不同強化類型的好氧顆粒污泥結構特性

梁梓軒，涂倩倩，蘇曉軒，楊祥宇，陳俊宇，陳一，李宏，劉彩虹，何強

(重慶大學 三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400044)

近20年來，學者們對污水處理中的好氧顆粒污泥技術進行了大量研究[1-2]。相比傳統絮體活性污泥，好氧顆粒污泥具有更多的優質特性，但是，其在實際污水處理中的應用較少，且大多為小規模(<1萬m3/d)[3]。制約好氧顆粒污泥技術推廣應用的主要原因有兩點：一是其啟動周期(顆粒形成過程)耗時太長，通常小試規模為1個月左右，有的中試或實際廢水的啟動期會耗時100余天[4]；二是在長期運行中顆粒可能會由于水力剪切沖刷或水解而解體[5]。

目前，加速好氧顆粒污泥形成的研究主要為控制水力條件和有機負荷兩方面，而對提高好氧顆粒污泥結構穩定性的研究較少。在早期研究中，很多學者已經證實控制反應器高徑比(H/D)在15～30之間可使好氧顆粒污泥的形成加快至1個月以內[6]。控制曝氣量使表觀氣速為1.5～2.0 cm/s，可讓微生物獲得足夠的剪切力進行聚集絮凝，同時，又保證形成的顆粒不會承受強烈沖刷而解體[7]。當有機負荷大于6.0 kg/m3d時，好氧顆粒污泥能夠更快速地形成，同時擁有更大粒徑，并出現不同溶解氧(DO)功能分區[8]，并且，增加N/C比能夠提升顆粒中AOB、NOB等長世代周期的自養菌豐度，從而使得形成的顆粒更加密實，沉降性能更好[9]。

但在實際工程應用中，由于建造原因，通常反應器的高徑比不會太大。同時，有機負荷、N/C比等均由進水水質決定，難以實時調控。因此，需要研究出更加方便可行的方法以加速顆粒形成和提高其結構穩定性。目前，已經有部分研究從投加絮凝劑或惰性載體(凝聚劑)入手，其有效性已經得到證實[10-11]，但大多數研究還停留在形成過程、污染物去除等方面，對好氧顆粒污泥結構特性的研究還尚為缺乏。本研究以投加聚合氯化鋁(PAC)、微生物絮凝劑(MBF)、顆粒活性炭(GAC)為強化方法，主要從胞外聚合物分布、DO梯度分布、抗剪切沖刷能力、抗水解酶能力等方面詳細研究了不同強化型好氧顆粒污泥的結構特性，對比分析了不同強化方法的優缺點，從而為在實際運行中選擇更高效、更便捷的強化方法提供了理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 反應器運行

實驗共設置4組內徑為7 cm、有效水深為105 cm的柱狀SBR反應器。每組反應器有效容積為4 L。反應器按6 h周期運行，其中，進水、沉淀、排水時間均為5 min，其余時間曝氣，控制曝氣量使得表觀氣速為1.5 cm/s，不設置缺/厭氧期。排水口在底部以上52.5 cm處，換水比為50%。反應器處于恒溫室內，溫度恒定為25 ℃。

接種的絮體活性污泥取自城市污水處理廠，用0.2 mm的篩網過濾后接種至反應器，接種后反應器內污泥濃度MLSS=3 500 mg/L。進水為人工配水，進水水質為(每升)：500 mg 乙酸鈉、153 mg NH4Cl、35 mg KH2PO4、30 mg CaCl2、20 mg MgCl2、10 mg FeSO4、1 mL微量元素溶液。微量元素溶液(每升)組分: 0.05 g H3BO3、0.05 g ZnCl2、0.03 g CuCl2、0.05 g MnSO4·H2O·(NH4)6、0.05 g Mo7O24·4H2O、0.05 g AlCl3、0.05 g CoCl2·6H2O、0.05 g NiCl2。

1.2 PAC、MBF、GAC的投加方式

根據實驗的前期預實驗結果與相關參考文獻[10-15]，確定了PAC、MBF、GAC 3種凝聚劑的最佳投加方式。

1)市售30%(w/w)的PAC粉劑配置成33.33 g/L的PAC溶液，每個周期進水時同步投加50 mL PAC溶液，45 d后停止投加。

2)MBF提取自前述污水處理廠的濃縮污泥，提取方法：將TSS=10 g/L的濃縮污泥在-20 ℃和37 ℃條件下反復凍融3次(單次冷凍或融解的作用時間均為12 h)。然后，將100 mL混合液進行超聲細胞破碎(SCIENTZ-II D)，破碎時間2 min，脈沖4 s，功率密度60%。破碎后的混合液在4 ℃，10 000g條件下高速離心20 min，上清液為MBF溶液[13]。每個周期進水時同步投加50 mL MBF溶液，45 d后停止投加。

3)GAC的制備與投加方法：將市售的椰殼活性炭高速破碎后，用篩網篩選出粒徑為0.15～0.25 mm的顆粒活性炭。在接種絮體活性污泥時一次性投加，使得反應器內GAC濃度為3 500 mg/L，后續不再補加。

1.3 EPS熒光原位染色

用0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)將顆粒清洗3次后加入100 μL 0.1 mol/L NaHCO3，然后，用異硫氰酸熒光素(FITC)、刀豆蛋白(Con A)、卡爾科弗盧爾熒光增白劑(calcofluor white)和尼羅紅(Nile Red)分別對蛋白質、α多糖、β多糖和脂類進行染色[16]。在上述每次染色后，均用PBS清洗樣品兩次，以除去多余的染色劑。將染色后的顆粒在-20 ℃下冷凍切割成60 μm切片，最后，用CLSM(Leica TCS SP2)掃描沿粒徑方向熒光強度。

1.4 掃描電鏡

用PBS將顆粒清洗3次后，用2.5%戊二醛固定2 h。然后，分別用50%、75%、90%、100%的乙醇初脫水，再分別用50%、75%、90%、100%的叔丁醇深脫水(單種濃度脫水時長均為5 min)。干燥噴金后進行SEM(Hitachi S-3 400N)觀察。

1.5 抗剪切強度

顆粒實際抗剪強度沒有統一標準，有研究在厭氧顆粒污泥中采用相對抗剪切強度完整度系數ICs表征[17]。本實驗中作部分修改，具體測定方法為：用0.1 mol/L PBS清洗顆粒(100 mL)3次后定容至100 mL。然后將其置于37 ℃、200 rpm的搖床中振蕩30 min。振蕩停止沉淀10 s后迅速吸取并測定上清液和沉淀部分的SS，分別記為SS1和SS2。完整度系數(Integrity coefficients, ICs)ICs= SS2/ (SS1+SS2)。

1.6 抗水解強度

用PBS清洗3次后的顆粒分別單獨加入2 350 U/μL 蛋白酶K、205 U/μL α淀粉酶、5.13 U/μL β淀粉酶、3.14 U/μL 脂肪酶，并在37 ℃、150 rpm條件下振蕩60 min。振蕩停止后，沉淀10 s迅速吸取并測定上清液和沉淀部分的SS，分別記為SS3和SS4。抗水解強度系數(Anti- hydrolase coefficients, AHCs)AHCs= SS4/ (SS3+SS4)。

1.7 其它儀器與試劑

TSS、MLSS等常規指標的測定參考《水和廢水監測分析方法(第四版)》。顆粒粒徑測定和顯微觀察均使用光學顯微鏡Motic BA310。顆粒內部溶解氧DO分布用微電極(Unisense)測定，梯度選取為40 μm，測定時預曝氣控制液相DO=6.0 mg/L。PBS緩沖液組分(mmol/L)：NaCl=137，KCl=2.7，Na2HPO4=10，KH2PO4=2。

2 結果與討論

2.1 好氧顆粒污泥的形態學特性

研究通過不同強化方法均成功培養出了好氧顆粒污泥(如圖1所示)。對照組、PAC組、MBF組、GAC組好氧顆粒污泥的初形成(粒徑>0.2 mm)時間分別為第42天、第30天、第8天、第28天。顆粒成熟(粒徑及各項指標基本穩定)時間分別為第 52天、 第39天、第 22 天、第38天。成熟后的4種好氧顆粒污泥平均粒徑均在1.2～1.8 mm之間，組間無顯著差異。實驗結果表明：PAC、MBF、GAC對好氧顆粒污泥的形成有促進作用，且PAC的促進作用最為顯著。

圖1 4種不同好氧顆粒污泥的光學顯微觀察和掃描電鏡SEM的表面結構Fig.1 Optical microscopic observation of four different aerobic granular sludges and surface structure

從圖1可以看出，4種好氧顆粒污泥的形態特征在光學顯微鏡下沒有明顯區別，均為類球形結構，且表面沒有絲狀菌纏繞。已有研究表明，以乙酸鈉為底物培養的好氧顆粒污泥通常不會觀察到有絲狀菌生長[18-19]。但4種好氧顆粒污泥的SEM結果卻顯著不同，其中,對照組和MBF組的顆粒外層為網狀結構，表面粗糙多孔，較為蓬松。PAC強化型好氧顆粒污泥表面呈層狀花椰菜結構，沒有蓬松網狀結構，且層狀之間排布緊密。GAC強化型好氧顆粒污泥表面整齊排布著球菌、桿菌，沒有網狀、層狀結構，表層光滑致密。

MBF組和對照組表現出相同的表面結構，表明微生物絮凝劑中提取的有效成分(胞內外蛋白和多糖)[13]，主要作用是增加了好氧顆粒污泥形成過程中必要的胞外聚合物的含量，但沒有改變顆粒化的機理(胞外聚合物假說)。而PAC組和GAC組的表面特性和對照組相比已有顯著改變，且這兩類好氧顆粒污泥之間的表面特性也完全不同。具體的顆粒化機理在后文結合EPS熒光原位染色和結構穩定性一并詳細討論。

2.2 EPS主要組分分布

EPS熒光原位染色結果如圖2所示，CLSM掃描結果表征了蛋白質、α多糖、β多糖、脂肪在4種好氧顆粒污泥內部沿半徑方向的分布。其中，α多糖和脂肪兩種EPS組分在4種顆粒內部的分布規律一致，都分布在顆粒外層。

蛋白質在對照組和MBF組的顆粒內部均勻分布；PAC強化型顆粒外層(0～200 μm)的蛋白質染色劑熒光強度為對照組的2.5倍，內部(300～600 μm)熒光強度與對照組一致；GAC強化型顆粒外層(0～150 μm)的蛋白質染色劑強度與對照組一致，中部(200～400 μm)的熒光強度約為對照組的2倍，由于內部(500～600 μm)為顆粒活性炭，熒光強度基本為零。

β多糖在對照組和MBF組的顆粒內部均勻分布；PAC強化型顆粒外層(0～200 μm)的β多糖染色劑熒光強度為對照組的1/3，內部(300～600 μm)熒光強度與對照組一致；GAC強化型顆粒外部(0～400 μm)β多糖染色劑熒光強度與對照組一致，由于內部(500～600 μm)為顆粒活性炭，熒光強度基本為零。

EPS熒光原位染色的結果與SEM結果相印證：MBF不改變顆粒化機理，成熟的好氧顆粒污泥結構與對照組類似；而PAC組中加入了高分子絮凝劑，起到了吸附架橋和電中和作用，改變了好氧顆粒污泥內部結構，形成了“蛋白外殼-β多糖內核”的雙層結構。外層蛋白質含有大量疏水基團，能夠抵抗氣-水剪切力和增加細胞疏水性[20-21]，而內層的β多糖有助于微生物間粘附，維持顆粒結構穩定[22]；GAC組的顆粒污泥內部僅蛋白質的分布發生了顯著改變，高濃度的蛋白質將顆粒活性炭包裹，推測是微生物為了附著在顆粒活性炭上而分泌了更多的蛋白質，降低微生物聚集體的表面電荷、增加疏水性，最終聚集吸附在GAC上生長[23]。α多糖和脂肪主要由活細胞分泌[24]，二者的分布規律表明，4種顆粒污泥主要活性微生物均分布在顆粒外層(0～300 μm)。

圖2 4種好氧顆粒污泥EPS主要組分的內部分布Fig.2 The distribution of EPS main components of the four kinds of aerobic granular

2.3 溶解氧分布

溶解氧在4種不同好氧顆粒污泥中的分布如圖3所示,蛋白質、α多糖、β多糖、脂肪熒光染色強度沿半徑方向分布，篩選用于分析檢測的顆粒直徑均為1.2 mm。從圖中可知，4種顆粒徑向溶解氧開始消耗(<5.5 mg/L)的順序為：對照組(-300 μm)、MBF組(-250 μm)、PAC組(-100 μm)、GAC組(-50 μm)，徑向溶解氧消耗殆盡(<0.1 mg/L)的順序為：PAC組(150 μm)、GAC組(250 μm)、MBF組(300 μm)、對照組(350 μm)。

圖3 4種好氧顆粒污泥在測定梯度為40 μm的溶解氧分布Fig.3 Dissolved oxygen distribution of four aerobic granular sludges with a gradient of 40

DO外部變化：對照組和MBF溶解氧的開始消耗大幅度提前于0 μm，表明這兩組好氧顆粒污泥表面的結構松散，與液相有一段過渡區，過渡區內可進行物質傳輸、交換，但松散的結構不利于抵抗外界沖擊負荷，且可能發生微生物游離[25]。PAC組和GAC組的過渡區僅50～100 μm，表明這兩類顆粒結構致密，微生物緊密附著生長，能夠良好抵抗外界沖擊。過渡區形態也能從前述的SEM結果看出，對照組和MBF組的表面存在網狀結構，沒有清晰的固液界面，而PAC組和GAC組界面輪廓清晰分明。

DO內部變化：從徑向溶解氧消耗殆盡的順序可知，4種好氧顆粒污泥內部結構從緊密到疏松的順序為 PAC組>GAC組>MBF組>對照組。值得特別注意的是，PAC組外層結構比GAC組疏松，但內部結構PAC組更加致密。結合EPS熒光染色結果分析，這與蛋白質的分布有關。PAC強化型好氧顆粒污泥的蛋白質在外部0～200 μm段有高密度分布，GAC強化型顆粒的蛋白質在中部200～400 μm段高密度分布。故推測高密度的蛋白質會使得好氧顆粒污泥結構更加致密，阻擋了DO進一步向內傳輸，而對照組和MBF組的顆粒污泥蛋白質在整個切片斷面上都是中密度分布，因此，DO能更加深入地向內傳輸。

2.4 結構強度

主要從抗剪強度和抗水解強度兩方面研究了4種好氧顆粒污泥的結構強度。由于絕對強度難以測定，且沒有統一標準方法，故用相對值表征[17]，結果分別為完整度系數ICs(表1)和抗水解酶系數AHCs(圖4)。

表1 4種不同好氧顆粒污泥的完整度系數ICs(相對抗剪強度)Table 1 Integrity coefficients ICs (relative shear strength) of four different aerobic granular sludges

表1表明，4種好氧顆粒污泥承受水力剪切力的能力從強到弱依次為PAC組≈GAC組>MBF組>對照組。ICs的結果表明，無論是投加絮凝劑還是載體物質，都能顯著提升好氧顆粒污泥的抗剪強度。其中，由于PAC和GAC能顯著改變好氧顆粒污泥的外表面結構，使得表層微生物附著、排布更加致密，從而相比于MBF更能提升顆粒抵抗水力沖刷的能力。實際運行中，可能由于操作調控不及時，導致曝氣量與水量不匹配，進一步使得反應器內曝氣不均勻，氣水紊流程度加劇，最終造成顆粒污泥解體、出水惡化[5]。但是，使用強化型好氧顆粒污泥可有效改善此類問題的不利后果。

圖4 相對抗水解強度AHCsFig.4 Relative anti hydrolysis resistance

從圖4可以看出，當蛋白質被水解后，PAC組和GAC組的AHCs值在85%～90%范圍內，表明這兩組的顆粒均發生輕微解體，而對照組和MBF組的顆粒未發生解體現象。當β多糖被水解后，4種顆粒污泥都發生不同程度的解體，抗β多糖水解酶能力的順序依次為：PAC組>GAC組>MBF組>對照組。

2.5 4種好氧顆粒污泥形成機理討論

已有研究證實，EPS中的β多糖具有膠狀黏性特征，是維系好氧顆粒污泥結構完整性的主要物質，而非傳統生物學觀點認為的蛋白質[22]。許多研究用β淀粉酶對普通好氧顆粒污泥作用后均觀察和檢測到了顆粒的破碎和解體，在本實驗中也有同樣結論。但是，從AHCs結果中可以看出，4種好氧顆粒污泥水解程度顯著不同，對其原因推測如下。

由于PAC的加入，顆粒化機理發生改變，起決定性作用的是PAC的吸附架橋和電中和的雙重功效，故水解β多糖后顆粒僅輕微破碎。同時，由于PAC強化型顆粒形成了致密的蛋白外殼，也在一定程度上對顆粒結構有保護作用，因此，在水解蛋白質后PAC組的AHCs有輕微下降。同時，該組顆粒污泥形成了β多糖內核，其可能原因是由于PAC的加入，使得生物殘體、無機質等一系列物質，在膠狀β多糖和絮凝劑PAC雙重作用下形成了類似于惰性晶核載體物質，其具體作用機理需要進一步深入研究；投加MBF只是增加了微生物可利用的EPS中各種物質的種類和數量，沒有從根本上改變顆粒化機理，因此，水解β多糖顆粒破碎程度比較顯著，AHCs值下降明顯；而投加GAC，促使內層微生物分泌蛋白質附著在顆粒活性炭表面生長，從而改變了內部微生物聚集機理，內層結構穩定性不再由β多糖決定。而EPS熒光染色結果表明其顆粒外部組分與對照組無異，導致β多糖水解后，外層顆粒破碎解體，內層依舊維持一定的形態，所以，AHCs值下降程度顯著小于對照組。

對結果的分析討論表明，對照組和MBF組的顆粒污泥形成機理符合“EPS假說”，PAC組和GAC組的顆粒污泥的形成機理符合“晶核假說”[26]。但具體的微觀形成過程，以及微生物與微生物之間、微生物與載體之間的信號傳遞、相互作用等都還需要更進一步的深入研究。

3 結論

1)凝聚劑PAC、MBF、GAC均能加速好氧顆粒污泥的形成，其中，投加PAC效果最為顯著。

2)SEM結果顯示，對照組和MBF組好氧顆粒污泥表面呈網狀疏松結構，而PAC組和GAC組顆粒表面結構致密；EPS熒光原位染色表明，EPS主要組分蛋白和β多糖的分布在對照組和MBF組中一致，PAC強化型顆粒形成了“蛋白外殼-β多糖內核雙層構造”，GAC組顆粒內部有高密度蛋白包裹著顆粒活性炭。

3)溶解氧分布結果表明，PAC、GAC強化型顆粒污泥內部結構比對照組和MBF強化型更加致密。結構完整性實驗表明，PAC、MBF、GAC都可以顯著提升好氧顆粒污泥抗水力剪切能力，抗水解酶強弱順序依次為PAC組>GAC組>MBF組>對照組。