外泌體在白血病發(fā)生發(fā)展及治療中的作用①

龍麗娟 李 衛(wèi)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣西 530021)

白血病是一類起源于造血器官的克隆性惡性疾病。根據(jù)FAB分型標(biāo)準(zhǔn)，將白血病分為：急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、慢性粒細(xì)胞白血病(chronic granulocytic leukemia，CML)四類。據(jù)統(tǒng)計，2014年白血病在我國男性和女性中發(fā)病率分別為5.69/10萬、4.40/10萬，在0～35歲男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中占據(jù)首位[1]。目前的治療方法除了傳統(tǒng)的化療、放療、造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)外，還出現(xiàn)針對白細(xì)胞不同靶點(diǎn)的多肽、抗體、小分子藥物的靶向治療。隨著治療方法的發(fā)展，完全緩解(complete remission，CR)率得到提高，聯(lián)合化療后AML的CR率可達(dá)50%～80%，ALL可獲得90% CR率。達(dá)CR的患者，AML有50%～80%的復(fù)發(fā)率，ALL亦有很高的復(fù)發(fā)率。近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在白血病的發(fā)生發(fā)展和耐藥等過程中發(fā)揮重要的作用，同時也可為免疫治療方案改進(jìn)提供新思路。

1 外泌體的發(fā)生發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)80年代，外泌體首次發(fā)展于網(wǎng)織紅細(xì)胞中，1987年Johnstone等[2]將其命名為“exosomes”。外泌體是大小為30～150 nm的脂質(zhì)雙層膜封閉的囊泡。在外泌體形成的過程中，細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成內(nèi)體，在轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合體(the endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)、液泡蛋白分選因子4 ( vacuolar protein sorting 4,Vps4 )、凋亡相關(guān)基因-2受體蛋白 X(ALG-2-interacting protein X，ALIX)、人腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG101)等的參與下，將帶有泛素化的“貨物(cargo)”分選入內(nèi)陷空泡發(fā)育成多囊泡體，然后經(jīng)Rab蛋白、膜聯(lián)蛋白(annexins)、脂閥結(jié)構(gòu)蛋白(flotillin)作用，內(nèi)體膜與質(zhì)膜融合，通過胞吐作用釋放外泌體。外泌體可由多種細(xì)胞分泌，并分布在各種體液中，包括血液、尿液、唾液、母乳、腦脊液等[3]，其攜帶親本細(xì)胞蛋白質(zhì)、代謝物、RNAs (mRNA、miRNA、lncRNA)、DNAs (mtDNA、ssDNA、dsDNA)和脂質(zhì)等在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要作用。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊不僅參與正常生理過程的調(diào)節(jié)，也參與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的病理過程[4]。

2 外泌體在白血病發(fā)生發(fā)展過程中的作用

2.1白血病細(xì)胞通過外泌體重編程BM微環(huán)境 骨髓(bone marrow，BM)微環(huán)境是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)賴以生存的基礎(chǔ)，與造血調(diào)控緊密相關(guān),而腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可通過傳遞其攜帶的內(nèi)容物重編程BM微環(huán)境[5]。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性AML和AML細(xì)胞系均釋放顯著高于正常對照細(xì)胞的外泌體。這些外泌體富集了與AML發(fā)病相關(guān)的幾種RNA，包括GATA1、FOXP3、SHIP1、ID1、E2F1、CEBP-a、CEBP-b、Myc和MEF2C，它們可被骨髓基質(zhì)細(xì)胞攝取從而改變骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長因子的分泌[6]。El-Saghir等[7]通過將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stroma stem cells，BMSCs)與HuT-102(人T淋巴瘤細(xì)胞系)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HuT-102衍生的外泌體能夠?qū)ax mRNA轉(zhuǎn)移至受體MSC，進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-κB活化，導(dǎo)致它們喪失其干細(xì)胞特性，轉(zhuǎn)成可能支持白血病進(jìn)展的促遷移和血管生成的表型。

Kumar等[8]從 AML細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液提取外泌體，與B6小鼠新鮮分離的BM共孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體主要被BM基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化。骨髓Sca1+和CD146+基質(zhì)細(xì)胞顯著增加，CD166+細(xì)胞顯著減少；調(diào)節(jié)正常造血功能的基因(IGF1、CXCL12、KITL和IL-7)或與骨發(fā)育有關(guān)的基因(IGF-1、OCN和Col1A1)下調(diào)，而正常造血和成骨細(xì)胞發(fā)育的抑制因子(DKK1)上調(diào)。結(jié)果表明白血病發(fā)病過程中，AML細(xì)胞逐漸占據(jù)并可能改變正常的BM微環(huán)境，將正常的造血生態(tài)位轉(zhuǎn)變?yōu)椤鞍籽∩鷳B(tài)位”，使白血病細(xì)胞生長變得容許，而破壞正常的造血功能。

Corrado等[9]發(fā)現(xiàn)，用LAMA84 CML細(xì)胞釋放外泌體處理HS5 BM基質(zhì)細(xì)胞，可使其IL-8表達(dá)增加。IL-8作為一種激活趨化因子，其激活兩種受體(CXCR1和CXCR2)下游的多種信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)CML細(xì)胞的黏附和遷移。

2.2白血病外泌體直接靶向HSC 正常造血需要BM微環(huán)境及HSC之間復(fù)雜的雙向相互作用。Hornick等[10]發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)的AML細(xì)胞分離的外泌體和移植AML細(xì)胞的小鼠的血漿均富集miR-150和miR-155。以AML衍生的外泌體處理HSC，導(dǎo)致c-MYB在HSC中表達(dá)下降。而c-Myb-/-鼠表現(xiàn)出與AML衍生的外泌體處理的HSPC中觀察到的相似的造血損傷。鑒于c-MYB基因產(chǎn)物是造血所需的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，考慮白血病外泌體通過將miRNA平行轉(zhuǎn)移至HSC，靶向c-MYB而破壞正常造血功能。

2.3白血病外泌體對免疫功能的調(diào)節(jié)作用 腫瘤細(xì)胞來源的外泌體(tumor cell derived exosomes，TEX)對免疫細(xì)胞的作用是雙向的，可對免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制或刺激作用。然而，腫瘤微環(huán)境中TEX與免疫細(xì)胞相互作用的總體效果是免疫抑制[11]。TEX含有可通過不同機(jī)制誘導(dǎo)免疫細(xì)胞功能障礙的分子，包括核酸、蛋白和細(xì)胞因子，向免疫細(xì)胞傳遞致耐受性信號。

白血病細(xì)胞來源的外泌體(leukemia cell derived exosomes，LEX)通過干擾NK細(xì)胞的活化來影響免疫功能。NK細(xì)胞是固有免疫的主要參與者之一，在免疫監(jiān)視中起重要作用。Szczepanski等[12]通過檢測19個AML患者及14個健康對照的血清外泌體，發(fā)現(xiàn)AML患者血清中外泌體含量高于對照組，除了傳統(tǒng)的外泌體標(biāo)記,它們含有TGF-β1、MICA/MICB和髓系母細(xì)胞標(biāo)記、CD34、CD33和CD117。這些外泌體下調(diào)NKG2D表達(dá)，干擾NK細(xì)胞活化，導(dǎo)致其殺傷腫瘤細(xì)胞毒性下降。NK細(xì)胞細(xì)胞毒性還與BAG6有關(guān)，BAG6呈遞在外泌體表面上時，NK細(xì)胞被激活。血漿游離BAG6則下調(diào)NK細(xì)胞上的表面受體CD16和CD56，起抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。Reiners等[13]發(fā)現(xiàn)在晚期疾病階段中，可溶性BAG6具有最高水平，抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤免疫。

LEX誘導(dǎo)活化的CD8+T細(xì)胞凋亡。TEX攜帶來自親本細(xì)胞的加載了腫瘤抗原肽的MHC-Ⅰ分子，能夠激活CD4+T細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，輔助CD8+細(xì)胞活化，協(xié)助NK細(xì)胞清除和殺滅腫瘤，也可以通過轉(zhuǎn)移免疫抑制因子、傳遞免疫耐受信號，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖分化介導(dǎo)免疫逃逸。研究顯示，AML患者的血清中外泌體濃度高于健康對照，與活化的CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，可下調(diào)CD3-zeta、JAK3表達(dá)，導(dǎo)致激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不足。LEX還通過其攜帶的FasL，與CD8+細(xì)胞表面Fas(CD94)結(jié)合，激活內(nèi)源性Fas/FasL途徑，導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡。此外，TEXs攜帶 TGF-β和IL-10，促進(jìn)Treg增殖，而Treg完全抵抗TEX介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。

LEX協(xié)助將腫瘤患者單核細(xì)胞重編程為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)，即免疫抑制表型。這導(dǎo)致單核細(xì)胞募集到腫瘤組織中，在那里它們支持腫瘤起始，促進(jìn)局部進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Haderk等[15]發(fā)現(xiàn)，CLL衍生的外泌體將hY4轉(zhuǎn)移至單核細(xì)胞，將單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為TAM，其分泌細(xì)胞因子如CCL2、CCL4、IL-6、PD-L1，導(dǎo)致免疫逃逸。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs) 具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以及誘導(dǎo)免疫耐受的能力。而DCs發(fā)揮免疫刺激亦或是免疫抑制的功能在很大程度上與其是否成熟有關(guān)。成熟的DCs可介導(dǎo)抗腫瘤免疫，而未成熟的樹突狀細(xì)胞可致免疫耐受。LEX對于DCs功能影響的研究，主要在免疫刺激方面作用。Shen等[16]發(fā)現(xiàn)NB4細(xì)胞系衍生的外泌體表達(dá)蛋白質(zhì)視黃酸受體α和間質(zhì)細(xì)胞黏附分子1，并含有熱休克蛋白70。細(xì)胞毒性測定提示，用外泌體脈沖的DCs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在殺滅靶NB4細(xì)胞方面優(yōu)于單獨(dú)用DCs誘導(dǎo)的CTL。

3 白血病細(xì)胞外泌體對白血病治療預(yù)后的影響

獲得性腫瘤細(xì)胞化療抗性是治療血液惡性腫瘤的主要障礙。近年來，隨著免疫治療的發(fā)展，在各種已知的耐藥機(jī)制中，TEX因其在腫瘤細(xì)胞之間水平轉(zhuǎn)移藥物抗性的能力而受到特別關(guān)注。凋亡調(diào)節(jié)蛋白(BCL-2、MCL-1、BCL-X和BAX)在AML細(xì)胞中的表達(dá)與無病存活相關(guān)[17]。實(shí)驗(yàn)證明，抗凋亡的AML細(xì)胞影響其鄰近治療敏感細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。表現(xiàn)為凋亡敏感細(xì)胞的抗凋亡蛋白譜上調(diào)，如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制因子1(CIAPIN1)，STAM結(jié)合蛋白(STAMBP)和HMGB1，而這些負(fù)調(diào)節(jié)因子保護(hù)白血病細(xì)胞免受藥物誘導(dǎo)的死亡。Galectin-3與惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。原發(fā)性人前B細(xì)胞 ALL中，MSC表達(dá)Galectin-3升高，并由通過外泌體將其傳遞至ALL細(xì)胞，支持腫瘤細(xì)胞存活，通過參與耐藥形成而影響白血病治療效果[18]。

LEX干擾過繼免疫細(xì)胞療法。Hong等[19]發(fā)現(xiàn)從接受NK-92細(xì)胞治療前的AML患者血漿中分離出來的外泌體，通過向受體細(xì)胞遞送免疫抑制性內(nèi)容物，如TGF-β1/LAP、CD39/CD73胞外酶、PD1/PD-L1或Fas/FasL，阻斷了NK-92細(xì)胞的抗白血病細(xì)胞毒性。

LEX在白血病的復(fù)發(fā)中也起到一定作用。目前急性白血病聯(lián)合化療、HCST等治療后無病生存率可達(dá)25%～40%，約有一半以上患者存在治療緩解后復(fù)發(fā)。白血病的復(fù)發(fā)主要來源于體內(nèi)殘留白血病細(xì)胞，殘留白血病細(xì)胞誘導(dǎo)的正常造血移植物的惡性轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是供體細(xì)胞白血病(donor cell leukemia，DCL)的關(guān)鍵機(jī)制。Zhu等[20]提取源自K562細(xì)胞(人類慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞系)的含有BCR-ABL1 mRNA的微泡并用其處理單核細(xì)胞。在與BCR-ABL1陽性微泡孵育后，源自正常移植的單核細(xì)胞在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出白血病樣惡性表型。

4 外泌體在白血病治療和監(jiān)測中的作用

4.1監(jiān)測白血病復(fù)發(fā)、耐藥的生物標(biāo)志物 經(jīng)過誘導(dǎo)緩解治療達(dá)CR后(包括骨髓移植治療后)患者體內(nèi)仍會殘留109以下白血病細(xì)胞,這些細(xì)胞用常規(guī)顯微鏡是檢測不到的,而多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MPFC)監(jiān)測微小殘留病(MRD)依賴于腫瘤細(xì)胞異常的免疫表型，包括交叉抗原表達(dá)、抗原表達(dá)不同步、抗原表達(dá)水平的升高或降低，且治療中可能存在免疫表型的變化，因而在實(shí)際應(yīng)用中存在一定局限性。聚合酶聯(lián)反應(yīng)也因白血病治療過程中克隆演變，確定重排點(diǎn)耗時而使用受限。外泌體攜帶來自親本細(xì)胞的核酸、蛋白、脂質(zhì)、代謝物等，代表了親本細(xì)胞的生物學(xué)行為。與正常細(xì)胞衍生的外泌體相比，AML衍生的外泌體含有不同的蛋白質(zhì)譜，如TGF-β1，MICA/MICB和骨髓原始標(biāo)記物，CD34和CD117 ，耐藥AML來源外泌體高度富集Bcl-2家族成員，監(jiān)測患者外泌體變化情況可反應(yīng)白血病復(fù)發(fā)與耐藥狀態(tài)[21]。

4.2免疫治療 化療和HSCT后微小殘留白血病細(xì)胞(minimal residual leukemia cells，MRLs)是白血病復(fù)發(fā)的主要原因。免疫療法可作為消除化療和移植后MRLs的方法，以減少和預(yù)防白血病復(fù)發(fā)。TEX攜帶親本細(xì)胞腫瘤抗原，而DC作為最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，可攝取、加工、遞呈抗原，激活Th、Tc、NK細(xì)胞，觸發(fā)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。Yao 等[22]發(fā)現(xiàn)K562白血病細(xì)胞衍生的外泌體攜帶細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和免疫相關(guān)分子(HSP70)，LEXs脈沖的DC比LEXs和非脈沖DCs更有效地誘導(dǎo)抗白血病細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。因TGF-β1存在，TEX免疫原性降低，Huang等[23]的試驗(yàn)表明，沉默TGF-β1的白血病細(xì)胞外泌體，較之于未沉默TGF-β1外泌體，有更好的誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫的潛能。

4.3藥物載體 腫瘤基因治療需要向腫瘤細(xì)胞遞送DNA、RNA或類寡核苷酸分子等，而這些物質(zhì)在體內(nèi)很容易被核酸酶破壞或降解，因而需要研發(fā)更高效安全的基因遞送載體。外泌體由脂質(zhì)雙分子層膜包裹，可保護(hù)核酸、蛋白因子免受破壞降解，并遞送至靶細(xì)胞[24]。TEX還可攜帶化療藥物，更高效的靶向腫瘤細(xì)胞。與正常造血細(xì)胞相比，IL3-R在CML細(xì)胞中過表達(dá)，能夠在抗癌藥物遞送中充當(dāng)受體靶標(biāo)。Bellavia等[25]用HEK293T細(xì)胞來表達(dá)與IL-3片段融合的外泌體蛋白Lamp2b，荷載伊馬替尼的IL3-Lamp2b外泌體能夠靶向CML細(xì)胞并抑制體外和體內(nèi)癌細(xì)胞生長。

外泌體自發(fā)現(xiàn)至今，因其眾多的生物學(xué)功能及作為新興的腫瘤標(biāo)記物引起了廣泛的興趣。其獨(dú)特的分子和遺傳特征，改變各種正常和惡性受體細(xì)胞功能的能力表明外泌體在健康和疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在白血病中，LEX似乎涉及惡性轉(zhuǎn)化的所有方面，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和抗性，抑制抗腫瘤免疫。LEX作為腫瘤標(biāo)記物提示治療的反應(yīng)的潛力和LEX在免疫療法中的作用得到更深的探究。進(jìn)一步關(guān)于LEX的研究，將致力于白血病細(xì)胞如何通過LEX促進(jìn)自身生長和進(jìn)展的機(jī)制的探索，以及如何改進(jìn)其在免疫治療中的作用。