肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型研究進(jìn)展

孫姝嬋，方蓮花,杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是指肺動(dòng)脈壓力異常升高的一種血流動(dòng)力學(xué)和病理生理狀態(tài)。按臨床、治療和病理生理學(xué)特點(diǎn)，肺動(dòng)脈高壓分為5類(lèi)：動(dòng)脈型PH、左心疾病導(dǎo)致的PH、肺病和/或缺氧導(dǎo)致的PH、肺動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的PH、未知因素導(dǎo)致的PH[1]。盡管不同亞類(lèi)PH的病因不同，但都表現(xiàn)出相似的病理變化，包括肺血管內(nèi)側(cè)肥大、內(nèi)膜增生和纖維化、外膜增厚伴隨中度血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)、叢狀擴(kuò)張性病變以及原位血栓形成，肺血管不斷增生、重構(gòu)使血管部分閉塞，肺血管阻力增加，導(dǎo)致進(jìn)行性右心衰竭和功能衰退，甚至死亡[2]。

REVEAL注冊(cè)研究的數(shù)據(jù)顯示，肺動(dòng)脈高壓新診斷患者生存率為61.2%[3]，PH可以是特發(fā)性也可以繼發(fā)于各種病癥，有證據(jù)表明，PH使各種常見(jiàn)疾病復(fù)雜化[1]，因此迫切需要探究PH的發(fā)病機(jī)制和治療策略。動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的重要媒介，但目前PH動(dòng)物模型仍不能全面模擬人體的發(fā)病特點(diǎn)，發(fā)病機(jī)制尚未明確界定，各種造模方法仍需優(yōu)化和改進(jìn)。本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外PH動(dòng)物疾病模型制備方法進(jìn)行總結(jié)，介紹不同模型的原理及制備方法，分析其優(yōu)缺點(diǎn)以及對(duì)臨床PH的模擬性。

1 野百合堿誘導(dǎo)模型

野百合堿(monocrotaline，MCT)是從野百合種子中提取的一種吡咯烷生物堿，它能夠引起肝毒性和肺動(dòng)脈高壓。

MCT引起PH的機(jī)制在于其被肝臟的混合功能氧化酶轉(zhuǎn)化為野百合吡咯，野百合吡咯可以在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中形成DNA和蛋白加合物，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管內(nèi)膜剝脫，從而引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行性增殖和肺血管重塑[4]。MCT模型的特征在于內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和血管周?chē)装Y，這與人肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的生理病理機(jī)制類(lèi)似。MCT模型能夠更好地幫助我們了解肺血管重塑的過(guò)程以及炎癥反應(yīng)在其發(fā)病機(jī)制的重要作用。大鼠是目前MCT模型的首選物種。

MCT模型主要經(jīng)頸背部或腹部單次皮下注射1%MCT溶液，極少數(shù)采用腹腔注射。MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓程度取決于MCT的劑量[5]，廣泛采用的劑量主要有50 mg·kg-1和60 mg·kg-1，一般2 周后造模成功。通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)判斷模型是否成功，主要指標(biāo)有肺動(dòng)脈平均壓力(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)、右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。有研究表明這兩種劑量誘導(dǎo)的PH模型RVSP與死亡率相當(dāng)，但50 mg·kg-1對(duì)肺中、小動(dòng)脈中膜厚度改變更為明顯[6]。

MCT模型具有技術(shù)簡(jiǎn)單、可重復(fù)、時(shí)間短、穩(wěn)定性好、低成本等優(yōu)點(diǎn)。MCT能引起內(nèi)皮功能障礙，較好模擬臨床上炎性相關(guān)的PH，但對(duì)重度血管增生性PH的模擬有限。另外，MCT誘導(dǎo)的大鼠通常死于MCT誘導(dǎo)的肺毒性、靜脈阻塞性肝病和心肌炎，而不是死于肺動(dòng)脈高壓[7]。由于MCT模型形態(tài)學(xué)變化發(fā)展得非常快并且不易通過(guò)治療干預(yù)來(lái)預(yù)防，所以作為臨床PH模型還具有一定的局限性。

2 慢性低氧性模型

低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是臨床常見(jiàn)的一類(lèi)PH，常由慢性呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性阻塞性肺疾病、睡眠呼吸暫停、高原病等導(dǎo)致。慢性缺氧(chronic hypoxia，CHP)會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，以致相關(guān)舒縮因子失衡，增加肺血管收縮反應(yīng)并促進(jìn)血管重塑，最終發(fā)展為肺動(dòng)脈高壓[8]。近年來(lái)缺氧性肺血管收縮和肺動(dòng)脈重塑的研究主要側(cè)重于內(nèi)皮素-1、一氧化氮、環(huán)氧合酶和腺嘌呤核苷酸途徑。

CHP模型需將動(dòng)物置于低氧艙內(nèi)，通入N2和O2混合氣體，通過(guò)控制器將O2濃度控制在(10.0±0.5)%(體積分?jǐn)?shù))，缺氧時(shí)長(zhǎng)2～8周，喂養(yǎng)期間定期清掃并補(bǔ)充食物和水。大量研究證明，持續(xù)缺氧或間斷性缺氧(約8 h·d-1)均可發(fā)展為PH，并且低壓低氧艙或常壓低氧艙也均可成功制備模型。

慢性高碳酸血癥常見(jiàn)于缺氧性肺病患者，并且根據(jù)臨床觀察，除非同時(shí)存在高碳酸血癥，否則低氧性肺病很難發(fā)展為肺動(dòng)脈高壓，可見(jiàn)二氧化碳分壓與肺動(dòng)脈壓力密切相關(guān)。因此，吸入低氧伴高二氧化碳混合氣體制備PH動(dòng)物模型更符合臨床患者情況。將動(dòng)物置于常壓低氧高二氧化碳氧倉(cāng)中，倉(cāng)內(nèi)氧濃度維持在9%～11%，二氧化碳濃度維持在5%～6%，每天8 h，每周6 d，飼養(yǎng)4周[9]。

通過(guò)慢性缺氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓，易于操作，并且牛、鼠、羊、豬都可以建立CHP模型。但慢性缺氧反應(yīng)在物種間存在差異，即使是同一物種隨著年齡、性別的不同，反應(yīng)也會(huì)受到顯著影響，最常用的動(dòng)物是大鼠和小鼠[10]。由于缺氧誘導(dǎo)是可逆的，因此較難模擬臨床重癥PH，并且不能完全模擬PH的血管損傷情況。此外該方法對(duì)設(shè)備要求很高，很難同時(shí)進(jìn)行大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，盡管如此，這兩種模型都為體內(nèi)研究PH發(fā)病機(jī)制提供重要的疾病模型。

3 栓塞性模型

肺栓塞(pulmonary embolism，PE)是由內(nèi)源或外源性栓子阻塞肺動(dòng)脈，引起肺循環(huán)和右心功能障礙的臨床綜合征[11]。慢性血栓栓塞型肺動(dòng)脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH)是PH的一種獨(dú)特形式，是急性肺栓塞或肺動(dòng)脈原位血栓形成的長(zhǎng)期后果，表現(xiàn)為肺動(dòng)脈增大、內(nèi)膜受損及周?chē)茏枞鸞12]。

從廣義上講，此模型分為2類(lèi)：注射血栓或者異物。

血栓模型是從自體或供體(異源)動(dòng)物獲得血液樣本在體外凝結(jié)成血栓，然后再將其注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中。注射血栓可較好表現(xiàn)急性肺栓塞的病理生理情況，但是由于離體血凝塊的大小和體積均不規(guī)則，難以保證肺血管阻塞的程度和持續(xù)性，而且自體PE模型還需要進(jìn)行2次手術(shù)，在大鼠、兔或豬中會(huì)產(chǎn)生循環(huán)休克，操作復(fù)雜。

與此相比，很多實(shí)驗(yàn)室已采用將惰性材料注入頸靜脈的方法來(lái)模擬肺栓塞，包括大鼠、兔、狗、羊、貓、豬都可以建立CTEPH模型。其中大鼠模型較為常見(jiàn)，體質(zhì)量(350～500) g，通過(guò)右頸靜脈注射聚苯乙烯微球(15～25 μm，130萬(wàn)～195 萬(wàn)個(gè)珠/100 g)。該方法可以控制進(jìn)入肺部的微球數(shù)量，較準(zhǔn)確地增加肺血管阻力，還避免發(fā)生免疫反應(yīng)、大鼠纖維蛋白溶解率高等問(wèn)題[13]。但也有一定的局限性，微球是阻塞在肺部毛細(xì)血管前小動(dòng)脈中，而不是臨床上通常觀察到的阻塞在近端肺動(dòng)脈。

栓塞性PH模型引起的血流動(dòng)力學(xué)變化與臨床一致[13]，產(chǎn)生的促凝狀態(tài)、血栓前變化可作為臨床避免血栓栓塞及外科手術(shù)等干預(yù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)對(duì)象[14]。

4 手術(shù)分流模型

肺動(dòng)脈高壓是先天性心臟病的常見(jiàn)并發(fā)癥，高肺血流量引起的肺血管重構(gòu)是其重要的病理過(guò)程。手術(shù)分流可以增加肺部血流量，其中體循環(huán)動(dòng)脈-肺動(dòng)脈之間的分流和動(dòng)-靜脈之間的分流是較常用的左向右分流型肺動(dòng)脈高壓建模方法。

4.1 體循環(huán)動(dòng)脈-肺動(dòng)脈之間的分流由于大、中動(dòng)脈壓力高于肺動(dòng)脈壓力，通過(guò)壓力階差在兩者間建立分流可使體循環(huán)血液分流至肺循環(huán)，使肺循環(huán)血液增多。該方法多采用犬、豬、羊等大型動(dòng)物。包括誘導(dǎo)主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈、左頸總動(dòng)脈和肺動(dòng)脈、左鎖骨下動(dòng)脈和肺動(dòng)脈分流等。盡管能更好的模擬臨床上慢性心臟病相關(guān)的PH，但由于開(kāi)胸手術(shù)難度較大、創(chuàng)傷大、飼養(yǎng)大體積動(dòng)物困難及成本等問(wèn)題，因此較難推廣和應(yīng)用。

4.2 動(dòng)-靜脈(A-V)之間的分流利用動(dòng)靜脈間較大的壓力差，分流后動(dòng)脈血流入靜脈，使流回右心的血液增加，繼而使右心射入肺動(dòng)脈的血液增多。該方法多采用兔、鼠等小型動(dòng)物。大鼠多采用主動(dòng)脈-腔靜脈分流；兔多采用頸總動(dòng)脈-頸靜脈分流；有研究首創(chuàng)通過(guò)腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流建立小鼠的PH模型[15]，小鼠模型為研究PH的分子機(jī)制提供了更多機(jī)會(huì)。與大中動(dòng)脈-肺動(dòng)脈間的分流相比，A-V分流具有死亡率低、侵入性低、通暢性較高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

常見(jiàn)的PH動(dòng)物模型主要是慢性低氧模型和野百合堿誘導(dǎo)模型，盡管這些模型增加了對(duì)PH肺血管重塑機(jī)制的理解，但與臨床的發(fā)病機(jī)制和疾病表型不同。隨著PH機(jī)制研究從單純的血管收縮轉(zhuǎn)變?yōu)檠茉錾悍至鞯淖饔帽徽J(rèn)為在PH的發(fā)展中至關(guān)重要。

5 遺傳修飾模型

由遺傳因素導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓稱為遺傳性肺動(dòng)脈高壓(heritable pulmonary arterial hypertension，HPAH)，主要有家族性肺動(dòng)脈高壓(familial pulmonary artery hypertension，F(xiàn)PAH)和伴基因突變的特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(idiopathic pulmonary artery hypertension，IPAH)[16]。在過(guò)去的世界肺動(dòng)脈高壓專題討論會(huì)(world symposium on pulmonary hypertension，WSPH)中，科學(xué)界不斷揭示PH相關(guān)基因：BMPR2、ALK1、ENG、SMAD9、SMAD1、CAV1、KCNK3、TBX4、E2F2AK4、GDF2、ATP13A3、AQP1、SOX17[17-18]等，增強(qiáng)了對(duì)PH復(fù)雜遺傳基礎(chǔ)的理解。

5.1 基因敲除模型據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，約有70%～80%的FPAH和10%～20%的IPAH病例是由BMPR2突變引起的[19]。有研究證明BMPR2突變類(lèi)型與PH敏感性之間存在基因型-表型關(guān)系[20]。去除外顯子4、5的BMPR2基因敲除小鼠(BMPR2△Ex4-5/+)會(huì)表現(xiàn)出輕度PH，損害肺血管系統(tǒng)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間低氧的重塑能力[21]。還有去除第2個(gè)外顯子的BMPR2基因敲除小鼠(BMPR2△Ex2/+)，這種小鼠對(duì)低氧反應(yīng)性增加[20]。除此之外，有研究采用平滑肌特異性強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)BMPR2第899位氨基酸的突變(SM22-rtTA x TetO7-BMPR2R899X)，產(chǎn)生了非常接近人類(lèi)的PH[22]。

除了BMPR2基因敲除模型，還有其他基因敲除模型，如敲除血管活性腸肽的小鼠(VIP-/-)自發(fā)形成中度至重度PH；敲除載脂蛋白E的小鼠(ApoE-/-)可自發(fā)為PH并伴有肺動(dòng)脈肌肉化；內(nèi)皮素受體B(ETB)敲除模型，當(dāng)內(nèi)皮素受體表達(dá)降低會(huì)增加肺內(nèi)皮素水平，從而促進(jìn)PH。

5.2 基因過(guò)表達(dá)模型5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(5-hydroxytryptamine transporter，5-HTT)的過(guò)度表達(dá)是PH形成過(guò)程中的關(guān)鍵因素。首個(gè)5-HTT過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型是通過(guò)一個(gè)人工染色體對(duì)5-HTT的C端血凝素抗原決定簇和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的一個(gè)lacZ報(bào)告基因進(jìn)行修飾[23]。之后有研究采用平滑肌啟動(dòng)子SM22建立5-HTT基因過(guò)表達(dá)模型(SM22-5-HTT+)，這種小鼠肺部鉀離子通道表達(dá)水平降低，并且5-HTT表達(dá)增加的水平非常接近于人PH[24]。

常用的還有過(guò)表達(dá)白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)的轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)研究IL-6在PH發(fā)展中的作用以及抗炎方面發(fā)揮重要作用。有研究采用過(guò)表達(dá)血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)建立大鼠轉(zhuǎn)基因模型，Ang-1的表達(dá)水平與PH的嚴(yán)重程度成正比[25]。研究表明大約5%的S100A4/Mts-1過(guò)表達(dá)的小鼠發(fā)生肺血管重塑，可觀察到其他模型沒(méi)有的叢狀病變[26]。

利用基因工程技術(shù)制備PH模型，能從動(dòng)物整體水平研究目的基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，加深了我們對(duì)PH病理生物學(xué)及治療學(xué)的認(rèn)識(shí)，但是該方法存在技術(shù)難度大、動(dòng)物模型品系過(guò)少(主要是小鼠)等缺點(diǎn)，仍需進(jìn)行多方位的改進(jìn)。

6 混合因素誘導(dǎo)模型

單一因素誘導(dǎo)模型會(huì)顯示人類(lèi)PH早期階段的特征，但與單一因素相比，混合因素誘導(dǎo)的疾病模型與人類(lèi)重度PH的關(guān)聯(lián)性更好。其中SuH模型最具有代表性，即采用C57BL/6小鼠通過(guò)單次皮下注射VEGFR2抑制劑SU5416(20 mg·kg-1)并將其置于常壓低氧室(10%FiO2)，缺氧3周，若進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，可每周注射一次SU5416[27]。與單純低氧誘導(dǎo)相比，該模型出現(xiàn)新內(nèi)膜增厚和叢狀病變，并且對(duì)其他器官血管沒(méi)有影響，避免其他因素干擾。

除了利用低氧聯(lián)合SU5416造模，也有研究采用低氧聯(lián)合MCT模擬重癥PH，還可觀察到血栓性病變[28]。除此之外，切除左肺，使血液僅在右肺循環(huán)，手術(shù)后1周內(nèi)注射MCT或SU5416[29]，肺血流量增加和內(nèi)皮功能障礙聯(lián)合誘導(dǎo)新生內(nèi)膜形成的重度PH，其局限性是需要一定的手術(shù)技能。

多因素干預(yù)提高了模型的成功率，但也增加了動(dòng)物的死亡率。由于臨床診斷通常是重癥，混合因素誘導(dǎo)模型更有助于發(fā)現(xiàn)肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)改變的相關(guān)治療靶點(diǎn)。

7 結(jié)論和展望

PH的異質(zhì)性和治療難度對(duì)動(dòng)物模型的使用和改進(jìn)提出了更高的要求。PH動(dòng)物模型的發(fā)展主要經(jīng)歷了2個(gè)階段[30]，第1階段是肺動(dòng)脈非特異性內(nèi)膜和外膜增厚，主要包括經(jīng)典模型(即低氧和MCT)；第2階段是發(fā)生叢狀病變，血管逐漸閉塞，肺動(dòng)脈壓進(jìn)行性升高，即手術(shù)分流、栓塞模型、遺傳修飾以及混合因素誘導(dǎo)造模。本文概述了PH研究中的不同動(dòng)物模型，同時(shí)重點(diǎn)關(guān)注它們與PH患者的相關(guān)性，有利于科研工作者根據(jù)疾病的不同階段選擇合適的動(dòng)物模型，取得理想的造模效果。同時(shí)，也為進(jìn)一步闡明PH的病理機(jī)制、提高PH患者的預(yù)后、探索新的治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。