抗菌肽brevilaterin與食品防腐劑聯用對食源性致病菌的抑制

寧亞維，李文蕾，蘇丹，王志新，劉楊柳，賈英民*

1(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊，050018) 2(北京工商大學 食品與健康學院，北京，100048)

生物防腐劑因具有天然、高效、安全性高等優勢受到人們青睞[1]，它包括生物源抑菌物質及具有抑菌活性微生物防腐2種類型[2]。生物源抑菌物質主要包括動植物提取物[3-5]和微生物代謝產物[6]，抑菌性微生物主要是具有抑菌活性乳酸菌的開發[7]。微生物代謝產物由于制備周期短、產量高、成本低等優勢成為生物防腐劑開發的重點。乳酸菌代謝產物和芽孢桿菌代謝產物成為重點開發的生物防腐劑[8]。其中已經商品化生產的乳酸菌代謝產物nisin，由于抑菌活性高、安全性好等優點已經被工業化生產并應用。由于nisin主要對革蘭氏陽性菌抑菌效果好，對革蘭氏陰性菌基本不抑制，在食品防腐中的應用具有一定的局限性[9-10]。因此，開發具有廣譜抑菌活性的生物防腐劑或生物防腐劑配方具有重要的研究價值。

Brevilaterin是由BrevibacilluslaterosporusS62-9產生的一類具有抑菌活性的小肽，可以抑制金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種食源性致病菌的生長和繁殖[11-12]。Brevilaterin作為新型生物抑菌物質除具有安全性高、抑菌譜廣的優點外，還具有高度熱及pH值穩定性，在食品防腐中具有較高的工業化應用潛力。然而，brevilaterin對革蘭氏陽性菌抑菌效果好，對革蘭氏陰性菌抑菌效果較弱，在食品防腐中需要加大使用劑量才能實現廣譜抑菌(同時抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌)作用，導致使用成本較高。抑菌物質的聯合使用主要存在3種效應：協同、無關、拮抗[13]，其中抑菌物質間的協同作用可以降低單一抑菌物質的用量，提高抑菌效果[14-15]，因此可篩選與brevilaterin存在協同抑菌效應的防腐劑，通過復配降低添加劑用量，從而降低使用成本。

細菌性食源性疾病是食品安全的核心問題[16]，我國每年發生的細菌性食物中毒事件占食物中毒事件總數的30%～90%，因此，控制細菌性食源性疾病對于保障食品安全至關重要。據報道全世界引發食源性疾病的主要致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌和沙門氏菌[17]。因此，本研究以金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌作為革蘭氏陽性致病菌指示菌，以大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌作為革蘭氏陰性致病菌指示菌，首先篩選與brevilaterin具有協同抑菌作用的抑菌物質，然后考察復配組合中各抑菌物質的添加量，并通過時間殺菌曲線驗證殺菌效果，為抗菌肽復合食品防腐劑在食品防腐中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

StaphylococcusaureusATCC 25923、Listeriamonocytogenes10403s、EscherichiacoliATCC 44752、SalmonellaATCC 14028，河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏。抗菌肽brevilaterin(白色粉末，1 AU=1 μg/mL)為本實驗室制備[18]。丁香酚、肉桂醛、檸檬酸、ε-聚賴氨酸、茶多酚、魚精蛋白、EDTA-Na2、乳酸鏈球菌素(nisin)，上海麥克林生化科技有限公司；檸檬酸和磷酸三鈉，天津市永大化學試劑有限公司；山梨酸鉀，北京科百奧生物科技有限公司；苯甲酸鈉，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Scan1200全自動菌落計數儀，法國Interscience公司；Spectramax plus 384酶標儀，美國Molecular Devices；Evolution 220紫外分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 食品防腐劑儲備液的配制

丁香酚和肉桂醛溶于5%的吐溫-20，配制成質量濃度為100 mg/mL的儲備液；乳酸鏈球菌素(nisin)、檸檬酸、苯乳酸、ε-聚賴氨酸、茶多酚、魚精蛋白、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、EDTA-Na2、磷酸三鈉均溶于無菌水，配置成質量濃度為10、20、20、1、10、20、200、250、160、100 mg/mL的儲備液；抗菌肽brevilaterin溶于水制備為1280 AU/mL的儲備液。

1.3.2 最小抑菌濃度測定

采用96孔板微量二倍稀釋法考察各抑菌物質的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。參照WIEGAND等[19]的方法進行適當修改：在96孔板的2～11孔分別加入100 μL培養基，第12孔加入200 μL培養基作為空白對照；在第1、2孔中分別加入100 μL抗菌溶液，第2孔混勻后吸取100 μL至第3孔，重復此操作至第10孔，第10孔混合均勻后吸取100 μL棄去；在1～11孔中接種100 μL菌懸液，使每孔菌體終濃度為5×105CFU/mL；將96孔板置于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h，最小抑菌濃度為培養前后ΔOD600≤0.05 的抑菌劑的最低濃度，結合肉眼觀察即可判定為最低抑菌濃度MIC。

1.3.3 聯合抑菌效應評價

參考SEGAL等[20]的微量棋盤法利用96孔板進行聯合抑菌試驗。將brevilaterin和食品防腐劑濃度配置為8～1/8 MIC；在孔板的A2～H2孔中分別加入8 MIC-brevilaterin，A3～H3孔中分別加入4 MIC-brevilaterin，依次進行；在H1～H8孔中分別加入8MIC-防腐劑，G1～G8孔中分別加入8MIC-防腐劑，依次進行；在A1孔中加入200 μL培養基，做空白對照；在其它孔中加入菌懸液，使每孔最終菌濃約為5×105CFU/mL；將96孔板置于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h，根據澄清孔中2種抑菌劑聯用時的最終MIC計算聯合抑菌指數FICI。聯合抑菌作用評價根據下列公式1：

(1)

通過計算聯用時的聯合抑菌指數FICI，判斷兩者的聯用關系：FICI≤0.5，判定為協同作用；0.52，為拮抗作用。

1.3.4 Brevilaterin和食品防腐劑復配配方篩選

基于聯合抑菌效應評價結果，選取與brevilaterin具有協同抑菌效果的抑菌劑及兩者的復配比例。分別向添加有抑菌物質和培養基的試管中分別接入對數生長期的E.coliATCC 44752和S.aureusATCC 25923，使最終菌體濃度為105CFU/mL。各試管置于 37 ℃培養18 h時，取樣進行菌落計數，每組平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 Brevilaterin與食品防腐劑的最小抑菌濃度

首先考察了brevilaterin與11種食品添加劑對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度，結果(表1)顯示，brevilaterin對革蘭氏陰性菌的MIC為160 AU/mL(大腸桿菌)和320 AU/mL(沙門氏菌)，顯著高于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(10 AU/mL)和單核細胞增生李斯特菌(20 AU/mL)。8種天然食品防腐劑中除了丁香酚外均呈現對革蘭氏陽性菌抗菌活性優于革蘭氏陰性菌的結果，且brevilaterin和ε-聚賴氨酸的效果最佳。肉桂醛對革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌效果相當，檸檬酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果優于單核細胞增生李斯特菌和沙門氏菌。關于革蘭氏陰性菌的抑制，天然防腐劑中ε-聚賴氨酸對革蘭氏陰性菌的抑菌效果最好，MIC值為0.125 mg/mL；其次為丁香酚、肉桂醛和茶多酚，MIC值均小于1 mg/mL。4種化學防腐劑中僅有EDTA-Na2對革蘭氏陽性菌的抑菌效果最好(MIC值小于1 mg/mL)，其他化學防腐劑對4種致病菌抑菌效果較差，MIC均大于 10 mg/mL。總之，以上結果表明天然防腐劑的抑菌效果優于化學防腐劑，且天然防腐劑對革蘭氏陽性菌的抑菌效果普遍優于革蘭氏陰性菌。

表1 Brevilaterin與食品防腐劑對食源性致病菌的最小抑菌濃度Table 1 MICs of brevilaterin and food preservatives against foodborne pathogens

注：“-”代表無抑菌活性。

2.2 Brevilaterin與食品防腐劑的聯合抑菌效應

2.2.1 Brevilaterin與食品防腐劑聯用對金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌的聯合抑菌作用

首先，考察了brevilaterin和食品添加劑聯用對金黃色葡萄球菌的聯合抑菌效應，結果(表2)顯示brevilaterin和ε-聚賴氨酸聯用對金黃色葡萄球菌的分級抑菌指數FICI為0.5，判定為協同作用。

表2 Brevilaterin與食品防腐劑對金黃色葡萄球菌的聯合抑菌作用Table 2 Combined antibacterial effect of Brevilaterin with food preservatives against S. aureus

Brevilaterin-nisin和brevilaterin-魚精蛋白對金黃色葡萄球菌的分級抑菌指數FICI介于0.5～1之間，均表現為部分協同抑菌，brevilaterin分別與ε-聚賴氨酸、nisin和魚精蛋白聯用可以降低單一添加劑的使用劑量，發揮協同增效作用。brevilaterin-丁香酚、brevilaterin-肉桂醛對金黃色葡萄球菌的分級抑菌指數FICI為1，均表現為相加作用。brevilaterin分別與檸檬酸、茶多酚、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、磷酸三鈉和EDTA-Na2聯用對金黃色葡萄球菌的分級抑菌指數FICI均為2，表現為無關。

其次，考察了brevilaterin和食品添加劑聯用對單核細胞增生李斯特菌的聯合抑菌效應，結果(表3)顯示brevilaterin分別與ε-聚賴氨酸、丁香酚、魚精蛋白、苯甲酸鈉、磷酸三鈉、EDTA-Na2的分級抑菌指數FIC均在0.5～1之間，表明聯合作用為部分協同關系；brevilaterin與肉桂醛的FICI為1，表明兩者為相加作用；brevilaterin分別與nisin、茶多酚、檸檬酸、山梨酸鉀的FIC均為2，表明聯用為無關作用。上述結果表明brevilaterin分別與ε-聚賴氨酸和魚精蛋白聯用對革蘭氏陽性致病菌具有協同或部分協同抑菌作用，brevilaterin與nisin聯用對金黃色葡萄球菌具有部分協同效應。考慮到ε-聚賴氨酸和nisin為GB 2760食品添加劑使用標準中規定使用的添加劑，且應用范圍較廣，因此brevilaterin與ε-聚賴氨酸和nisin聯用對于食品中革蘭氏陽性致病菌的控制具有較高的應用潛力。

表3 Brevilaterin與食品防腐劑對單增李斯特菌的聯合抑菌作用Table 3 Combined antibacterial effect of Brevilaterin with food preservatives against L. monocytogenes

2.2.2 Brevilaterin與食品防腐劑聯用對大腸桿菌和沙門氏菌的聯合抑菌作用

進一步考察了brevilaterin與食品防腐劑聯用對革蘭氏陰性致病菌的聯用作用效應，其中對大腸桿菌的聯合抑菌效應結果(表4)顯示：brevilaterin分別與EDTA-Na2和檸檬酸聯用對大腸桿菌的FICI分別為0.141和0.5，屬于協同抑菌。盡管EDTA-Na2與brevilaterin聯用的協同抑菌效應更強，但是由于EDTA-Na2對大腸桿菌的MIC是檸檬酸的8倍，因此brevilaterin與檸檬酸的協同效應更值得推廣應用。Brevilaterin-磷酸三鈉對大腸桿菌的FICI為0.625，表明brevilaterin-磷酸三鈉對大腸桿菌呈現部分協同關系。Brevilaterin分別與肉桂醛、苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯用對大腸桿菌的FICI均為1，表現為相加關系。Brevilaterin分別與ε-聚賴氨酸、茶多酚和丁香酚聯用對大腸桿菌的FICI均為2，表現為無關作用。

表4 Brevilaterin與食品防腐劑對大腸桿菌的聯合抑菌作用Table 4 Combined antibacterial effect of brevilaterin with food preservatives against E. coli

Brevilaterin對沙門氏菌的聯合抑菌效應結果(表5)顯示：brevilaterin分別與EDTA-Na2和磷酸三鈉聯用對沙門氏菌的FIC為0.1875和0.5，表現為協同效應；brevilaterin分別與檸檬酸和苯甲酸鈉聯用對沙門氏菌的FIC均為0.75，表現為部分協同效應；brevilaterin與肉桂醛聯用FIC為1，表現為相加作用；brevilaterin與ε-聚賴氨酸、魚精蛋白、茶多酚、丁香酚、山梨酸鉀聯用的FIC均為2，表現為無關作用。上述研究表明brevilaterin與EDTA-Na2聯用對2種革蘭氏陰性菌食源性致病菌均呈現協同抑菌效應，與檸檬酸聯用均呈現部分協同抑菌效應，與磷酸三鈉聯用呈現部分協同抑菌效應。由于EDTA-Na2是螯合劑，通常添加于食品中從發揮防止油脂氧化、果蔬褐變等作用[21]，因此可在添加有EDTA-Na2的食品中加入brevilaterin來發揮協同抑菌作用。陳歷水等[22]也發現EDTA-Na2可同其他防腐劑聯用對沙雷氏菌發揮協同抑菌作用。另外，磷酸三鈉常用于肉制品生產中以改善食品持水性等品質[23]，因此可以考慮在添加有磷酸三鈉的食品體系中使用brevilaterin作防腐劑來提高食品的保藏性。檸檬酸常作為酸度調節劑用于飲料、濃縮果汁等食品的生產中[24]，因此在brevilaterin與檸檬酸復配在飲料和濃縮果汁等食品生產中具有較高的應用潛力。林琳等[25]也發現檸檬酸鈉與桂皮提取物對食品中常見的革蘭氏陰性致病菌具有協同抑菌效果。

表5 Brevilaterin與食品防腐劑對鼠傷寒沙門氏菌聯合抑菌作用Table 5 Combined antibacterial effect of brevilaterin with food preservatives against S. typhimurium

2.3 Brevilaterin和食品防腐劑復配配方篩選

基于聯合抑菌效應的研究結果：brevilaterin與nisin聯用對革蘭氏陽性菌具有部分協同作用，與檸檬酸、EDTA-Na2聯用對革蘭氏陰性菌具有協同抑菌效應，但由于EDTA-Na2在食品中的應用范圍較檸檬酸窄，因此最終選取brevilaterin(20 AU/mL)、nisin(0.312 5 mg/mL)和檸檬酸(0.625 mg/mL)三者進行復配，以考察三者聯用對革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌效果。結果(圖1)顯示brevilaterin、nisin和檸檬酸3者復配組合對沙門氏菌呈現抑制作用，對其他3株致病菌均呈現不同程度殺菌效應。

圖1 Brevilaterin-nisin-檸檬酸復配對食源性致病菌的抑菌效果Fig.1 Brevilaterin-nisin-citrate against foodborne pathogenic bacteria

為了進一步驗證三者復配后的抑菌效果，進一步選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌，考察三者對2株致病菌的時間殺菌曲線。brevilaterin、nisin和檸檬酸三者聯用對金黃色葡萄球菌的時間殺菌曲線如圖2所示。

1-對照；●-brevilaterin(20 AU/mL)；▲-nisin(0.312 5 mg/mL)；▼-檸檬酸(0.625 mg/mL)；?-Brevilaterin(20 AU/mL)-nisin(0.312 5 mg/mL)；?-brevilaterin(20 AU/mL)-檸檬酸(0.625 mg/mL)；◆-nisin(0.312 5 mg/mL)-檸檬酸(0.625 mg/mL)；(Brevilaterin(20 AU/mL)-nisin(0.312 5 mg/mL)-檸檬酸(0.625 mg/mL)(下同)圖2 Brevilaterin-nisin-檸檬酸復配對金黃色葡萄球菌的時間殺菌曲線Fig.2 Time-kill curve for brevilaterin-nisin-citrate against S. aureus

結果顯示，單一添加檸檬酸(0.625 mg/mL)8 h后菌落數達到7.77 lg CFU/mL，之后隨著時間延長菌落數無顯著變化；單獨使用brevilaterin(20 AU/mL)和brevilaterin(20 AU/mL)-檸檬酸(0.625 mg/mL)復合聯用時，菌落數變化趨勢相同，2 h內菌落數迅速降至3.64 lg CFU/mL和3.02 lg CFU/mL，之后菌落數保持不變，此結果與試驗前期得到的brevilaterin-檸檬酸聯用對金黃色葡萄球菌沒有聯合抑菌效果結論一致；單獨使用nisin(0.312 5 mg/mL)菌落數在2 h內降至4.76 lg CFU/mL，之后菌落數不變；brevilaterin(20 AU/mL)與nisin(0.312 5 mg/mL)聯用組菌落數在2 h內降至2.31 lg CFU/mL，比單獨使用nisin組菌落數降低了2.45 lg CFU/mL，比單獨使用brevilaterin菌落數降低1.33 lg CFU/mL，由此證明brevilaterin-nisin對金黃色葡萄球菌具有部分協同抑菌效果，與表2中結果一致；brevilaterin(20 AU/mL)、nisin(0.312 5 mg/mL)和檸檬酸(0.625 mg/mL)聯用，2 h內菌落數迅速降至2.14 lg CFU/mL，2～4 h菌落數降至1.65 lg CFU/mL，之后菌落數保持不變。brevilaterin、nisin和檸檬酸三者聯用比單獨使用brevilaterin菌落數降低了1.99 lg CFU/mL，比單獨使用檸檬酸菌落數降低了6.12 lg CFU/mL，比單獨使用nisin菌落數降低了3.11 lg CFU/mL，比brevilaterin-檸檬酸聯用菌落數降低了1.37 lg CFU/mL，比brevilaterin-nisin聯用菌落數降低了0.66 lg CFU/mL。Brevilaterin、nisin和檸檬酸上述結果驗證了三者聯用對金黃色葡萄球菌的協同抑菌效應。

進一步考察了brevilaterin、nisin、檸檬酸三者對大腸桿菌的時間殺菌曲線，結果(圖3)顯示單獨使用brevilaterin(20 AU/mL)、nisin(0.312 5 mg/mL)，8 h后菌落數分別增至8.40 lg CFU/mL和8.42 lg CFU/mL，之后菌落數保持相對穩定；單獨使用檸檬酸(0.625 mg/mL)，6 h后菌落數增至8.29 lg CFU/mL，之后菌落數保持不變；brevilaterin(20 AU/mL)和nisin(0.312 5 mg/mL)聯用，8 h后菌落數增至8.29 lg CFU/mL，之后菌落數保持相對穩定；brevilaterin(20 AU/mL)、nisin(0.312 5 mg/mL)、檸檬酸(0.625 mg/mL)三者單獨使用與brevilaterin(20 AU/mL)和nisin(0.312 5 mg/mL)兩者組合的最終菌落數均與對照組菌落數一致，表明不能有效控制大腸桿菌生長。

圖3 Brevilaterin-nisin-檸檬酸復配對大腸桿菌的時間-殺菌曲線Fig.3 Time-kill curve for brevilaterin-nisin-citrate against E. coli

Brevilaterin-檸檬酸聯用，0～12 h菌落數增至8.00 lg CFU/mL，最終菌落數與空白組比菌落數降低0.66 lg CFU/mL,證實了brevilaterin-nisin聯用對大腸桿菌沒有協同抑菌效果，brevilaterin-檸檬酸對大腸桿菌有協同抑菌效果，但是菌落數降低幅度較小。nisin-檸檬酸聯用，8 h后菌落數增至7.08 lg CFU/mL，之后菌落數保持穩定，比空白對照組菌落數降低了1.59 lg CFU/mL。brevilaterin(20 AU/mL)、nisin(0.312 5 mg/mL)、檸檬酸(0.625 mg/mL)3者聯用，0～2 h菌落數迅速降至4.52 lg CFU/mL，2～6 h菌落數增至5.63 lg CFU/mL，之后菌落數保持相對穩定，與空白對照組相比菌落數降低了3.04 lg CFU/mL。所以，brevilaterin(20 AU/mL)、nisin(0.312 5 mg/mL)和檸檬酸(0.625 mg/mL)3者聯用對大腸桿菌有協同抑菌效果，可有效降低抗菌肽添加量。

3 結論

本研究全面評價了brevilaterin與化學防腐劑和生物防腐劑的聯用抑菌效應，發現brevilaterin分別與ε-聚賴氨酸、nisin聯用對革蘭氏陽性菌具有協同抑菌效應，分別與EDTA-Na2、Na3PO4和檸檬酸聯用對革蘭氏陰性菌具有協同或部分協同效應。brevilaterin(20 AU/mL)、nisin(0.312 5 mg/mL)、檸檬酸(0.625 mg/mL)三者聯用對革蘭氏陽性菌和陰性菌均可實現抑菌作用，而brevilaterin的添加劑量僅為原來MIC的1/8，表明通過對協同抑菌物質的復配有效地降低了brevilaterin使用劑量，且所開發的抑菌配方對食源性致病菌具有廣譜抑菌活性。