肝細(xì)胞癌中外泌體ncRNAs的研究進(jìn)展

招文婷，文 彬，孫嘉玲，楊雪梅，陳煒聰，孫海濤，賀松其

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.中國人民解放軍四五八醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510602)

全世界大約75%～85%的肝癌是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，HCC是全球第六大最常見的癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因。HCC在我國惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率分別為第4位和第3位，其預(yù)后差且復(fù)發(fā)風(fēng)險高[1]。目前，HCC的診斷手段較局限，易遺漏早期小腫瘤；而HCC的傳統(tǒng)治療方法，療效欠佳。因此，HCC患者需要有效的診治及監(jiān)測腫瘤進(jìn)展的方法。近年來，研究發(fā)現(xiàn)外泌體在各種癌癥，尤其是HCC中，發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。腫瘤微環(huán)境是HCC的重要組成部分，外泌體作為一種膜結(jié)合載體，可被受體細(xì)胞吸收，在HCC腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮細(xì)胞通訊作用，從而調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展。

1 外泌體ncRNAs的生物學(xué)特性

外泌體是由活細(xì)胞釋放的直徑為30～100 nm的膜狀細(xì)胞外囊泡，存在于血液、尿液和唾液等各種體液中，其內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物活性分子[2]。外泌體可通過細(xì)胞間直接接觸、質(zhì)膜融合或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等方式，發(fā)揮細(xì)胞通訊作用，將核酸等生物活性成分傳遞到受體細(xì)胞中，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的行為，發(fā)揮生物學(xué)功能。外泌體中的非編碼RNA(no coding RNA,ncRNA)是一類沒有蛋白編碼能力的RNA，如微小RNA(micro RNA，miRNA)，長鏈非編碼RNA(long no coding RNA，lncRNA)，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)。ncRNAs通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，轉(zhuǎn)錄后表觀遺傳水平和調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程。其中，miRNA是由20～24個核苷酸RNA組成的小RNA，成熟的miRNA通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致mRNA降解或靶mRNA的翻譯抑制[3]。lncRNA是一類分子大于200 bp的轉(zhuǎn)錄物，通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等一系列生物學(xué)過程。circRNA與線性RNA不同，是無5′帽和3′尾多腺苷酸化特殊的共價閉合連續(xù)環(huán)，這種結(jié)構(gòu)使得其較線性mRNA對RNA酶具有更高的耐受力，可充當(dāng)miRNA的海綿體起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子[4]。

2 外泌體ncRNAs調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)HCC進(jìn)展

腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞成分，以及細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子、炎性細(xì)胞因子、蛋白水解酶和其抑制劑等非細(xì)胞成分組成[5]。腫瘤細(xì)胞的惡性行為不僅取決于自身，還受到腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境相互作用的調(diào)節(jié)，外泌體可發(fā)揮其細(xì)胞間通訊作用，充當(dāng)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間相互作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAs作為外泌體內(nèi)重要的生物活性分子，可有效調(diào)控HCC腫瘤微環(huán)境，包括參與HCC腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)血管形成、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等過程，從而影響HCC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

2.1 外泌體ncRNAs促進(jìn)HCC生長既往對細(xì)胞間通訊的研究主要是聚焦在信號蛋白分子，但目前核酸分子作為細(xì)胞間的信使被越來越多的關(guān)注。然而RNA釋放在細(xì)胞外容易被RNA酶降解，因此，外泌體作為RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可有效防止RNA降解，更好發(fā)揮細(xì)胞間通訊作用。腫瘤細(xì)胞在進(jìn)化過程中通過外泌體將致癌的ncRNAs轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，穩(wěn)定傳遞生物信號，促進(jìn)腫瘤生長。來自人肝星狀細(xì)胞LX2的外泌體過表達(dá)的miR-335-5p可被受體HCC細(xì)胞吸收，在體外抑制HCC細(xì)胞增殖并抑制體內(nèi)腫瘤生長；但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LX2分別與4種HCC細(xì)胞系(MHCC97L，MHCC97H，Huh7和HepG2細(xì)胞)中的任何一種共培養(yǎng)時，觀察到這些成纖維細(xì)胞以及HCC細(xì)胞中miR-335-5p的下調(diào)，從而促進(jìn)HCC的增殖和生長[6]。此外，對來自HCC患者的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)和相應(yīng)的癌旁成纖維細(xì)胞的外泌體進(jìn)行miRNA測序，發(fā)現(xiàn)CAF衍生的外泌體中miR-320a水平顯著降低，體內(nèi)外研究表明，miR-320a可通過直接與下游靶標(biāo)PBX3結(jié)合，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2，從而抑制HCC細(xì)胞增殖生長[7]。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞分泌的circRNA可調(diào)節(jié)HCC中的去泛素化，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞生長。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體與泛素化相關(guān)的環(huán)狀RNA circ-DB在體脂高的HCC患者上調(diào)，circ-DB通過抑制miR-34a并激活與去泛素化相關(guān)的USP7 / Cyclin A2信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長，減少DNA損傷。這些研究結(jié)果表明，外泌體ncRNAs可通過細(xì)胞通訊作用促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長。

2.2 外泌體ncRNAs促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移HCC轉(zhuǎn)移是HCC發(fā)展進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)，外泌體ncRNAs可通過介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)降解和血管滲漏等生物過程促進(jìn)HCC侵襲轉(zhuǎn)移。外泌體ncRNAs可介導(dǎo)HCC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，即使腫瘤細(xì)胞失去上皮表型獲得間質(zhì)表型，導(dǎo)致細(xì)胞間粘附減少，運(yùn)動性增強(qiáng)，最終引起腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。lncRNA FAL1在HCC來源的外泌體中上調(diào)，而lncRNA FAL1可以充當(dāng)miR-1236的海綿體，增加EMT中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達(dá)，促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移[9]。Han等[10]發(fā)現(xiàn)外泌體的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Vps4A在HCC組織中經(jīng)常被下調(diào)，而Vps4A可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抑制腫瘤的miRNA的積累和攝取。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Vps4A通過與CHMP4B和β-連環(huán)蛋白的相互作用，促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的質(zhì)膜定位和外泌體釋放，降低β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，抑制HCC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-320a過表達(dá)可降低PBX3和磷酸化ERK1/2的水平，并同時增強(qiáng)E-鈣粘蛋白的表達(dá)和降低N-鈣粘蛋白的表達(dá)，而HCC患者中CAFs衍生的外泌體中miR-320a水平顯著降低，最終通過以上機(jī)制促進(jìn)HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。高轉(zhuǎn)移特性的肝癌細(xì)胞LM3細(xì)胞衍生的外泌體傳遞circPTGR1，通過circPTGR1-miR449a-MET途徑增強(qiáng)HepG2細(xì)胞(非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系)和97 L細(xì)胞(低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系)遷移和侵襲能力[11]。

外泌體可以通過介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終促進(jìn)HCC侵襲轉(zhuǎn)移。高度轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系的外泌體中內(nèi)含met、caveolin和S100等蛋白質(zhì)，通過共培養(yǎng)，正常肝細(xì)胞系MIHC攝入外泌體后，增強(qiáng)了MIHC的遷移和侵襲潛能，并且發(fā)現(xiàn)MIHC細(xì)胞內(nèi)Akt，磷酸化的MEK1/2和金屬蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的表達(dá)亦顯著增加[12]。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生需要腫瘤細(xì)胞穿越內(nèi)皮屏障，從血管滲漏，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)靶器官中生長。外泌體ncRNAs可通過靶向調(diào)節(jié)基因表達(dá)，破壞內(nèi)皮完整，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞穿越內(nèi)皮屏障。Fang等[13]用來自表達(dá)穩(wěn)定miR-103的HCC細(xì)胞的外泌體預(yù)處理內(nèi)皮單層細(xì)胞，最終促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的跨內(nèi)皮侵襲，并且通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-103消除了外泌體的這種作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-103通過靶向調(diào)節(jié)VE-鈣黏蛋白，p120-連環(huán)蛋白和閉鎖小帶1來破壞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的完整性，削弱血管屏障，促進(jìn)HCC細(xì)胞的跨內(nèi)皮侵襲，從而促進(jìn)HCC侵襲轉(zhuǎn)移。

2.3 外泌體ncRNAs促進(jìn)HCC血管生成血管生成可為腫瘤細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)和氧氣，是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。HCC或CAFs衍生的外泌體ncRNAs可釋放血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等可溶性因子促進(jìn)血管生成，為HCC提供充足的營養(yǎng)，促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。研究表明癌癥干細(xì)胞樣CD90+肝癌細(xì)胞衍生的外泌體表達(dá)高水平的lncRNA H19，可顯著增加VEGF的釋放和VEGF-R1的產(chǎn)生，促進(jìn)血管生成，lncRNA H19沉默后，VEGF蛋白的表達(dá)水平明顯降低[14]。腫瘤來源的外泌體miRNA-21可以通過下調(diào)磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologous，PTEN)，將肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs，并激活PDK1/AKT信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)CAFs釋放VEGF等血管生成細(xì)胞因子促進(jìn)血管生成[15]。低氧可以刺激HCC細(xì)胞分泌含有miR-155的外泌體，從而促進(jìn)血管生成，并且外泌體miR-155的水平與HCC樣本中VEGF和HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)[16]。因此，外泌體ncRNAs可通過激活相關(guān)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的生成來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的血管重構(gòu)，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。

2.4 外泌體ncRNAs調(diào)節(jié)HCC免疫反應(yīng)癌癥的發(fā)展與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，腫瘤可以逃避免疫破壞。腫瘤細(xì)胞可以通過外泌體將致癌的ncRNAs轉(zhuǎn)移至免疫細(xì)胞，以誘導(dǎo)抑制T效應(yīng)細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞的活性，最終導(dǎo)致局部或全身性免疫抑制。肝癌表現(xiàn)出的高度惡性、總體生存結(jié)果差與宿主免疫反應(yīng)的抑制密切相關(guān)，肝癌細(xì)胞釋放的外泌體可以抑制患者的免疫系統(tǒng)，并為轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散做好準(zhǔn)備。外泌體miR-23a-3p可以從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的HCC細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移，通過抑制PTEN激活PI3K-AKT途徑，增加PD-L1表達(dá)并抑制T細(xì)胞活化，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[17]。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體衍生的HMGB1激活B細(xì)胞，通過Toll樣受體2/4和絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)TIM-1+Breg細(xì)胞擴(kuò)增，表達(dá)高水平的免疫抑制細(xì)胞因子IL-10，并表現(xiàn)出對CD8+T細(xì)胞的強(qiáng)抑制活性，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌免疫逃逸。在另一項研究中，源自HCC的外泌體lncRNA TUC339可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子生成降低，吞噬作用受損以及M2極化，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展[19]。

3 外泌體ncRNAs可作為HCC診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物

早期診斷可以改善HCC患者的臨床結(jié)局，因為早期HCC可以進(jìn)行根治性切除或肝移植，且術(shù)后生存率較高。目前，HCC的診斷分為病理診斷和臨床診斷，臨床診斷除患者病史外，要結(jié)合腹部超聲、計算機(jī)成像、磁共振等影像學(xué)檢查以及甲胎蛋白檢測，但通過以上方法，易遺漏早期的小腫瘤。因此，需要更有效的生物標(biāo)志物來改進(jìn)小腫瘤的篩查。外泌體中的ncRNAs，因其被外泌體的雙層脂質(zhì)膜包裹，不受RNA酶的影響，在血清穩(wěn)定，且在血清、尿液、唾液等各種體液中廣泛存在，是液體活檢的理想標(biāo)本，因此，可成為HCC診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。Sohn等[20]研究表明，HCC患者的外泌體miR-18a、miR-222、miR-221和miR-224的血清水平顯著高于慢性乙型肝炎或肝硬化患者。此外，與外泌體miRNA不同，血清循環(huán)miRNA在慢性乙型肝炎組和HCC組之間沒有顯示出明顯的差異。表明外泌體miRNA比血清miRNA敏感性、特異性更高。在大鼠模型的HCC發(fā)育過程中，在不同階段檢測到四種失調(diào)最明顯的miRNA，其中，miR-10b、miR-21減少，miR-122和miR-200a增加。在HCC早期，血清和血清外泌體中的4個miRNA比血清AFP改變更顯著。接受者操作特征(ROC)分析的結(jié)果表明，AFP、miRNA-10b、miRNA-21、miRNA-122和miRNA-200a的組合產(chǎn)生的最高曲線下面積(AUC)為0.993，這可能成為早期診斷HCC的更好方式[21]。此外，血清外泌體lncRNA HEIH的表達(dá)水平在HCV相關(guān)的HCC患者以及HCV誘發(fā)的肝硬化或慢性肝炎患者存在差異[22]。

HCC的早期診斷利于患者及早手術(shù)治療，而HCC患者術(shù)后是否會復(fù)發(fā)、總生存期長短，對患者整體預(yù)后情況的評估尤為重要。外泌體ncRNAs與HCC的臨床分期、術(shù)后復(fù)發(fā)時間、總生存期等相關(guān)，可作為HCC預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。研究表明，HCC患者的血清外泌體miR-665水平明顯高于健康受試者，且與腫瘤大小、侵襲，臨床分期和存活時間密切相關(guān)。血清外泌體miR-665水平越高，臨床表現(xiàn)越差，表明血清外泌體miR-665可能是HCC診斷和預(yù)后的非侵襲性生物標(biāo)志物[23]。與慢性乙型肝炎和肝硬化組相比，HCC組血清外泌體miR-125b水平較低，且 miR-125b水平較低的患者復(fù)發(fā)時間和總生存期均較短，表明血清外泌體miR-125b可能是肝切除術(shù)后HCC患者復(fù)發(fā)和存活時間的高度準(zhǔn)確和有效的生物標(biāo)志物[24]。Lee等[25]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)外泌體lncRNA-ATB與TNM分期和其他預(yù)后因素相關(guān)，包括T分期和門靜脈血栓形成。Cox回歸測試的多變量分析發(fā)現(xiàn)，較高的lncRNA-ATB是HCC死亡率和疾病進(jìn)展的獨(dú)立預(yù)測因子，外泌體lncRNA-ATB高的患者的總存活和無進(jìn)展存活率顯著較低。結(jié)果表明循環(huán)外泌體lncRNA-ATB是HCC的新型預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[25]。HCC患者的血清外體lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635的水平高于慢性乙型肝炎患者(AUC分別為0.719和0.750)，且ENSG00000258332.1的高表達(dá)與TNM分期、門靜脈腫瘤栓塞、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存期有關(guān)[26]。采用兩組無病生存率的生存曲線分析circPTGR1的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)circPTGR1低表達(dá)的HCC患者的預(yù)后要好于circPTGR1高表達(dá)的HCC患者的預(yù)后[11]。隨著研究的深入，外泌體ncRNAs有望成為HCC診斷和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。

4 外泌體ncRNAs在肝癌中治療的作用

部分外泌體ncRNAs可抑制HCC的生長，如人成體肝干細(xì)胞衍生的外泌體可以通過轉(zhuǎn)移抗腫瘤的miRNA下調(diào)與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因來抑制肝癌的生長，如miR-223靶向的Cyclin D1，miR-31靶向的E2F-2。此外，人肝星狀細(xì)胞LX2分泌的外泌體中過表達(dá)miR-335-5p，可在體內(nèi)傳遞至受體HCC細(xì)胞，抑制體外HCC細(xì)胞增殖并抑制體內(nèi)腫瘤生長[6]。由此給我們啟示，可以體外構(gòu)建外泌體載體，將抑制腫瘤的ncRNAs裝載至外泌體轉(zhuǎn)移到HCC細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)其惡性表型，或增強(qiáng)HCC細(xì)胞對化療藥物的敏感性。目前該技術(shù)已經(jīng)比較成熟，將“貨物”載入外泌體的方法主要有“前轉(zhuǎn)載”、“后轉(zhuǎn)載”兩種方式，而“后轉(zhuǎn)載”中電穿孔法因參數(shù)容易控制，多種“貨物”載入外泌體使用該方法[27]。Liang等[28]采用電穿孔技術(shù)將功能性的miR-26a加載到HEK-293T細(xì)胞來源的外泌體，而負(fù)載miR-26a的外泌體經(jīng)清道夫受體選擇性結(jié)合HCC細(xì)胞，通過抑制CCND2、CCNE2、CDK6等蛋白抑制HCC的生長和侵襲。外泌體ncRNAs可有效抑制HCC的生長侵襲、增強(qiáng)癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，且具有低生物毒性、低免疫原性、低致病性、更好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，因此，外泌體ncRNAs用于治療HCC具有較良好的應(yīng)用前景。

5 小結(jié)

HCC在全世界發(fā)病率和病死率極高，HCC早期診斷患者可手術(shù)切除，臨床預(yù)后較好，而HCC晚期患者多采用化療或靶向治療，治療效果欠佳，患者總生存期低。因此，發(fā)現(xiàn)用于早期診斷HCC以及治療HCC的高靈敏度、高特異性生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體ncRNAs在HCC的發(fā)生發(fā)展、診療預(yù)后中起重要作用，且外泌體ncRNAs具有無創(chuàng)性、在體液中廣泛存在、穩(wěn)定性高、低生物毒性等明顯優(yōu)勢，故外泌體ncRNAs今后有望成為HCC診療預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。