抗人載脂蛋白6單鏈抗體的篩選、制備及活性鑒定①

陳 炯 詹 飛 馮 巍

(河南科技大學法醫學院，洛陽 471023)

人類載脂蛋白6 (human lipocalin 6，hLCN6) 是新發現的一類附睪特異性表達并分泌的載脂家族蛋白，能與精子頭部和尾部結合，與精子成熟有關[1]。本實驗室曾構建了抗hLCN6雜交瘤細胞株1B2，分泌鼠源單克隆抗體具有較高的組織特異性與靈敏度[2]，可用于精子的免疫熒光檢測。目前，hLCN6單克隆抗體 (hLCN6 mAb) 偶聯的免疫磁珠可有效用于混合細胞中精子的分離與法醫學鑒定[3]。與傳統單抗相比，小分子重組抗體因分子量小、易于進行基因工程操作而備受重視[4-6]，包括單鏈抗體 (scFv)、雙價單鏈抗體 (bsFv) 和嵌合抗體Fab片段，既保留了親本抗體所具有的高親和力和特異性，又簡單經濟且易于改造，是基于抗原-抗體相互作用分離精子的理想材料。本研究通過構建抗hLCN6全套鼠源scFv噬菌體抗體文庫，篩選親和力和特異性較好的抗hLCN6 scFv,并進行原核表達純化和鑒定,為后期規模化制備該抗體偶聯的免疫磁珠、法醫混合斑中精細胞的分離奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料 按照知情同意原則，實驗用精液樣本及女性口腔上皮細胞樣本，分別由本實驗室健康成年男性和女性志愿者提供。BALB/c小鼠購自中科院上海實驗動物中心；大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)Rosetta(DE3)、pET-28a質粒、hLCN6抗原及小鼠抗hLCN6 mAb 1B2由本室保存或制備；噬菌體載體pFAB5C購自Biovector公司；E.coliXL1-Blue和輔助噬菌體M13KO7購自美國Stratagene公司；Triziol試劑和反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；膜蛋白提取試劑盒購自美國Biovision公司；Sulfo-NHS-LC-Biotin、DynabeadsTMM-280 Streptavidin和HRP-Streptavidin試劑盒購自Thermo Fisher公司；鼠抗噬菌體M13抗體、HRP-羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒和增強型化學發光底物 (ECL) 購自Pierce公司；Ni-NTA親和層析填料購自QIAGEN公司；弗氏佐劑和四甲基聯苯胺 (TMB) 購自Sigma-Aldrich；限制性內切酶、dNTPs、Taq酶和DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自北京天根公司；超濾濃縮管購自Millipore公司；引物購自蘇州金唯智公司；其他試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1全套VH、VL基因的擴增和鑒定 hLCN6抗原的制備及動物免疫方法參照文獻[2]。用TRIziol試劑從致敏小鼠的脾細胞中提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。根據小鼠免疫球蛋白可變區基因序列中相對保守的框架區FR1、FR4，設計了4對簡并引物[7]。序列如下：VHfor:5′-TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAG-ACRGTGA-3′，VHback:5′-SAGGTGMAGCTKCASSA-RTCWGG-3′；VLfor:5′-GGATCAAGTTGGTCCACCATCAGCCCGTTT-3′，VLback:5′-GACATTCTGMTSACMCAGWCTCCA-3′；VH′ for:5′-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTGMRGAGACD-GTGAGCGTGG-3′，VH′ back:5′-ATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCSAGGTGCARCTKGTGSAGTCWGG-3′；VL′ for:5′-ATTCTGCGGCCGCTTACCGTTTYATYTCCARCTTKGTCCC-3′，VL′ back:5′-GGCTCGGG-TGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATTCT-GMTSACMCAGWCTCCA-3′。其中：r=A/G,Y=T/C,M=A/C,W=A/T,K=G/T,S=C/G，D=G/A/T，劃線部分分別為SfiⅠ和NotⅠ酶切位點。以上引物由蘇州金唯智公司合成。以cDNA為模板，分別以VHback、VHfor以及VLback、VLfor為引物，PCR擴增全套可變區基因。產物經瓊脂糖電泳分離后，切膠回收全部VH、VL基因。

1.2.2全套scFv基因的克隆和鑒定 以純化的VH、VL全套基因為模板，相應地分別以VH′ back、VH′ for及VL′ back、VL′ for 為引物，在VH的5′端和3′端分別加上SfiⅠ酶切位點、連接肽編碼序列；在VL的3′端和5′端分別加上NotⅠ酶切位點、連接肽編碼序列。PCR產物經電泳分離后，將全部VH′、VL′基因切膠回收。以純化的VH′、VL′全套基因互為模板和引物，進行重疊延伸PCR形成編碼連接肽(Gly4Ser)3的序列，從而將全套VH′、VL′基因隨機拼接為scFv。PCR反應先94℃變性45 s，58℃退火45 s、72℃延伸1 min，循環7次；再加入VH′ back、VL′ for引物，按上述參數繼續循環30次。產物經電泳分離后，膠回收全套scFv基因，經SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后與相同酶切的pFAB5C噬菌體質粒連接。連接產物轉化感受態E.coli XL1-Blue，涂布于含100 μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的2×YT (2×YTAG) 瓊脂板上，37℃培養過夜。隨機挑取單克隆抗體進行菌落PCR鑒定。

1.2.3ScFv基因噬菌體抗體庫的構建及滴度測定 用15 ml 2×YTAG培養液洗下菌苔，培養至OD600=0.4～0.6，加入2×1010空斑形成單位 (pfu) 輔助噬菌體M13KO7于37℃、220 r/min振蕩培養1 h，以1 000 g離心10 min，沉淀用10 ml含100 μg/ml氨芐青霉素和50 μg/ml卡那霉素的2×YT培養基重懸，于37℃、220 r/min振蕩培養過夜。次日，1 000 g 離心20 min，收集上清即為噬菌體抗體庫。用0.45 μm的微孔濾膜過濾后于4℃保存。將5 μl經適當稀釋的噬菌體抗體庫加到 100 μl OD600=1的XL1-Blue菌液中，室溫放置15 min,涂布于2×YTAG瓊脂板上，37℃培養過夜，計算集落形成單位 (cfu) 即為噬菌體抗體庫滴度。

1.2.4抗hLCN6 scFv 的篩選 純化的hLCN6蛋白按Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑盒說明書進行生物素化。約5×1011cfu新鮮制備的scFv文庫噬菌體用封閉液 (1×PBS緩沖液中含3% BSA,0.05% Tween-20) 于室溫封閉1 h，加入10 μg生物素化蛋白于封閉后的噬菌體抗體庫中，37℃緩慢振蕩孵育1 h。按說明書加入鏈霉親和素包被的M-280磁珠于混合液中，振蕩孵育30 min捕獲抗原-抗體復合物。用含0.1% Tween-20的PBS緩沖液 (PBST) 洗滌磁珠10次，胰酶消化30 min后洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體溶液感染XL1-Blue后涂布2×YTAG培養板，37℃培養過夜，同時進行噬菌體滴度檢測，計算噬菌體output、input等，完成第1輪篩選。用M13KO7進行超感染，對再次生成的抗體庫進行第2輪篩選。該過程重復4輪以獲得具有特異性抗體的噬菌體文庫。

1.2.5陽性克隆的ELISA檢測 將第4輪親和富集篩選的陽性噬菌體感染E.coliXL1-Blue后，從所涂布的平板上隨機挑取單克隆菌落接種到96孔細胞培養板 (含2×YTAG培養基) 培養過夜。次日從該板上轉接2 μl菌液至第二塊96孔板，37℃培養至OD600=0.6～0.8時加入1 mmol/L IPTG誘導，30℃培養過夜。次日離心取上清進行ELISA檢測[8]。用hLCN6抗原 (2 μg/孔) 包被96孔酶標板，經5%脫脂奶粉封閉后，每孔加入30 μl誘導上清，陰性對照孔加入輔助噬菌體M13KO7超感染的pFAB5C空載體離心上清，陽性對照孔加入抗hLCN6 mAb，空白對照孔直接加PBS，室溫孵育1 h。PBST洗3次后，每孔加入1∶5 000稀釋的鼠抗噬菌體M13抗體，室溫孵育1 h。洗板3次后，加入HRP-羊抗鼠IgG孵育1 h。再以PBST洗板3次后加入TMB底物顯色，然后加入2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀讀取OD450值。陽性克隆菌株確定標準為：OD值為陰性對照值3倍以上。

1.2.6陽性克隆的基因序列分析及表達純化 對ELISA檢測陽性克隆進行測序以確認抗體序列。根據pFAB5C載體序列合成測序引物。P1:5′-TATGCTTCCGGCTCGTATGT-3′，P2:5′-GTCAGACGATTGGCCTTGAT-3′。再以陽性噬菌體質粒為模板，用上游引物5′-GGAATTCCATATGGTCAAACTGCAGCAGTCTGG-3′ (劃線部分為NdeⅠ限制性酶切位點)、下游引物5′-CCGCTCGAGCTACCGTTTTATT-TCCAGCTTGGTCCC-3′ (劃線部分為XhoⅠ限制性酶切位點) 擴增不含基因Ⅲ信號肽序列的scFv基因，連接到pET-28a表達載體后轉化E.coli Rosetta (DE3)，挑取單菌落于LB液體培養基中 (含50 μg/ml 卡那霉素和34 μg/ml氯霉素) 過夜培養，再以 1∶100的比例放大培養至OD600=0.6～0.8，加入1 mmol/L IPTG于37℃誘導表達6 h。離心收集菌體，懸浮于20 ml裂解緩沖液 (50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，100 μg/ml 苯甲基磺酰氟，pH 8.0) 中，置于冰上進行超聲破碎。將菌體裂解液15 000 r/min 離心20 min，收集上清，用0.45 μmol/L濾膜過濾，上樣于Ni-NTA螯合柱，用20%的洗脫緩沖液 (50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH8.0) 洗脫5個柱體積，之后以100%洗脫緩沖液洗脫，收集各洗脫峰，進行SDS-PAGE分析后合并高純度樣品。將合并的樣品透析過夜后后用超濾法濃縮。以BCA法進行定量。

1.2.7抗hLCN6 scFv的生物學活性鑒定

1.2.7.1Western blot檢測 純化的scFv蛋白按Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑盒說明書進行生物素化。將誘導后的hLCN6表達菌株裂解后上樣，經SDS-PAGE電泳后轉膜，進行Western blot檢測。精子與口腔上皮細胞混合懸液的制備參照文獻[3]。取精子(1×105個/ml)和口腔上皮細胞(1×104個/ml)懸液各1 ml，用膜蛋白提取試劑盒提取精子細胞膜蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，每份樣品取等量 (80 μg) 進行Western blot檢測。一抗為1∶200稀釋的生物素標記的scFv，二抗為1∶500稀釋的HRP標記的鏈酶親和素，用ECL化學發光底物顯影成像。

1.2.7.2間接ELISA法檢測抗hLCN6 scFv的親和力 參考文獻[3]，scFv按Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑盒說明書進行生物素化。利用間接ELISA法測定抗hLCN6 mAb的親和力，以1 μg/ml hLCN6蛋白包被酶標板，用含3%脫脂奶粉的PBS溶液室溫封閉1 h，PBS洗滌。加入倍比稀釋的scFv，室溫孵育1 h。PBST洗板3次，加入HRP標記的鏈酶親和素，室溫孵育1 h。洗滌后加底物溶液避光顯色，酶標儀讀取OD450值。當連續幾個稀釋度的OD450讀數不再增大時視為抗原抗體100%結合，以抗體濃度 (mol/L) 為橫坐標，OD450吸光值為縱坐標作散點圖，生成對數趨勢線和公式。將OD450最大值的一半代入公式，求出此時的抗體濃度即為scFv的親和力解離常數(Kd)。

2 結果

2.1全套scFv基因的克隆與噬菌體抗體庫的構建 將全套VH、VL基因擴增產物進行電泳后，擴增出的VH基因片段約為340 bp，VL基因片段約為320 bp，與預期大小一致 (圖1A)。將全套VH、VL基因添加酶切位點及連接肽序列后，用重疊延伸PCR將重、輕鏈可變區拼接成完整的scFv基因，拼接擴增產物經電泳后，得到1條約710 bp的片段，同預期結果相符 (圖1B)。將拼接產物雙酶切后與載體連接，轉化E.coli后鋪板，測定庫容為1.5×106，隨機挑取10個集落，PCR擴增鑒定重組率為90% (圖1C)。

圖1 全套scFv基因的克隆與鑒定Fig.1 Cloning and identification of anti-hLCN6 scFv geneNote: A.PCR amplification of VH and VL gene repertoires；M.DNA marker.Lane 1.Product of VH gene;Lane 2.Product of VL gene;B.Identification of scFv gene products；M.DNA marker;Lane 1-2.PCR products of scFv gene;C.PCR identification of recombinant scFv clones.

2.2噬菌體抗體庫的篩選及陽性克隆的鑒定 噬菌體抗體庫經4輪富集篩選后，噬菌體抗體收獲率由第1輪的2.5×10-8增加到第4輪的3.3×10-5，富集倍數增加1 000多倍 (表1)。將第4輪親和富集篩選的陽性噬菌體感染E.coliXL1-Blue后，從所涂布的平板中隨機挑取48個單克隆菌落接種于96 孔板中進行培養并誘導表達scFv，用ELISA進行初步篩選，最后得到2株陽性克隆，其分別命名為AM38-6和AM38-7。測序分析表明，2個克隆為同一序列。其中重鏈可變區基因長342 bp，編碼114個氨基酸；輕鏈可變區基因長327 bp，編碼109個氨基酸 (圖2)。NCBI blast分析表明，該scFv基因序列符合數據庫中單鏈抗體所具有的特點，其重鏈可變區與小鼠IgG的γ重鏈同源性達95.8%，輕鏈可變區與小鼠κ鏈同源性達97.9%，重鏈和輕鏈可變區具有完整的骨架區和互補決定區 (劃線序列) 結構。

表1 親和富集篩選對抗hLCN6 scFv的富集效應

Tab.1 Selective enrichment of anti-hLCN6 phage antibodies from phage display library

Round Input(cfu)Output(cfu)Recovery rate(output/input)Enrichment[rate(n)/rate(1)]11.0×10132.5×1052.5×10-8121.5×10122.0×1061.3×10-65232.0×10123.8×1071.9×10-576042.4×10127.9×1073.3×10-51 320

圖2 抗hLCN6 scFv基因序列分析Fig.2 Sequence analysis of anti-hLCN6 scFv geneNote: Underline.CDR region;Bold.Linker.

2.3抗hLCN6 scFv的表達純化與生物學活性鑒定 轉化hLCN6 scFv表達質粒的工程菌經誘導培養后，離心收集上清，經Ni-NTA親和層析柱分離純化后，收集目的蛋白進行SDS-PAGE檢測，經考馬斯亮藍染色后呈單一蛋白條帶，表明純化的scFv具有較高的純度。蛋白樣品分子量約為27 kD，與scFv理論分子量基本一致 (圖3A)。scFv經濃縮和BCA法定量后，其濃度為2.65 mg/ml。Western blot顯示，以純化的生物素標記的scFv作為一抗，在誘導菌株裂解物和精子中均檢出hLCN6蛋白，與蛋白已知分子量一致，而口腔上皮細胞中檢測結果呈陰性，證明scFv可與hLCN6抗原發生特異性結合(圖3B～D)。利用間接ELISA實驗測定抗hLCN6 scFv的親和力，結果表明該抗體與抗原的Kd值為6.69×107mol/L (圖4)。

圖3 抗hLCN6 scFv的純化與活性鑒定Fig.3 Purification and activity identification of anti-hLCN6 scFvNote: A.ScFv purification by affinity chromatography with a Ni-NTA column;M.Protein marker;Lane 1.Supernatant of lysed bacteria after induction;Lane 2.Loading solution passed through a Ni-NTA column;Lane 3.Elution with wash buffer containing 50mM imidazole;Lane 4-5.Elutions with buffer containing 250mM imidaz-ole；B.hLCN6 expression in E.coli Rosetta (DE3);M.Protein marker;Lane 1.Rosetta (DE3)/pET-28a-hLCN6 (IPTG uninduced);Lane 2.Rosetta (DE3)/pET-28a-hLCN6 (IPTG induced);Lane 3.Precipitation of hLCN6 protein strain after ultrasonication.hLCN6 is indicated with an arrow；C.Western blotting analysis of figure B with anti-hLCN6 scFv;D.Western blotting analysis of hLCN6 expression in spermatozoa and buccal epithelial cells with anti-hLCN6 scFv.Lane 1.Buccal epithelial cells; Lane 2.Spermatozoa.

圖4 抗hLCN6 scFv親和力測定Fig.4 Affinity assay of anti-hLCN6 scfv

3 討論

精子在附睪中所進行的表面修飾是精子成熟過程中不可或缺的一步[9]。hLCN6是新發現的一個附睪特異性分泌表達的載脂家族蛋白，它能夠結合到精子的頭部和尾部，與精子的成熟有關。本實驗室曾以E.coli表達純化的hLCN6為抗原，獲得了抗hLCN6 mAb，其偶聯的免疫磁珠可成功用于混合細胞中精子的分離與鑒定。但由于mAb制備成本較高，難以滿足大規模法醫檢案的需要，因此制備經濟有效的基因工程抗體成為必需。本實驗室曾用RT-PCR法從雜交瘤細胞中克隆抗體可變區基因，但得到的scFv無抗原結合活性，原因可能是設計的簡并引物改變了第一骨架區氨基酸序列，從而影響了抗原與抗體的結合[10]。近年來，噬菌體抗體已成為基因工程抗體研究的熱點，并被廣泛應用于生命科學各個領域[11-13]。通過噬菌體展示技術可以快速制備出針對幾乎所有抗原的功能抗體片段。scFv是目前研究最多的基因工程抗體之一，其免疫原性低，能較好地保持對抗原的親和性，且易于基因操作和大量生產[14]，對法醫物證檢案頗具價值。

因此，為了快速制備鼠源抗hLCN6 scFv，本研究利用噬菌體展示技術成功構建了全套scFv噬菌體抗體庫，最終獲得了2株能與hLCN6抗原特異結合的陽性克隆。構建的工程菌經IPTG誘導后呈可溶性表達，進而采用親和層析純化，獲得了高純度的scFv抗體。Western blot和間接ELISA實驗表明，純化的scFv與hLCN6具有較高的親和力，能夠特異性的識別并結合精子上的hLCN6蛋白。

綜上，與本實驗室曾采用的以E.coli原核表達系統制備抗hLCN6 scFv相比，利用噬菌體展示技術制備scFv更能保持其抗原結合活性，可大量生產，為后續構建抗hLCN6 scFv免疫磁珠用于法醫混合檢材中精細胞的鑒定與分離奠定了基礎。