間充質干細胞治療與自然殺傷細胞的相互作用①

李華杰 王福生 施 明

(北京大學三〇二臨床醫學院，解放軍總醫院第五醫學中心感染性疾病診療與研究中心，北京 100039)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有干細胞分化特性，但其分化能力有限，在許多疾病的治療中，MSCs通過可溶性細胞因子發揮的誘導分化、免疫調節能力，是其更加關鍵的治療機制。MSCs發揮的免疫調節能力影響著免疫系統的各個方面，其中TGF-β、NO/IDO、PGE2對自然殺傷細胞(nature killer cell，NK細胞)有著重要作用并借此影響著治療效果[1]。NK細胞是固有免疫中無須預先抗原刺激與活化，即能夠直接殺傷被病毒感染的細胞或腫瘤細胞的一群細胞。NK細胞廣泛分布于骨髓、肝臟、淋巴結、脾臟、肺臟和黏膜等器官。NK細胞根據其分化狀態可分為過渡型NK和成熟型NK，其表型各異，可根據需要向各類器官或組織遷移并進一步成熟分化。NK細胞有多種亞群，根據表達CD56分子密度可分為殺傷功能為主的CD56dim亞群和分泌細胞因子為主的CD56bright亞群[2]。NK細胞表達許多表面抑制性和活化性受體，在不同疾病中發揮不同的作用，影響著疾病進展，是MSCs治療的靶點之一。

1 MSCs與NK細胞的相互作用

1.1MSCs對NK細胞的作用 現有研究普遍認為MSCs發揮免疫抑制效應，無論靜態細胞模型還是模擬感染和組織損傷的動態模型，都發現MSCs會抑制NK細胞以減弱炎癥反應[3-5]。MSCs不僅會影響NK細胞表面分子表達，如共培養后MSCs對NKp30、NKp44、和CD69等表達的抑制[6]，還會抑制其增殖和發揮功能(細胞因子分泌及細胞毒作用)[7]，如斑禿小鼠模型中MSCs可通過抑制NKG2D來控制毛囊炎癥[8]。在應用CCl4建立的肝炎小鼠模型中發現，應用IFN-γ、TGF-β等細胞因子預處理的MSCs在小鼠體內更傾向分布于肝臟，且其免疫調節能力會進一步升高，炎性因子的下降和其對NK細胞裂解敏感性的降低使MSCs的更加適用于治療[9]。

MSCs對各種免疫細胞有抑制效應，但它在特定條件下亦有額外的免疫刺激能力。有研究發現無論健康捐獻者還是免疫抑制患者，IL-12和IL-18刺激下的MSCs能促進NK細胞釋放IFN-γ，高水平表達CCR2的CD56brightNK細胞對MSC的作用更加敏感[10]。MSCs對NK細胞的影響還隨時間變化而變化。使用聚肌胞甘酸(poly I∶C)刺激模擬MSCs與NK的相互作用發現，在早期MSCs可通過分泌Ⅰ型干擾素增強NK細胞效應功能，但隨后MSC分泌的TGF-β和IL-6又會誘導調節衰老樣NK細胞表型，下調炎癥反應，限制NK細胞效應功能，反過來促進了MSCs的存活、增殖和促血管生成。以上結果表明MSCs的功能可能會隨感染階段不同而改變[11]。

在一項多中心的臨床實驗中，62名慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus-host disease，cGVHD)患者經過230次輸注臍帶血間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)(3×107cells/100 ml/per month)后NK細胞數量減少[12]。同時Zhao等[13]證明同種異體移植物中高濃度的NK細胞與急性和慢性GVHD風險增加有關。因此，觀察到NK細胞減少可能是MSCs組中cGVHD發生率較低的原因之一。

1.2NK對MSCs的作用 生理條件下，NK細胞可以與組織內除NKT和γδT細胞外其他細胞相互作用，如單核細胞衍生的巨噬細胞和樹突細胞，中胚層細胞和細胞外基質成分等，其中就包括MSCs[14]。

MSCs對靜息的NK細胞有抑制作用，但對已活化的NK細胞反而有促進作用，可以進一步提高NK細胞毒性[15,16]。各種刺激活化的NK細胞與骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)共培養均發現，NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α增加，且活化NK細胞會殺傷BM-MSCs，誘導BM-MSCs內活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生，減弱細胞活力，降低serpin B9(一種絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，抑制粒酶B的釋放)表達[17]。MSCs會被IL-2刺激活化的NK細胞溶解，且NK細胞毒性與其CD16表達的減少和CD56表達的升高呈正相關[18]。NK細胞可以攻擊MSCs上識別NKG2D和DNAM1的配體，借此誘導殺傷MSCs，釋放促炎因子[19]。

體外活化NK細胞對MSCs的殺傷作用可以削弱MSCs的治療效力，且已有研究發現這種能力不會被免疫抑制藥物影響，在培養基內活化前以及活化期NK細胞中添加免疫抑制藥物可以減少NK數量但不影響它裂解MSCs的能力[20]。

對這種殺傷作用MSCs并不是完全沒有抵抗能力的，MSCs的Toll樣受體3與配體的結合可以削弱NK細胞的殺傷[21]。Toll樣受體是MSCs重要的表面受體，這些受體傳遞的信號既影響MSCs對固有性免疫和適應性免疫的調節作用，又影響NK細胞對MSCs的殺傷作用[22,23]，是在活體內MSCs的作用依然占主導而沒有被完全殺傷的原因之一。比較細胞因子預處理的UC-MSCs發現，經過細胞因子[TGF-β、IFN-γ、多細胞因子混合物(multiple cytokine cocktail，MC)]處理的臍血MSCs可以免受NK細胞的裂解(與未處理UC-MSCs相比NK細胞CD107a的表達顯著降低)[9]。

2 MSCs在治療中對NK細胞的影響

由于多樣化的表面受體、細胞內信號分子及轉錄因子表達、組織特異性印跡和外來抗原暴露，人們對NK 細胞多樣性的認識比最初認為的要廣泛得多。盡管多數亞群有共同的CD56brightCD16-顯性，但它們受各個組織獨特的微環境所影響，因此彼此不全相同[2]。各個組織的NK細胞亞群都具有獨特的表型特征，其表型和功能亦不相同。如肝臟富集NK細胞，占肝總淋巴細胞的30%～50%，且CD56bright肝NK細胞亞群占其中40%，遠高于外周血比例，它們的表面分子(如CXCR6)表達、顆粒、功能(如產生促炎性細胞因子減少及脫顆粒和細胞毒作用增強)與外周血NK細胞均不同[11]。

因此，機體內的NK細胞在比例、含量、亞群、表達及功能上差異的NK細胞對疾病及治療有著深刻影響。

2.1NK細胞是MSCs治療的重要靶點 MSCs與NK細胞會形成一個穩定的炎癥-修復系統，既保證了適當的炎癥抵御外界侵害的損傷，又避免了過度炎癥及組織的破壞。這已經在許多體內外實驗中得到驗證[11,14]，包括移植物抗宿主病的臨床治療、肝衰竭的治療等。例如使用MSCs治療HBV感染的小鼠的實驗中，體內成像發現MSCs在受損肝內聚集且肝臟炎性細胞浸潤減少，同時抑制HBV感染所需的NK細胞激活性受體NKG2D的表達[24]。

整體上并未觀察到NK細胞抑制MSCs的實際療效，但消除MSCs對NK細胞的影響可以進一步確定MSCs的療效并可能促進MSCs治療的優化[20]。如IL-2活化的NK細胞對MSCs的殺傷會因淋巴細胞和MSCs的比例不同而改變，因此研究活化NK細胞對MSCs的影響可能改善MSCs治療的潛力[18]。

綜上，MSCs對NK細胞的抑制主要體現在活化及增殖的削弱，而MSCs發揮功能的前提亦需要炎性環境等激活，未激活的MSCs功能并不明顯。因此它們的相互作用促進了MSCs對疾病的治療。

2.2不同來源MSCs的選擇對治療和NK細胞的影響 盡管MSCs最終會被異體受者的免疫系統清除，但MSCs低表達MHCⅠ類分子，不表達MHCⅡ類分子，這種低免疫原性保護MSCs免受NK細胞的攻擊并抵抗移植排斥[25]。不同來源的MSCs對不同的疾病的作用和影響不盡相同，其中UC-MSCs是異體移植中較好的選擇[26]。UC-MSCs相比BM-MSCs和脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AT-MSCs)壽命長、數量多、易于增殖、無侵入性、倫理爭議小且p53、p21和p16這些衰老相關標志表達更低[26,27]。長期體外擴增的MSCs可以保持自身的穩定，但其免疫抑制特性會略有下降[28]。

不同來源的MSCs對包括NK細胞在內的免疫細胞影響也不盡相同。使用較多的BM-MSCs與AT-MSCs有著相似的表型，都可以削弱NK細胞的增殖和細胞因子分泌[29]，但只有BM-MSCs明顯減弱NK細胞毒作用。此外，它們對其他免疫細胞的作用亦略有不同[30]。

2.3MSCs抑制NK誘導的促腫瘤風險 應用MSCs的免疫抑制功能來減弱免疫損傷可以治療疾病，但對于有腫瘤風險的患者(而非腫瘤患者)是把雙刃劍，可能促使腫瘤形成。在腫瘤形成時，腫瘤內MSCs(腫瘤微環境影響下的MSCs，有分泌能力等的改變)對免疫系統的作用同樣是抑制的，可能增加腫瘤風險[3,31]。腫瘤內MSCs通過直接及間接影響調節性T細胞和巨噬細胞對NK有抑制作用，可以促進腫瘤的生長[32]。如腫瘤內MSCs比正常來源的MSCs有更強的免疫抑制性，且對NK細胞亞群影響不同，它們誘導NK細胞CD56dim表型NK增多且抑制CD56bright亞群產生IFN-γ[33]。正常人和乳腺癌患者中的MSCs在同等情況下對NK細胞有相似的抑制效應[34]。

盡管MSCs有促腫瘤風險，但對腫瘤患者可以利用MSCs的腫瘤趨向性來抗腫瘤，如通過基因操作、體外IFN-α或化學試劑處理來調節它們的免疫修飾能力。這樣，MSCs可以用于增強抗腫瘤免疫反應或特異運輸抗腫瘤信號，并還可作為載體用于運送細胞毒藥物直接到腫瘤位點。但基于MSCs的腫瘤治療應依據腫瘤的類型、定位和階段以及腫瘤微環境中的免疫狀態來選擇[3]，因此其在有腫瘤風險患者中的應用安全性還有待商榷。

3 結語與展望

間充質干細胞是干細胞治療中的優勢選擇，它具有來源廣泛、易于增殖、倫理爭議小、免疫原性低、分化潛能高和免疫調節性強等治療優勢。其中，分化潛能在實際治療中發揮作用較小，而針對時刻變化的疾病狀況中錯綜復雜的免疫系統，MSCs的免疫調節能力可以更加廣泛的應對。MSCs如何與免疫系統相互作用，其背后的機制十分值得探究，NK細胞與MSCs的相互作用僅是其機制的一部分，對其機制的進一步研究可為應用MSCs治療疾病提供理論支撐。盡管活化的NK細胞有殺傷MSCs的作用，但MSCs的治療作用在過去的許多實踐中已經被證實，在各種動物以及人的疾病模型實驗中都發揮了積極的作用[35]。且通過不同的處理可進一步改善MSCs的功能以改進治療效果，活化NK細胞對MSCs的殺傷作用在活體中并未觀察到。本篇綜述討論了過去所做的成果以進一步探究背后的機制與意義。NK細胞作為免疫系統的關鍵環節在疾病發生發展中發揮關鍵作用，MSCs治療中，MSCs對NK細胞的抑制作用影響著治療效果，是治療機制的一環，可以促進MSCs在治療上的應用。