BMP9與肝臟疾病的研究進展

馬 翠，王 華,2,3

(安徽醫科大學 1.第一附屬醫院腫瘤科、2.藥學院肝病研究所，3.炎癥免疫性疾病安徽省實驗室，安徽 合肥 230032)

BMPs是TGF-β超家族的成員，在胚胎發生過程中調控細胞生長和分化[1]。BMPs最初是從小鼠肝臟cDNA文庫中克隆出來的，對骨和軟骨的形成有一定的誘導作用，還能促進骨折的修復，因在體外調節成軟骨細胞和成骨細胞的生長和分化而被發現命名[2]，但隨著人們對BMPs日益深入的研究，發現BMPs除了可以誘導骨形成以外，BMPs還可調節一些細胞進程，包括細胞增殖、分化、趨化性、凋亡和遷移，且在心血管、肺、泌尿生殖系統和胃腸道系統等不同器官系統中發揮作用。BMPs作為多功能細胞因子，哺乳動物中包含多種配體，是最大的TGF-β亞家族。按其序列和結構同源性BMPs配體可分為不同的組別：BMP2和4；BMP5,6,7,8和8B；BMP9/GDF-2和BMP10；BMP11/GDF-11和GDF-8；BMP12/GDF-7,BMP13/GDF-6 和 BMP14/GDF-5；BMP15/GDF-9b和GDF-9；GDF1 和3；BMP3和BMP3b/GDF-10。此外，BMP1事實上是一種金屬蛋白酶，并不屬于BMPs家族。有研究表明，BMPs基因敲除或突變使BMPs的產生減少或功能異常，這些常會導致嚴重的疾病，并且通路中多種BMPs成分的缺失對胚胎多是致死的，例如BMP10在胚胎時期是由心臟產生，而在成年期則由右心房產生，但BMP10缺失可導致胚胎致死；BMP7基因敲除小鼠由于缺乏腎臟和眼睛在出生后不久便發生死亡；BMP9主要由肝臟產生，盡管BMP9突變會對蛋白質加工和/或功能產生負面影響，導致遺傳性出血性毛細血管擴張和肺動脈高壓，并且BMP9基因敲除小鼠有淋巴缺陷但卻并不能導致胚胎致死。除此之外，BMP9對肝臟的生理病理也有一定影響，但人們對其影響肝臟發病的具體機制卻仍然是知之甚少，因此，本文的主要目的是旨在闡述BMP9在肝臟的生理病理狀況下的作用。

1 BMP9

BMPs作為有絲分裂原和形態因子，在胚胎發育過程中其表達受到時間和空間的嚴格控制。研究發現，BMP9首先是作為前驅蛋白(precursor protein,pre-pro-BMP9)被肝臟表達分泌的，前驅蛋白由429個氨基酸組成，其中包含了22個氨基酸可引導前體進入分泌通路的N端信號肽，33 ku的prodomain和12.5 ku的C端受體結合區成熟肽[3]。其中，終端成熟區可通過二硫鍵的形成使pre-pro-BMP9形成二聚體，在內質網或高爾基體中的絲氨酸內切蛋白酶可通過剪切pre-pro-BMP9二聚體形成兩個大小為25 ku短的成熟肽二聚體和約100 ku的prodomain。人們普遍認為，BMP9是以一種具有生物活性的形式循環，功能和結構研究表明成熟肽BMP9與其prodomain的結合不僅不會抑制其生物學活性，也并不會妨礙其與信號受體的結合，并且在與受體結合時prodomain會從成熟蛋白中快速釋放出來[4]。

2 BMP9受體和信號通路

BMP9在肝臟以自分泌和旁分泌方式分泌，在人體中可以檢測到BMP9持續低濃度的表達，其可參與調控多種生物學功能，包括鐵離子平衡、軟骨形成、血管生成、神經元分化、糖脂代謝等。但是關于BMP9和肝臟疾病之間的聯系，我們卻仍舊知之甚少。因此，如果能充分了解BMP9信號轉導通路與肝臟病理過程中多個靶分子之間的關系，將有助于深入了解BMP9在肝臟疾病中的潛在作用。

被分泌的BMP9主要通過與絲/蘇氨酸激酶跨膜受體的結合而轉導信號，其中，BMP9受體主要被分為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體兩類，而Ⅰ型受體又可被分為激活素受體樣激酶1(the activin receptor-like kinase 1，ACVRL1 or ALK1)、ALK2(ActR-1A)、ALK3(BMPR1A) 和ALK6(BMPR-1B)4種，Ⅱ型受體又可被分為BMPRII、ActRIIA和ActRIIB 3種。其中，I型受體攜帶有兩個額外的基序，一個是位于激酶域(GS-box)之前的富含甘氨酸/絲氨酸的區域，而另一個是在激酶域內被稱為L45環，其是由8個氨基酸組成的短區域。Ⅱ型受體激酶具有結構活性。而細胞內信號的特異性主要由Ⅰ型受體決定。大多數成熟活性的BMPs分子是由同樣的單體BMP配體之間雙硫鍵的形成成為均二聚體。然而，體外和體內的證據都表明也存在一些BMP異質二聚體[5]。BMPs配體通過和兩個I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體二聚體組成異四聚體復合物，從而啟動信號轉導級聯。具體來說，I型受體激酶的激活需要配體結合，配體-受體的寡聚化并通過II型受體轉磷酸化GS-box從而活化Ⅰ型受體。BMPs配體與細胞表面BMP受體的細胞外區域結合后產生信號組裝，激活smad依賴(經典)和多種smad非依賴(非經典)信號通路，直接影響基因轉錄。

經典通路:Smad蛋白家族包含8種蛋白，可被分為3個亞族：調節性Smads(R-Smads)，共同性Smad(Co-Smad)，抑制性Smads(I-Smads)。其中，Co-Smad可與R-Smads結合轉導信號，而I-Smads下調Smads活化調節受體的穩定性抑制信號的轉導。BMPs結合I型和II型受體后，激活的I型受體磷酸化下游底物蛋白R-Smads的C端，一旦R-Smads磷酸化便進一步與共同性受體Smad4形成復合物，最終轉移至細胞核內，復合物通過與基因啟動子區域的SBEs或GC富集序列結合調節靶基因的轉錄。一般情況下，BMPs對與它們結合的受體和可能調節信號相關的共受體有所偏好，BMP9和BMP10對ALK1的親和性都很強，次之ALK2，最后是ALK3，ALK6。BMP9與受體結合之后，Ⅱ型受體磷酸化Ⅰ型受體，然后通過激活R-Smad1/5/8啟動下游信號傳導。這些Smads與Smad4的形成復合體使這種轉錄活性復合物的轉移到核內進而能夠調控BMP9的靶基因的表達，例如ID1。此外，BMP9還受到共受體內皮素(endoglin)的調節，BMP9對內皮素很敏感，親和力很高，內皮素與ALK1共同作用可增強BMP9的反應。

非經典通路：BMP9還可以根據細胞類型和環境特異性方式激活非經典通路，使細胞特異性反應受到嚴格的調控。非經典通路主要包括MAPK(p38，ERK，JNK)、PI3K/AKT、PKC等通路，這些通路形成了一個復雜的分子信號網絡，調控著機體的許多過程，但是目前由于我們對BMP9是如何通過如此復雜的非經典通路分子信號網絡是如何影響機體肝臟的了解仍舊不足，因此仍需要大量研究進行進一步的探究。

3 BMP9與肝臟損傷及再生過程

BMP9作為TGF-β家族的一員，盡管其對多種器官都有一定的作用，但對BMP9在肝臟特別是肝損傷后的具體功能知之甚少。隨著現代社會的進步，人們對酒精的需求量和攝入量更是逐年增加，酒精成為慢性肝損傷的主要因素之一，酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的發病率和死亡率持續不斷的增長。ALD，是指由長期攝入大量酒精導致酒精在體內蓄積而引發的肝臟性疾病，主要包括肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌[6]，其中肝臟脂肪變性通過戒斷酒精和適當治療是可逆轉的，并且只有極少一部分肝臟脂肪變性才會進展為酒精性肝炎(alcoholic hepatitis,AH)，繼而向更嚴重的肝纖維化，肝硬化甚至是肝癌進展。由于ALD的死亡率持續增長且目前仍舊缺乏有效的藥物治療方法，因此如何早期診斷并發現治療ALD的有效方法是我們現在急需解決的難題。

其中，肝纖維化程度的評估對ALD患者的治療決策具有重要價值，肝臟纖維化是一個由炎癥性細胞因子和腸道衍生物活化的肝臟星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)調節的胞外基質沉著的動態、漸進的過程[7-8]。TGF-β是肝纖維化的一個關鍵因素[9]，眾所周知，TGF-β能夠活化肝星狀細胞，調節ECM合成，提供細胞收縮和遷移能力，促使肝細胞發生凋亡及其信號誘導氧化應激和炎癥[10]。相比于TGF-β促進肝臟纖維化的作用，BMPs可能參與到這個過程最近才被提出。研究者通過誘導的肝臟急慢性肝損傷模型發現肝臟持續表達的低水平BMP9，其可以穩定健康肝臟的肝細胞功能；BMP9主要由HSCs產生，而一旦HSCs激活，內源性BMP9水平升高，在急性或慢性損傷時，BMP9水平升高會導致肝損傷增強，而阻斷BMP9/ALK1通路后可減輕肝臟纖維化，表明在肝臟損傷時下調BMP9可減輕肝臟損傷[11]。同樣的，有人通過DDC誘導的膽汁淤積性肝損傷發現敲除BMP9可以減輕肝臟損傷和纖維化[12]，并且還有一些研究發現通過靶向BMP9可降低肝臟的纖維化程度[3,13]。

眾所周知，中性粒細胞浸潤是ALD的最主要特征之一。除了KCs和竇狀內皮細胞外，HSCs也能表達LPS的主要受體TLR-4，并能通過促炎信號對LPS處理作出反應[14]。通過研究發現在肝臟急性損傷時例如LPS刺激，肝臟HSCs的BMP9的表達量下降[11]，提示BMP9與LPS和炎癥有某種關聯。有研究表明內皮素的缺乏可破壞白細胞聚集和內皮細胞介導的炎癥，并且發現BMP9-ALK1/2通路通過上調人內皮細胞表面的受體TLR-4、E-selectin和VCAM-1從而增強LPS誘導的白細胞浸潤，而只有BMP9時卻并不能誘導中性粒細胞的聚集[15]。此外，還有人發現BMP9和BMP10還可通過ALK2增強TNF-α誘導的單核細胞的聚集[16]。以上提示在肝臟損傷時人們或可通過靶向BMP9從而減輕肝臟損傷。也有人探討了通過干擾BMP9/ALK1信號通路治療肝臟損傷的可能性，為以后探尋治療肝臟損傷指明了可行性的方向。

BMP9是一種決定多種組織發育的蛋白，近年來，有人發現其在調控脂肪生成方面也有一定的作用。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)是成纖維細胞生長因子家族的一員，具有多種代謝功能，FGF21以胰島素不依賴的方式直接調節脂質代謝減少肝臟脂質積累。有實驗室通過給高脂飼料誘導肥胖的小鼠注射不同濃度重組BMP9衍生物MB109，發現MB109通過刺激FGF21的表達可降低血清ALT和膽固醇水平，促進褐色脂肪生成，從而抑制非酒精性脂肪肝和肥胖[17]。但是，也有一些研究者發現MB109誘導高脂飲食小鼠皮下，而非內臟脂肪組織，褐色脂肪形成基因的表達，并且注射MB109可增強肥胖小鼠肝臟脂肪酸合酶的表達，其或許通過ALK1將肝臟中的葡萄糖轉化為脂肪酸，降低血糖水平[18]。目前，人們對BMP9到底如何影響肝臟脂肪這一問題仍存在分歧，因此我們仍舊需要大量的實驗來研究BMP9是否對肝臟脂肪有調節作用。

在慢性病變肝臟中，肝細胞經歷一系列持續的損傷和代償性刺激，從而觸發旨在保護殘余實質及其功能的復雜反應。根據肝病的分期和程度，受損細胞要么被清除，要么被鄰近的細胞修復。尤其是肝細胞驅動的肝臟再生受損時，肝祖細胞(hepatic progenitor cells,HPCs)即通常所說的卵形細胞，成為再生的優勢細胞來源，又因為這些細胞經常形成導管樣結構，這種現象也被稱為導管反應。HPCs擴張后向肝實質遷移，分化為肝細胞或膽管細胞，補充細胞損失，重建肝功能[19]。大量的證據已經證實，無論是在動物模型中還是在人類中，在持續性肝損傷后，HPCs會發生強烈的活化、擴增和分化[20]。有學者在肝臟急慢性肝損傷模型中發現，BMP9可干擾肝臟再生，而暫時性的抑制BMP9可以有助于恢復肝臟損傷和肝臟再生能力的增強[11]。DDC誘導的膽汁淤積性肝損傷是一個被廣泛用作HPCs驅動的肝再生研究的化學損傷模型，有研究通過DDC誘導的肝再生模型發現BMP9是通過ALK2而不是ALK1，直接靶向卵形細胞抑制卵形細胞的擴增并促進其凋亡，從而干擾肝再生，提示通過靶向抑制BMP9或可促進肝再生[12,21]。

4 BMP9與肝癌的發生進展過程

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第五大最常見的癌癥，也是導致癌癥死亡的第三大原因，近年來其發病率和死亡率都在逐年增長。盡管人們對HCC的診斷和治療進行了廣泛的研究，但由于其分子機制的異質性和復發的高風險，預后仍不理想。肝切除、肝移植和幾種經皮治療是推薦給早期和中期HCC患者的治療方法。

BMPs在腫瘤發生過程中的作用，特別是在肝臟中的作用，近年來得到了廣泛的重視。HCC患者癌癥復發率高，預后差與肝癌傾向于形成腫瘤侵襲性和肝內和肝外轉移有關。上皮間充質化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是參與癌細胞惡性進展的主要機制之一。EMT的特點是上皮細胞分化特征的喪失，如細胞接觸性抑制和細胞極性的喪失，以及間充質特征的獲得，如較高的運動性、侵襲性和對凋亡的抵抗力等[22]。TGF-β信號被認為是惡性肝細胞EMT表型完整的關鍵誘導因子。據報道，它對包括肝細胞在內的上皮細胞具有雙重作用，在健康肝臟和肝癌形成的早期階段，TGF-β介導細胞周期阻滯和細胞凋亡，而在后期，它會導致細胞去分化，EMT和肝癌轉移。而作為TGF-β家族的一員BMP9是否對HCC也有著雙重的影響？人們發現BMP-9能夠穩定健康的肝細胞，幫助維持細胞的極化狀態和功能。此外，雖然生理水平的BMP-9對成熟(健康)血管具有抗增殖和穩定作用，但高水平卻可促進不同腫瘤的血管生成，而且，有研究通過檢測人類肝臟標本以及BMP9對肝癌細胞系的EMT標志物和細胞遷移的影響，發現BMP9/Smad1通路通過誘導EMT成為HCC的潛在啟動子，這或可成為治療肝癌是一個重要靶點[23]。有研究表明，BMP9在約40%的HCC患者中過表達。據報道，通過重組BMP9與人類肝癌細胞系HepG2細胞結合發現BMP9不僅與HepG2細胞具有很高的結合親和力還可以促進HepG2細胞增殖[23]。同時，也有研究表明，使用BMP9對肝癌細胞的刺激發現在HepG2中，BMP9觸發Smad1/5/8磷酸化和Id1表達的上調。此外，通過使用化學抑制劑、配體誘捕和基因沉默的方法，證明了HepG2細胞是自發產生BMP9的，還發現BMP9可促進HepG2細胞的細胞周期進展，并且引人注意的是BMP9完全消除了低血清中長期孵育誘導的凋亡細胞的增加，這揭示了BMP9既能促進增殖反應，又能在HepG2細胞中發揮顯著的抗凋亡功能，從而對肝癌細胞的生長產生巨大的影響，這為BMP9作為肝癌細胞生長調節劑、促進增殖和存活提供了證據[24]。以上提示BMP-9在腫瘤和非腫瘤情況下具有完全相反的功能，然而，BMP9雖然不僅能通過促進肝癌細胞的增殖和存活，還能通過誘導上皮細胞向間質轉化促進肝癌的遷移從而發揮促進腫瘤進展的作用，但是我們卻仍不清楚BMP9驅動這些效應的確切機制。因此，通過研究發現利用不同濃度的BMP9刺激人類肝癌HepG2細胞發現BMP9刺激可增加HepG2細胞數量，此外分別通過阻斷經典和非經典通路，發現在HepG2細胞中BMP9同時誘導Smad和非Smad信號級聯，尤其是PI3K/AKT和p38MAPK，但是卻只有p38MAPK通路參與了BMP9對這些細胞的促生長作用，并且還證明了p38MAPK的激活雖然對BMP9的增殖活性是不必要的，但對BMP9對抑制低血清誘導的凋亡的保護作用是必需的[25]。這些發現有助于我們更好地理解BMP9在肝腫瘤細胞中促腫瘤發生作用的信號通路，為以后我們的科學研究奠定了堅實的基礎。

綜上所述，目前的研究表明，BMP9及其信號轉導對肝臟損傷、肝再生和肝癌都有一定的影響，盡管這種情況很復雜，并且其具體影響的機制也并不清楚，但是這些發現為更好地理解BMP9的功能作用，特別是BMP9/ALK1信號通路在肝損傷和HCC發病機制中的作用提供了新的線索，這可能會激勵研究人員開發出有效的、有針對性的治療干預措施，為人類的健康作出貢獻。