miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細胞SGC-7901生長和遷移

林志金 張長青 陳新琦 許伯明 李穎怡 陳雅妮

(泉州市第一醫院消化內科,泉州 362000)

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一[1]，該疾病早期起病隱匿，且無明顯的臨床癥狀，當患者被確診時已錯過最佳治療時間，導致胃癌成為預后差、病死率較高的疾病之一[2]。近年來研究表明，長鏈非編碼RNA(non-coding RNA,lncRNA) 在調控癌癥的發展過程中發揮了重要作用[3,4]。凌斌勛等[5]研究表明miR-149和FOXM1具有靶向性，可以有效抑制前列腺癌細胞的生長。趙濤等[6]研究表明miR-149通過靶向FOXM1抑制前列腺癌細胞生長和侵襲，發揮抑癌基因的作用。但目前關于miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細胞生長和遷移的機制研究較少。本文旨在探究miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細胞SGC-7901生長和遷移的作用機制，從而為胃癌患者治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要細胞 人胃癌細胞SGC-7901購自中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 TRAIL購自英國Pepro Tech 公司；磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司；RPMI1640 培養基購自廣州威佳科技有限公司；青霉素鈉購自哈藥集團制藥總廠；DMEM基礎培養基購自賽默飛世爾科技公司；CCK-8 試劑盒購自默沙克有限公司；N-cadherin、E-cadherin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；MMP-9、MMP-2抗體購自美國Sigma公司；PCNA抗體購自Sino Biolocgical公司；FOXM1、p21抗體購自上海恒遠生物科技有限公司。低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；光學顯微鏡購自東莞市同創儀器有限公司；酶標儀購自上海儀電分析儀器有限公司；細胞培養箱購自美國Forma公司；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；TRIzol試劑盒購自賽默飛公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將人胃癌細胞SGC-7901培養于含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2培養箱內培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞轉染 將細胞傳三代培養于6孔板中，培養24 h后進行細胞轉染。嚴格按照轉染試劑盒說明書方法操作，轉染48 h后，收集細胞，進行后續實驗。

1.2.3RT-PCR 各組細胞轉染后，用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA，測定RNA濃度和純度，反轉錄試劑盒合成cDNA，PCR擴增，以GAPDH為內參按照試劑盒操作方法檢測各RNA表達水平。

1.2.4熒光素酶報告實驗 利用生物信息預測網站預測miR-149-3p和FOXM1的結合片段，用RT-PCR擴增miR-149-3p上兩者的結合片段，構建FOXM1野生質粒，再利用基因突變技術將結合位點突變，構建FOXM1突變質粒。用FOXM1野生質粒、FOXM1突變質粒和miR-149-3p分別或同時轉染細胞，用Dual Luciferase報告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.2.5Western blot 檢測蛋白表達水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h 后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以GAPDH為內參蛋白，顯色液顯色后進行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.2.6CCK-8檢測胃癌抑制率 取上述對數生長期的細胞，接種于96個孔板中(100 μl/孔)。放入37℃、5%CO2培養箱中培養 24 h，待細胞貼壁后，分別培養 0、1、2、3 d 后加入 10 μl CCK-8 溶液培養 2 h后使用酶標儀測定 450 nm 處各孔的吸光度值，計算胃癌細胞的抑制率。

1.2.7體外侵襲實驗 將各組細胞密度調整為：1×105個/ml，恒溫培養1 d后用結晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，顯微鏡觀察細胞形態，同時統計細胞數量。

1.2.8劃痕實驗 單層細胞使用槍頭劃橫線，培養1 d后顯微鏡下再次觀察拍照。

1.3統計學分析 本研究數據分析和作圖采用SPSS22.0和GraphPad Prism5，方差分析使用單因素方差分析，當組間差異存在統計學意義時，采用SNK方法進行進一步的比較；使用單因素方差分析時，若P<0.05則表明數據差異有統計學意義，本研究所有檢驗均為雙側檢驗。

2 結果

2.1不同組織中miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達水平及關系 由圖1可知，相比正常組織，原位腫瘤組織miR-149-3p表達顯著降低、FOXM1 mRNA表達顯著升高(P<0.01)，相比原位腫瘤組織，轉移后腫瘤組織miR-149-3p表達顯著降低、FOXM1 mRNA表達顯著升高(P<0.01)；隨著miR-149-3p表達的升高FOXM1 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。

2.2轉染后細胞miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達水平 由圖2可知，相比空白組，陰性對照組miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達水平無顯著變化(P>0.05)；而mimic組miR-149-3p表達水平顯著升高(P<0.05)；FOXM1 mRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 不同組織中miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達水平及關系Fig.1 Expression levels and relationship of miR-149-3p and FOXM1 mRNA in different tissuesNote: A.Expression of miR-149-3p in each group； B.Expression of FOXM1 mRNA in each group； C.Linear relationship between expression of miR-149-3p and FOXM1 mRNA.1.Normol tissues；2.Tumor tissues in situ；3.Metastatic tumor tissues.

圖2 轉染后細胞miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達水平Fig.2 Expression levels of miR-149-3p and FOXM1 mRNA in cells after transfectionNote: A.The expression of miR-149-3p in each group；B.The expression of FOXM1 mRNA in each group.Compared with blank control group, **.P<0.01.

2.3miR-149-3p與FOXM1的靶向關系驗證結果 由圖3熒光素酶報告實驗結果可以看出，野生型純合子FOXM1和miR-149-3p存在互補配對的堿基。相比陰性對照組，轉染組野生型純合子FOXM1 熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；兩組純合子FOXM1 熒光素酶活性無顯著差別(P>0.05)。

2.4細胞增殖及相關增殖蛋白檢測結果 由圖4可知，0～2 d內，各組細胞增長無顯著差別(P>0.05)，3 d時，相比空白對照組，miR-149-3p過表達組細胞增長顯著降低(P<0.05)；相比FOXM1過表達組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組細胞增長顯著降低。由圖4B可知，相比空白對照組，miR-149-3p mimic組FOXM1、P21蛋白表達顯著升高，PCNA表達顯著降低(P>0.05)；相比空白對照組，pLV-FOXM1組FOXM1、P21蛋白表達顯著降低，PCNA表達顯著升高(P<0.05)；相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組FOXM1、P21蛋白表達顯升高，PCNA表達顯著降低(P<0.05)。

圖3 miR-149-3p與FOXM1的靶向關系驗證結果Fig.3 Verification results of targeting relationship between miR-149-3p and FOXM1Note: A.Image of complementary base pairing； B.Test result of luciferase activity.Compared with negative control group, **.P<0.01.

圖4 細胞增殖及相關增殖蛋白檢測結果Fig.4 Test results of cell proliferation and related prolifer-ation proteinsNote: A.Cells proliferation；B.Expression of proliferation-related proteins.Compared with blank control group，**.P<0.01；compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

2.5細胞侵襲實驗檢測結果 由圖5可知，相比空白對照組，miR-149-3p mimic組單位面積細胞侵襲數目顯著降低(P<0.05)，pLV-FOXM1組單位面積細胞侵襲數目顯著升高(P<0.05)；相比pL-VFOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組單位面積細胞侵襲數目顯著降低(P<0.05)。

圖5 細胞侵襲實驗檢測結果Fig.5 Test results of cell invasion experimentsNote: Compared with blank control group **.P<0.01;compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

圖6 細胞遷移檢測結果Fig.6 Test results of cell migrationNote: Compared with blank control group **.P<0.01.Compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

圖7 細胞侵襲、遷移相關蛋白檢測結果Fig.7 Test results of cell invasion and migration related proteinsNote: Compared with blank control group **.P<0.01;compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

2.6細胞遷移檢測結果 由圖6可知，相比空白對照組，miR-149-3p mimic組細胞遷移水平顯著降低，pLV-FOXM1組細胞遷移水平顯著升高(P<0.05)；相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組細胞遷移水平顯著降低(P<0.05)。

2.7細胞侵襲、遷移相關蛋白檢測結果 由圖7可以看出，相比空白對照組，miR-149-3p mimic組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；相比空白對照組，pLV-FOXM1組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平顯著升高，E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

3 討論

細胞的增殖和分化受到相關的蛋白調控，目前研究較多的調控細胞增殖的蛋白包括：增殖細胞核抗原(PCNA)和細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族成員P21和FOXM1。Boehm等[7]研究表明PNCA是細胞增殖分化的重要蛋白之一。牛建新等[8]研究表明PNCA指數越高，細胞的分裂增殖越快，最終會讓細胞獲得無限增殖的能力并使細胞在形態和結構機能上改變，達到促進細胞增殖的效果。P21是細胞周期調節蛋白[9,10]，能夠將細胞阻滯在G1期，促進輕度損傷的DNA自我修復，或者促進重度難以修復的DNA進入凋亡，防止細胞發生異常突變。FOXM1是叉頭框(forkhead box，Fox)蛋白家族成員之一[11]。FOXM1主要依靠調控細胞增生和有絲分裂調控腫瘤細胞的增殖。FOXM1普遍表達于所有的胚胎組織中，但在成年人中它只在增殖活躍的細胞中表達，例如腫瘤細胞[12]。本研究發現，相比空白對照組，miR-149-3p mimic組FOXM1、P21蛋白表達顯著升高，PCNA表達顯著降低，說明過表達的miR-149-3p可以顯著降低胃癌細胞的增殖和生長。相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組FOXM1、P21蛋白表達顯升高，PCNA表達顯著降低，說明miR-149-3p可以靶向結合pLV-FOXM1使得增殖相關的蛋白表達降低，有效抑制胃癌細胞的增殖。

細胞的侵襲和遷移受到上皮間質轉化(epithe-lial mesenchyml transition，EMT)的調節[13]。EMT是指上皮細胞能暫時喪失細胞極性獲得間質細胞移動能力。腫瘤細胞能夠通過細胞極性喪失，改變自身細胞形態與其他細胞分離[14,15]；同時通過下調細胞黏附因子E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)的表達[16]，將角蛋白細胞骨架變為波形細胞骨架，促進細胞穿透胞間連接，增強細胞的侵襲能力[17]。腫瘤細胞侵襲、遷移過程中，需要水解腫瘤細胞外基質蛋白，腫瘤細胞跨越基底膜屏障進入循環系統，才能向遠處轉移。基質金屬蛋白酶(matrix metallo protien-ase，MMPs)是一種能降解細胞外基質，預防腫瘤細胞侵襲轉移的一種金屬離子蛋白水解酶[18]，其中比較常見的為：MMP-2、MMP-9，這兩種蛋白可以降解細胞外基質結構蛋白，使得卵巢癌細胞的侵襲及轉移受到抑制；本實驗結果顯示，相比空白對照組，miR-149-3p mimic組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，說明miR-149-3p的表達可以影響細胞侵襲遷移相關蛋白的表達從而影響細胞的侵襲和遷移。相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，說明miR-149-3p可以靶向結合pLV-FOXM1。本實驗證明miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細胞SGC-7901侵襲和遷移。葉小娟等[19]研究表明RNA-320a 通過靶向 FOXM1調控肝癌細胞遷移，與本研究得出的結論相類似。

綜上所述，miR-149-3p可以靶向FOXM1抑制人胃癌細胞SGC-7901生長侵襲和遷移，其機制與調控細胞生長侵襲和遷移的蛋白有關。但調控胃癌細胞SGC-7901生長侵襲和遷移的信號通路較多，在后續的實驗中可以進一步探討miR-149-3p靶向作用FOXM1對胃癌細胞SGC-7901生長侵襲和遷移信號通路的影響。