人源性肝癌組織移植模型研究進(jìn)展

劉世芳，李宜航，陳德力，蘇 晶，呂亞娜，丁 璇，李 光，孫曉波

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所云南分所藥理中心，云南 景洪 666100；2. 西雙版納州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 景洪 666100；3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所植物化學(xué)中心，海南 海口 570311；4. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100093)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是危害極大的惡性腫瘤，研究者為能深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制及篩選藥物活性，建立多種肝癌動(dòng)物模型。常見的肝癌動(dòng)物模型包括化學(xué)試劑誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型、肝癌細(xì)胞或肝癌組織移植模型以及遺傳修飾肝細(xì)胞癌模型等[1]，但目前這些造模方法均存在一定的局限性。化學(xué)試劑誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型是通過致癌物誘導(dǎo)形成，但在致癌物、試驗(yàn)動(dòng)物等方面的選擇有很大缺陷，且誘導(dǎo)時(shí)間長，動(dòng)物死亡率高，腫瘤發(fā)生時(shí)間、位置、病灶數(shù)等差異較大；遺傳修飾肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型，通常會(huì)出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定，其形成的肝癌始終是鼠源性，與人自身肝癌的形成終有一定差異，對(duì)研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、藥物的篩選以及新的治療方法研發(fā)等有很大的制約性。

PDX模型在腫瘤藥物篩選以及實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療方面更具有優(yōu)勢(shì)[2]，肝癌PDX模型也在不斷的開發(fā)利用。肝癌PDX模型是將肝癌患者的肝癌組織移植到免疫缺陷小鼠皮下或者經(jīng)皮下傳代后移植到肝內(nèi)而構(gòu)建的肝癌動(dòng)物模型[3]。該模型能很好保持原代腫瘤的組織病理學(xué)、生長及轉(zhuǎn)移特性，并在多次傳代后仍然能夠較大程度保留原代腫瘤的特性，與原始患者腫瘤密切相關(guān)，具有重要的科研價(jià)值。

1 肝癌PDX模型建立及組織凍存與復(fù)蘇

肝癌PDX模型建立方法主要有兩種方法：①皮下移植：獲取新鮮的肝癌組織切成小塊組織或研磨為勻漿，與基質(zhì)膠充分混合，再將選好的組織用套管針將腫瘤塊穿刺至免疫缺陷品系小鼠皮下，或者吸取勻漿組織注射到皮下，并用滅菌棉簽按壓進(jìn)針部位，避免出血及組織溢出。②皮下-肝內(nèi)移植：在皮下移植的基礎(chǔ)上進(jìn)行一定次數(shù)的傳代，按照皮下移植的方法將癌組織處理，對(duì)免疫缺陷鼠進(jìn)行麻醉，打開小鼠腹腔，暴露出肝臟。在肝臟外葉刺出小的隧道，把制備好的瘤塊置入隧道或者吸取勻漿組織注入肝臟，或用可吸收縫合線將癌組織直接與肝臟進(jìn)行縫合，輕壓止血。為保證后期實(shí)驗(yàn)，通常將獲得的癌組織進(jìn)行凍存，在后期需要實(shí)驗(yàn)時(shí)再復(fù)蘇，且全程在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行，以保證組織的無菌性。

組織凍存方法：用無菌眼科剪將壞死的腫瘤組織、脂肪組織、纖維組織剔除，盡可能保存具有活性的組織。將組織剪成50～100 mm3小塊，用含有青霉素、鏈霉素的緩沖液反復(fù)沖洗3次，把組織塊上血跡清洗干凈。肝癌組織瘤塊放入含有10% DMSO和90% FBS的凍存管中，將凍存管放入凍存盒在4 ℃放置1 h，轉(zhuǎn)入-20 ℃ 2 h，再轉(zhuǎn)入-80 ℃過夜，最后置液氮中長期保存。

組織復(fù)蘇方法：遵從慢凍速溶的原則，將液氮中的凍存管取出，迅速置于37 ℃的水浴鍋中進(jìn)行快速溶解，并搖動(dòng)凍存管加速凍存液溶解，解凍后將癌組織塊取出，在超凈生物臺(tái)上用含有青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基將組織塊沖洗后建模備用，癌組織凍存復(fù)蘇后，應(yīng)盡可能在30 min內(nèi)完成。

2 肝癌PDX模型應(yīng)用

抗腫瘤藥物開發(fā)失敗率高的最主要原因是缺乏合適的模型。目前相關(guān)藥物的活性篩選主要通過體外培養(yǎng)細(xì)胞系和體內(nèi)建立動(dòng)物模型開展抗腫瘤實(shí)驗(yàn)[4]。評(píng)價(jià)藥物的抗癌活性以及藥物作用機(jī)制時(shí)，則利用肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株篩選[5-6]，但還是以動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為主。鼠源性動(dòng)物模型中，由于產(chǎn)生了巨大的生物學(xué)特性改變，無法保持與原發(fā)腫瘤的一致性，使得對(duì)藥物活性的評(píng)價(jià)效果較差，新藥的作用機(jī)制也不能準(zhǔn)確反映實(shí)際患者體內(nèi)藥物的作用原理，因此在開展臨床治療方向的研究也存在一定障礙。Bissig-Choisat等[2]建立的肝癌PDX模型在連續(xù)傳7代后，組織學(xué)分析顯示仍然保留HB腫瘤組分并在連續(xù)移植模型中檢測(cè)到這種腫瘤的罕見間充質(zhì)成分。移植模型的癌組織由于仍然保留其正常的結(jié)構(gòu)和功能，能夠更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)情況，是最為接近臨床患者模型[7-8]。目前該模型已廣泛應(yīng)用于肝癌藥物篩選、個(gè)體化治療以及新治療方向研發(fā)等多方面的應(yīng)用。

2.1 藥物篩選PDX模型做為理想的臨床前模型廣泛運(yùn)用于腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，特別是對(duì)傳統(tǒng)、新型抗癌藥物敏感性、檢測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找腫瘤新型標(biāo)志物均有重要意義[9-10]。PDX模型對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)與臨床反應(yīng)基本平行，與體外實(shí)驗(yàn)相比具有更高的可靠性，已經(jīng)應(yīng)用于肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的新藥研發(fā)[11]。

陶其飛等在抗肝癌藥物的篩選中，通過對(duì)比不同敏感性的肝癌PDX模型的表達(dá)譜，篩選了Sorafenib耐藥性相關(guān)的標(biāo)志物并初步探討其耐藥機(jī)制[12]。Huynh等[13]通過建立肝癌PDX模型對(duì)Cisplatin、Oxaliplatian、Iressa、SarCNU、Doxorubicin、維生素D類似物EB1089進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)Cisplatin、Oxaliplatian、Iressa、維生素D類似物EB1089對(duì)小鼠腫瘤的生長速度沒有影響，SarCNU、Doxorubicin有明顯的抑制作用，并利用肝癌PDX模型對(duì)抗腫瘤藥物Bevacizumab、Rapamycin進(jìn)行療效觀察，發(fā)現(xiàn)Bevacizumab和Rapamycin聯(lián)合用藥比單一用藥效果更好，能有效抑制腫瘤的生長[14]。Wang等對(duì)Rapamycin、Sorafenib抗腫瘤藥物的療效進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)rapamycin與Sorafenib聯(lián)合用藥時(shí)比單一用藥效果更好[15]。由此可見，肝癌PDX模型作為新藥開發(fā)的臨床前模型，能夠有效評(píng)估抗腫瘤藥物的藥效并闡明其作用機(jī)制，在新藥研發(fā)過程中將發(fā)揮重要作用。

2.2 個(gè)體化治療目前研究的抗肝癌藥物主要包括酪氨酸激酶抑制劑Sorafenib、Regorafenib、Brivanib；小分子靶向抑制劑Tivantinib、Capmatinib；化療藥物Doxorubicin、Oxaliplatian等，然而進(jìn)入肝癌臨床試驗(yàn)的靶向藥物中，很多藥物被證實(shí)在總體人群中無效。即使在臨床前實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)Sorafenib具有很好的抗肝癌活性，但在臨床應(yīng)用中同樣有約50%的患者無效，患者用藥前無法判斷其療效[16]。其原因可能是同種的肝癌患者之間存在著個(gè)體差異，常規(guī)治療方案往往無法獲得療效。因此針對(duì)不同患者優(yōu)化個(gè)體化治療方案是提高藥物療效的有效途徑。肝癌PDX模型的建立將在其中發(fā)揮著重要作用。

陶其飛[12]利用肝癌PDX模型進(jìn)行詳細(xì)的基因組、表達(dá)譜特征描述，通過在患者肝癌組織中發(fā)現(xiàn)的常見變異基因找到對(duì)應(yīng)的模型，為精準(zhǔn)治療方案提供了研究平臺(tái)。黃昊等[17]利用肝癌患者術(shù)后腫瘤組織建立肝癌PDX模型并評(píng)價(jià)Sorafenib藥效，同時(shí)對(duì)接受Sorafenib單藥治療患者進(jìn)行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個(gè)月肝癌出現(xiàn)復(fù)發(fā)，且伴腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與建成的肝癌PDX模型的藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果相似，以此推斷該患者先天對(duì)索拉非尼具有耐藥性。可見肝癌PDX模型能更好地反映藥物在個(gè)體化患者中的作用，該模型的建立對(duì)于抗肝癌活性的臨床前評(píng)估、治療方案的確定和預(yù)后具有重要的轉(zhuǎn)化意義，有望為腫瘤患者個(gè)體化治療帶來新突破。

2.3 其它方面的應(yīng)用肝癌PDX模型還用于研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及治療方法等方面。有研究者證明OPN和EMT標(biāo)記表達(dá)相互關(guān)聯(lián)，具有侵襲性生長和轉(zhuǎn)移的特性。RNA適配體與細(xì)胞的OPN結(jié)合，自分泌和旁分泌適配體能消除OPN與細(xì)胞表面結(jié)合。在移植模型中，RNA適配體能顯著抑制腫瘤生長。分析在體外和離體環(huán)境中腫瘤細(xì)胞的表達(dá)顯示出EMT的顯著降低該適體的標(biāo)記表達(dá)，OPN與細(xì)胞表面整合素受體的結(jié)合是EMT標(biāo)記表達(dá)所需，OPN可靶向明顯降低肝癌的EMT和腫瘤生長[18]。

目前，肝癌的治療方法主要為肝切除、移植、化療等，雖然治療方法取得很大進(jìn)步，但是幾十年來，患者5年生存率一直保持在10%左右，因此亟需研發(fā)更加有效的治療方法。Jiang等[19]利用肝癌PDX模型發(fā)現(xiàn)GPC3-CAR T細(xì)胞能夠有效消除PDX中的腫瘤，GPC3-CAR T細(xì)胞療法有望作為HCC的候選者治療。Wang等[20]基于肝癌PDX模型研究利用納米載體將siRNA傳遞到HCC，特異性的與腫瘤結(jié)合并顯著抑制Luc基因的表達(dá)，為HCC的治療提出新的方向。

3 肝癌PDX模型成瘤的關(guān)鍵因素與不足

3.1 肝癌PDX模型成瘤的關(guān)鍵因素研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的分化程度與移植成功率呈正相關(guān)的關(guān)系，分化程度低，侵襲度高及易轉(zhuǎn)移的肝癌組織更容易移植成功；反之，成瘤率則較低[21]。移植部位不同對(duì)成瘤率也有不同的影響，目前建模的移植部位主要為皮下移植和肝內(nèi)移植。皮下移植操作簡單，接種的部位在裸鼠的背部、腋下，選擇血管較豐富的部位，易于監(jiān)測(cè)腫瘤的生長，但皮下移植所生長的腫瘤不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。而由于原位移植癌組織的生長的微環(huán)境更接近于人體內(nèi)的生長環(huán)境，保持原代腫瘤中的動(dòng)態(tài)生長狀況[22]，因此肝內(nèi)移植是肝癌腫瘤移植模型研究的新方向。

除此之外，裸鼠的品種、年齡、飼養(yǎng)環(huán)境等因素都可能對(duì)成瘤率造成影響，目前建模選用的鼠種主要有NCG、SCID、NOD/SCID、BALB/c等免疫缺陷鼠。不同品系的裸鼠免疫力有差異，因此肝癌移植成功率也會(huì)有所不同。同時(shí)由于免疫缺陷鼠的飼養(yǎng)需要嚴(yán)格環(huán)境，宜飼養(yǎng)于SPF級(jí)的IVC籠具中，溫度、濕度等多種因素都可能對(duì)其生長造成影響。另一方面隨著年齡的增長，裸鼠自身會(huì)患有多種疾病導(dǎo)致裸鼠死亡，如BALB/c裸鼠老年心臟有某些病變，常因動(dòng)脈硬化對(duì)成瘤率造成影響，部分SCID小鼠隨年齡增長淋巴細(xì)胞功能恢復(fù)，對(duì)異物有排斥反應(yīng)，同樣影響成瘤率。

3.2 肝癌PDX模型不足PDX模型發(fā)展已有30多年的歷史，由于移植肝癌組織保留了原代腫瘤的主要組織特征、突變位點(diǎn)、基因表達(dá)等特性，是目前較理想的肝癌模型，在新型藥物的篩選、治療方法的研究上已取得了一定的成效[23]。然而該模型也有一定的缺陷，因皮下移植瘤細(xì)胞生長微環(huán)境與原發(fā)腫瘤生長微環(huán)境有差異，影響肝癌細(xì)胞的表達(dá)，肝內(nèi)移植生長環(huán)境雖然與原發(fā)性腫瘤生長環(huán)境相似，但肝內(nèi)移植難以監(jiān)測(cè)腫瘤生長的大小，且要求技術(shù)較高，易造成小鼠的死亡。其次，由于目前該造模方法花費(fèi)時(shí)間長且成瘤率較低，臨床上很難有足夠的時(shí)間開展相關(guān)研究，這對(duì)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療將會(huì)是重大的挑戰(zhàn)[24]。如何改善皮下移植腫瘤的微環(huán)境相似性和提高肝內(nèi)移植成功率將是建立肝癌PDX模型的一個(gè)重要的研究方向。

另一方面，肝癌PDX模型的應(yīng)用還存在物種差異問題，人和鼠兩者間物種差異尚無法消除，因此仍有學(xué)者對(duì)肝癌組織移植的保真度仍然持懷疑態(tài)度。并且人肝癌組織在離體取材及剪切的處理、移植后適應(yīng)宿主新環(huán)境等各方面是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤的某些亞群選擇性生長，是否能夠完全保持人肝癌的生物學(xué)特性還有待驗(yàn)證。為了改善這一現(xiàn)狀，近年來[25]，具有人類免疫系統(tǒng)的人源化PDX小鼠模型正在開發(fā)和應(yīng)用。

4 展望

隨著對(duì)肝癌模型研究的深入，研究者們更能清楚的認(rèn)識(shí)到優(yōu)異的肝癌模型對(duì)肝癌研究的價(jià)值。傳統(tǒng)的肝癌動(dòng)物模型已不能滿足現(xiàn)有肝癌研究的需求，需要開發(fā)更切合人自身生物學(xué)特性的肝癌模型。肝癌PDX模型最大程度的保留了人類肝癌的生物學(xué)特性、組織病理學(xué)特征，決定了該模型在肝癌研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，是目前最為理想的肝癌動(dòng)物模型。Bissig-Choisat等[2]建立肝癌PDX模型，用mek1抑制劑trametinib和泛類I-pi3激酶抑制劑nvp-bkm120靶向治療侵襲性肝細(xì)胞惡性腫瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可顯著抑制其生長，從而證實(shí)肝癌PDX模型是研究腫瘤生物學(xué)和患者腫瘤特異性的一個(gè)有價(jià)值的工具。肝癌PDX模型已應(yīng)用藥物篩選、藥物療效評(píng)價(jià)、肝癌的發(fā)生發(fā)展等多方面的研究，其它方面潛在的應(yīng)用價(jià)值也在逐步的挖掘。

由于肝癌PDX模型能更直接、客觀地將腫瘤自身生長環(huán)境以及疾病發(fā)展情況展現(xiàn)出來，因此對(duì)臨床上研究具有高度的相關(guān)性。與其它肝癌動(dòng)物模型相比，肝癌PDX模型取材于不同的患者，保留了患者腫瘤的異質(zhì)性符合腫瘤生物學(xué)治療基本原則，為個(gè)體化抗癌治療方案的制定，實(shí)現(xiàn)肝癌患者的精準(zhǔn)用藥提供了可能，同時(shí)為抗腫瘤藥物研發(fā)、藥效評(píng)價(jià)、新的治療方法的研發(fā)也提供一個(gè)新的平臺(tái)。