宮內感染動物模型對深入研究宮內感染的發病機制、發生發展及早期干預,預防或減輕宮內感染分娩母嬰不良結局具有重要的意義。本文就目前宮內感染動物模型建立的研究進展進行綜述。

1 動物模型的選擇

研究宮內感染的動物模型主要包括嚙齒類動物、羊、豬及靈長類動物。 羊是較早用來研究分娩機制的動物。 羊的妊娠期較長(約147 d)、單胎,有利于縱向標本收集及研究宮內感染致病菌長期暴露或藥物干預對胎兒的影響,且羊的體積龐大,母羊和胎兒在妊娠期間均能接受長期置管及手術干預研究。 但羊的價格昂貴、性成熟和繁殖慢,且基因組和免疫學尚未完全明確[8],使其在實際實驗研究的應用上受到限制。 靈長類動物在子宮解剖結構、妊娠期長短、分娩過程及產仔數等方面與人類極為相似,但靈長類動物價格相對昂貴、倫理要求高,且是人畜共患疾病的潛在來源,因此較少用于宮內感染動物模型的研究。 嚙齒類動物中的大鼠和小鼠因相對經濟、易于飼養、妊娠期短(大鼠約為22 d,小鼠約為20 d)、能夠快速達到性成熟、繁殖快、易于管理及實驗操作等特點,因此大鼠、小鼠最常用于宮內感染動物模型的研究。 大鼠分娩時在調節子宮收縮的分子途徑方面與人類有相似之處,比如催產素受體(oxytocin receptors,OTR)和縫隙連接蛋白connexin 43 等分子的上調、參與cAMP-PKA信號通路的分子和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等分子的下調[9-10]。 然而,使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或者大腸桿菌建立大鼠宮內感染模型引起早產兒分娩的實驗方法較有限,需要連續注入LPS 才能成功誘導早產兒分娩[11];也有研究報道[12],使用大腸桿菌建立宮內感染大鼠模型并不能引起早產兒分娩,而大鼠對宮內感染刺激不敏感的原因目前尚未明確。 相比較而言,使用LPS 或大腸桿菌等通過腹腔注射或羊膜腔內給藥途徑建立宮內感染模型在小鼠中成功率較高[11],且小鼠的基因組與人類較相似,具有較好的免疫系統特征,并受益于大量的商用抗體、小干擾RNA (siRNA)和微陣列平臺的可用性,故得到廣泛使用。

2 宮內感染造模的相關病原體

2.1 大腸桿菌或LPS 誘導的宮內感染模型

大腸桿菌是泌尿生殖道的條件致病菌,在一般情況下不會致病;但在胎膜早破或機體免疫力下降時,泌尿生殖道細菌上行性感染可引起宮內感染。研究表明[13-15],大腸桿菌是引起宮內細菌感染的最常見病原菌之一。 因此,大腸桿菌或者來源于大腸桿菌的LPS 最常用于宮內感染模型的建立。 2004年,袁天明等[16]選擇對孕15 d 的大鼠麻醉后于下腹作1.5 cm 正中切口,找到左右子宮角并分別于兩個胎囊之間每毫升接種1.5×108～2.0×108個的大腸桿菌懸浮液0.2 mL,以子宮壁及胎盤內血管充血、水腫,并見大量中性粒細胞浸潤表明造模成功。該法建模后母鼠無明顯臨床癥狀,但子宮及胎盤病理變化明顯,早產率為70%,由于該方法接種的是活菌,其造模后引起的宮內感染過程與人類自然感染的亞臨床型宮內感染過程較接近,可用于宮內感染對早產兒相關疾病影響的研究。 但該造模方法手術操作難度大、對孕鼠創傷大、大腸桿菌用藥劑量較難把控,且有創操作術中術后潛在的外界污染可能加重宮內感染的過程。 因此,采用該造模方法進行宮內感染的研究受到一定的限制。

針對上述造模方法的缺點,經過研究者不斷的改進,有些缺點已逐漸得到改善。 如:Burd 等[17]和Elovitz 等[18]將LPS 替代大腸桿菌注射于孕鼠兩個胎囊之間成功復制了小鼠宮內感染模型,用于研究宮內感染對胎兒腦損傷的影響。 該造模方法能成功誘導宮內感染局部炎癥反應過程,且能夠根據實驗需要精確計算LPS 的劑量,但該模型仍存在實驗操作復雜、創傷大、術口易污染等缺點,且麻醉過程中由于孕鼠呼吸循環的波動可能對胎鼠臟器損傷有一定的影響,因此,不適用于模擬臨床上宮內感染對胎兒臟器損傷的研究。 Rinaldi 等[19]針對上述缺點進行了改進,對孕鼠麻醉后采用超聲引導下經腹部注射LPS 于兩胎囊之間,成功模擬了宮內感染局部炎癥反應及免疫反應過程,該造模方法具有創傷小、手術操作相對簡單等優點,且早產率及子宮胎盤炎癥反應與上述侵入性剖腹胎囊注藥造模方法相似,缺點是要求具有對孕鼠超聲的設備及技術,因此無法廣泛應用。 盧刻羽等[20]通過對孕18 d的大鼠腹腔注射不同劑量的LPS 研究宮內感染致新生鼠肺損傷模型的構建方法,該研究發現,腹腔注射0.7 mg/kg LPS 構建宮內感染模型較成功,孕鼠死亡率和流產率較低,孕鼠胎盤和新生鼠肺組織損傷改變較明顯,該造模方法具有操作簡單、創傷小、成功率高等優點,因此被廣泛應用。 Dell’Ovo等[21]在大鼠孕20 d 時腹腔注射不同劑量的LPS 建立宮內感染模型進行研究發現,腹腔注射640 μg/kg 的LPS 時能最大程度誘導胎兒腦損傷而不引起孕鼠死亡。 Fricke 等[22]在 C57BL 小鼠孕 15.5 d 時進行腹腔注射100 μg/kg 成功建立了宮內感染致胎兒腸損傷模型。 可見,不同的LPS 劑量均能引起與臨床相類似的宮內感染表現,且其對胎兒的影響在不同的器官間是不同的。

2.2 解脲支原體宮內感染動物模型

解脲支原體是介于細菌與病毒之間無細胞壁、具有自我復制能力的最小病原體,寄生于人體泌尿生殖道[23],是引起宮內感染和早產的主要致病菌[1]。 因此,解脲支原體也是常用于建立宮內感染動物模型的常見病原體。 Normann 等[24]在小鼠孕13.5 d 時麻醉后切開下腹部暴露子宮,將解脲支原體血清3 型懸浮液羊膜腔內注射5000 菌落形成單位(colony-forming units,CFU)每個胎囊,在孕17.5 d時剖腹產分娩,此方法成功建立了解脲支原體感染宮內感染模型。 建模后發現,模型組新生小鼠大腦皮層神經元鈣結合蛋白陽性細胞數和鈣網膜蛋白陽性細胞數顯著低于對照組,其建模后新生小鼠腦損傷的病理變化及大腦發育異常的臨床表現較典型,更接近宮內感染致早產兒腦損傷的發病表現。但該造模方法操作復雜,對孕鼠創傷大,整個實驗過程死亡率較高,不適于推廣。 Van 等[25]在母羊孕127 d 時采用超聲引導下羊膜腔內注射解脲支原體107CCUs 成功建立了解脲支原體宮內感染致胎兒腸損傷模型,該方法造模胎兒暴露于解脲支原體6 d,與對照組相比,造模組新生小羊腸粘膜組織損傷改變較明顯。 Collins 等[26]分別在母羊孕 110、117、121 d 時采用超聲引導下羊膜腔內注射解脲支原體2×107CFU 誘導宮內感染模型,三組在母羊孕124 d時剖腹產分娩,該方法造模能引起肺組織炎癥反應及結構改變,且產前暴露于解脲支原體的時間越長肺組織損傷改變越明顯。 該造模方法操作簡單可行,成功率高,且羊的妊娠周期長,多為單胎妊娠,更能形象地模擬人類懷孕晚期宮內感染炎癥反應過程。 缺點是羊的價格昂貴,繁殖周期長,且需要有相應超聲設備及實驗技術。

2.3 念珠菌宮內感染動物模型

念珠菌也是孕婦生殖道感染的常見病原菌。研究報道[27],高達40%的妊娠婦女陰道中存在念珠菌感染,檢出率是非妊娠婦女的兩倍。 盡管在臨床上,母親念珠菌宮內感染通過垂直傳播引起新生兒先天性念珠菌感染的病例報道較少。 但隨著科學技術的發展,已有研究發現[28-30],在自發早產的妊娠婦女羊水中檢測出念珠菌感染。 念珠菌宮內感染可引起胎兒死亡、胎兒念珠菌感染及神經系統發育障礙[31-32]。 研究發現[33-34],對妊娠期無癥狀念珠菌感染的婦女予根除念珠菌治療可降低發生流產和早產的風險。 但關于妊娠期念珠菌宮內感染引起胎兒損傷的機制目前尚未明確,目前關于念珠菌宮內感染的動物模型研究報道也較少。 Payne等[35]選擇綿羊為研究對象,通過超聲引導下羊膜腔內注射白色念珠菌107CFU 建立宮內感染模型,注射白色念珠菌后1～2 d 剖宮產分娩的胎羊皮膚、肺組織及羊水中均有明顯的炎癥改變。 Nikiforou等[36]用同樣的方法造模后發現,注射后3～5 d 剖宮產分娩的胎羊腸組織及外周血中均檢測到白色念珠菌的侵入性生長,引起胎羊腸損傷及真菌血癥。可見,該造模方法穩定可靠,且綿羊多為單胎妊娠、體積大、孕期長,妊娠過程與人類較相似,可用于念珠菌宮內感染與母嬰不良結局的相關研究。

2.4 巨細胞病毒宮內感染動物模型

巨細胞病毒也是引起宮內感染最常見的病原體之一,可引起胎兒發育畸形,對社會造成巨大的危害。 據報道[37],巨細胞病毒宮內感染是發達國家新生兒感覺神經性聽力損失和神經發育異常的主要原因。 因此,建立穩定、可靠的巨細胞病毒宮內感染模型具有重要的意義。 Juanjuan 等[38]通過對孕12.5 d 的小鼠胎盤接種1×106PFU/mL 的小鼠巨細胞病毒成功建立了巨細胞病毒宮內感染致聽力損傷模型。 劉海智等[39]通過對孕齡10 ～11 d 的BALB/C 小鼠經胎盤分別接種感染性滴度不同的的巨細胞病毒成功建立了宮內感染模型。 建模后孕鼠出現不同程度的病毒血癥現象,與模型對照組相比,不同病毒滴度組孕鼠流產或死胎的發生率顯著升高,仔鼠小頭畸形及低出生體重的發生率顯著升高,其臨床表現更接近人類巨細胞病毒宮內感染的發病表現。 此外,經胎盤接種巨細胞病毒,使孕鼠及胎盤成功感染病毒,并經胎盤傳播給胎仔的垂直傳播模式與人類巨細胞病毒宮內感染的疾病傳播模式及發病機制較相似。 但陳莉等[40]研究發現,胎盤接種巨細胞病毒的方法建立巨細胞病毒宮內感染模型成功率較低。 可能由于該方法屬于有創操作,手術難度大,操作過程對實驗技術人員要求較高,因此,較難開展實施。

2.5 其他病原體宮內感染動物模型

乙型肝炎病毒、梅毒螺旋體、人類獲得性免疫缺陷病(HIV)等病原體引起的宮內感染均可通過母體血液垂直感染胎兒,引起嚴重不良后果,但目前尚未見有相對應的宮內感染動物模型的研究報道。因此,仍需大量的動物實驗和臨床研究來探索與人類妊娠過程接近,能夠形象逼真地模擬臨床上真實宮內感染機制的動物模型,推動基礎實驗研究和臨床試驗的進展。

綜上所述,引起宮內感染的病原體多種多樣,發病機制復雜,且應用不同的動物針對不同的研究目標使用的造模方法各不同。 因此,在以后的研究中應根據不同的研究目的結合不同造模方法的優缺點選擇合適的造模方法,使所建立的動物模型盡可能模擬疾病的發生發展及演變過程,為進一步研究宮內感染的發病機制、藥物作用機制及預防保健等方面提供基礎研究平臺,以降低母嬰不良結局、改善預后、減輕社會負擔。