全二維氣相色譜-飛行時間質譜解析黃土高原產區赤霞珠葡萄酒揮發性組分特征揮發性化合物

田欣，祁新春，張澤，繆成鵬，徐巖，唐柯*

1(教育部工業生物技術重點實驗室,江蘇 無錫，214122) 2(食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，釀造微生物學與應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122) 4(山西戎子酒莊有限公司，山西 臨汾，041000)

葡萄酒是世界上最流行的酒精飲料之一，葡萄酒的香氣反應了一款葡萄酒的品種、產地、釀造工藝等，其決定著葡萄酒的風味和典型性[1]，是葡萄酒品質評價中最重要的標準之一，也是消費者選擇葡萄酒的重要因素之一，所以葡萄酒香氣的研究對于提高葡萄酒的品質和產區典型性都具有重要意義。中國葡萄酒產業發展迅猛，涌現出很多優質的葡萄酒產區，其中黃土高原產區是我國近年來一個新興的葡萄酒產區，該地區具備葡萄栽培獨特的氣候和地域特點，為釀酒葡萄的生長提供了得天獨厚的風土條件[2]，受到國內外的廣泛關注。目前對于該產區葡萄酒風味特征及揮發性化合物的研究已經逐漸開始展開[3-5]。

近年來國內對于不同產區不同品種的葡萄酒的香氣研究已經非常廣泛，但是對于葡萄酒揮發性成分的檢測分析主要基于一維氣相色譜技術。李佳等[6]通過GC-MS對昌黎地區的赤霞珠葡萄酒的香氣成分進行了解析，共鑒定出36種香氣物質，其中醇類占香氣成分的一半以上，賦予葡萄酒產區特性，并且甲氧基異戊酸乙酯、3-甲氧基癸酸乙酯等化合物也可能為特征香氣成分；宋慧麗等[7]通過頂空固相微萃取結合氣相色譜技術(headspace solid-phase microextraction combined-compre-hensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)共檢測出河西走廊赤霞珠原汁和酒中130種香氣化合物；侯敏[8]運用了感官分析與儀器分析(GC-MS)相結合的手段明確了沙城產區赤霞珠葡萄酒香氣特征描述詞和83種關鍵香氣化合物；王蓓等[9]采用攪拌棒吸附萃取-氣相色譜/質譜聯用技術(SBSE-GC-MS),對我國威代爾冰葡萄酒的揮發性成分進行檢測分析，共定性出109種揮發性成分；左俊偉等[10]同樣采用了HS-SPME-GC-MS對寧夏產區霞多麗和貴人香干白葡萄酒的香氣物質進行檢測，共定性得到49種香氣物質，并明確了果香特征的主要貢獻化合物。這些研究豐富了對我國葡萄酒風味化學的認識并對進一步的香氣特征的探究奠定了基礎。

但是葡萄酒中香氣成分較多且復雜，通過一維氣相色譜技術進行檢測會出現化合物共流出的現象，影響了定性結果的準確性，而全二維氣相色譜的出現較好的改善了該問題。這項技術發明于上世紀九十年代，其利用兩根性質不同的色譜柱，將第一維氣象色譜柱分離出的組分的流出到第二維氣相色譜柱(兩次分離的色譜柱性質不同)中進行再次分離，從而極大提高峰容量和分辨率，同時也提高靈敏度[11]。從而相對一維氣相色譜技術，較好的改善了共流出的現象。目前國外已經將全二維色譜技術廣泛用于葡萄酒香氣的研究中，WELDEGERGIS等[12]采用全二維飛行時間質譜技術(GC×GC-TOFMS)對南非皮諾塔基葡萄酒的揮發性化合物進行了全面的檢測，共定性得到206種化合物；WELKE等[13]采用GC×GC-TOFMS對巴西霞多麗葡萄酒進行了定性和定量分析；NICOLLI等[14]則通過感官分析、GC-O和GC×GC-TOFMS分析了不同葡萄園管理手段對葡萄酒香氣的影響。

目前全二維氣相色譜技術在我國已經應用于白酒[15]、茶[16]、調料[17]等食品的檢測分析中，而在葡萄酒香氣物質的研究中還鮮有報道，因此本研究采用GC×GC-TOFMS對黃土高原產區赤霞珠葡萄酒中揮發性成分進行鑒定，以期探討全二維氣相色譜技術在葡萄酒香氣分析中的應用，同時也為深入探究黃土高原產區葡萄酒的風味特征提供基礎數據與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5款赤霞珠干紅葡萄酒分別來自黃土高原產區五個小產區(馱腰坡、大石頭、十里鋪、南頭、東廒)，均由山西戎子酒莊提供；NaCl(分析純)，上海國藥集團；C5-C30 烷烴標樣(色譜純),天津光復精細化工研究所。具體信息見表1。

表1 赤霞珠干紅葡萄酒樣品信息Table 1 Cabernet Sauvignon dry red wine sample information

1.2 儀器與設備

全二維氣相色譜-飛行時間質譜系統由Agilent 7890N氣相色譜(美國Agilent公司)，KT-2001冷噴調制器(美國Zoex公司)和Pegasus 4D飛行時間質譜儀(美國Leco公司)組成；2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，美國Supelco公司；MPS多功能自動進樣器，德國Gerstel公司；DB-FFAP毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；Rxi-17Sil MS(1.1 m×0.25mm ID，0.25 μm)，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)

取8 mL葡萄酒樣品置于20 mL頂空樣品瓶中，加入3 g氯化鈉。萃取溫度 50 ℃，樣品平衡 5 min，萃取 45 min，轉速為 250 r/min。萃取結束后進樣，萃取頭在GC進樣口(250 ℃)解析附5 min。

1.3.2 全二維飛行時間質譜(GC×GC-TOFMS)儀器條件

氣相色譜條件：色譜柱：一維色譜柱DB-FFAP，二維色譜柱Rxi-17Sil MS。色譜條件：進樣口溫度 250 ℃，以不分流模式進樣。一維柱溫箱升溫程序：起始溫度45 ℃保持2 min，以4 ℃/min 的速率升溫至 230 ℃并保持 15 min。調制器調制時間4 s，熱調制時間為 1 s，調制補償溫度為 20 ℃。二維柱溫箱升溫程序：起始溫度 40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。以高純氦氣(>99.999 5%)作為載氣，恒流模式，流速：1 mL/min。

飛行時間質譜條件：采用EI離子源，離子源溫度 230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電壓控制 70 eV。檢測器采集質量數范圍35～400 amu，采集頻率 100 spectrum/s，電壓控制1 430 V。

1.4 數據分析

數據由LECO公司Pegasus 4D工作站采集，通過儀器自帶的ChormaTOF軟件對數據進行分析，其中色譜峰的峰寬分別設為24 s和0.2 s，自動識別信噪比大于200的色譜峰后進行自動積分解卷積和質譜庫(mainlib，Wiley 9和replib)比對，進一步通過保留指數(保留指數根據C5-C30計算得出)定性，選擇相似度及反相似度不小于700的化合物作為最終鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 黃土高原赤霞珠葡萄酒揮發性化合物分離特性解析

由于葡萄酒香氣組成和基質十分復雜，采用一維氣相色譜技術進行分離檢測尚存在峰容量不足、共流出、靈敏性低等問題，從而影響最終定性的結果或無法鑒定出一些關鍵化合物，遠遠無法滿足目前我們對于葡萄酒風味化學研究的需要。全二維氣相色譜技術的出現，為更好的分離鑒定這些復雜的組分提供了有力的工具。全二維氣相色譜具有分離能力強、峰容量大、選擇性高的特點，與飛行時間質譜的連用更好的提高了其靈敏性，從而可以檢測到更多痕量物質，豐富對風味化學研究的認識[11]。

由圖1可見，一維色譜圖中存在大量化合物共流出的現象，在同一個一維時間點上，存在多個物質。而進一步采用二維色譜分離，這些共流出的化合物在二維色譜上得到了較好的分離，二維色譜具有強大的分離能力，可以更好的進行復雜組分的分離鑒定。

圖1 黃土高原產區赤霞珠葡萄酒1D總離子流色譜圖(a)及2D總離子流色譜圖(b)Fig.1 GC × GC-TOFMS total 1D (a) and 2D (b) ion chromatogram of volatile compounds of Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau

在全二維色譜分離中，由于采用性質不同的兩種色譜柱進行分離，其具有相同結構的化合物在譜圖上分布具有規律性的特點，同系物呈現線性分布[15,18]，可以為葡萄酒中香氣化合物的定性提供依據，從而提高鑒定結果的可靠性。在GC-O結合一維氣相色譜對具有香氣貢獻的化合物進行鑒定的過程中，由于共流出及靈敏性等問題，使一些關鍵化合物不能被很好的鑒定出來,在結果中存在一些未知物質，前期席艷茹等[19]采用GC-O-MS對來自黃土高原產區的兩個小產區的赤霞珠葡萄酒進行分離，但仍有一些重要的的香氣貢獻物質無法被定性，而在對鎮江陳醋的研究中，研究人員將GC-O與全二維技術結合使用[20]，便可以較好的對關鍵化合物進行高效的鑒定。與前期對于該產區赤霞珠葡萄酒揮發物質的研究相比，蔣寶等[21]采用HS-SPME結合一維氣相色譜技術(GC-MS)對黃土高原產區赤霞珠葡萄酒進行檢測鑒定，共鑒定到45種香氣化合物，而通過GC×GC-TOFMS進行分離鑒定一共可以鑒定到600種化合物，而在每個小產區的酒中也可以定性到400種左右化合物(見表2)，相對一維具有明顯的優勢，特別是具有較高的靈敏性，可以鑒定到一些痕量化合物，從而豐富我們對葡萄酒風味化學的認識，也為進一步探究產區特性提供基礎。

表2 黃土高原赤霞珠葡萄酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定化合物統計Table 2 Volatile compounds identified in Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

2.2 黃土高原赤霞珠葡萄酒揮發性化合物分析

通過全二維氣相色譜與飛行時間質譜聯用的方法，對黃土高原產區赤霞珠葡萄酒揮發性組分進行檢測，通過Pegasus 4D工作站對質譜庫的檢索結合保留指數比對，共定性得到600個化合物，其中以酯類、芳香族、萜烯類和醇類為主，分別定性到128種、113種、85種和83種化合物。該結果同赤霞珠葡萄酒風味化合物的研究具有一致性[22-23]。

在黃土高原產區中，來自不同的小產區中定性到的化合物總數相差不大分別，其中來自大石頭產區的赤霞珠葡萄酒定性到430種化合物、十里鋪產區定性到407種，南頭產區定性到392種，東廒產區定性到415種以及在馱腰坡產區定性到396種化合物。而對比不同小產區中類別的數量，與整體情況一致，都以酯類、芳香族、萜烯類和醇類為主且小產區間相差不大，該結果說明產區間具有較好的一致性，從而具有共有的產區特征性。

在鑒定的化合物中，酯類物質的數目最多，占整體數目的21.33%，酯類是葡萄酒中含量最多的一類物質，酯類化合物是一種良好的風味物質，大多呈現果香類的香氣特征。如乙酸異戊酯、異戊酸乙酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯以及蘋果酸二乙酯等，其具有蘋果、香蕉、椰子和桃李等水果香。此外，一些短鏈酯主要產生果香、花香等香氣，是葡萄酒中清新果香的主要來源，而一些長鏈酯則產生類似堅果、蜂蜜和油脂的香氣，為葡萄酒帶來更為厚重的香氣特征，增加葡萄酒風味的復雜性[24]。

芳香族化合物占18.83%，芳香族化合物主要來源于原料中芳香族氨基酸的分解代謝，為酒的風味帶來一些花香、香料類的香氣，從而增加葡萄酒香氣的復雜性，如苯甲醇、苯乙醇為葡萄酒帶來類似玫瑰的香氣，而肉桂酸乙酯、香草醛等則為葡萄酒貢獻了類似香料、煙熏的香氣特征。

醇類化合物也是風味物質中重要的一類芳香物質，本研究共檢測到83種，占總量的13.83%，其與酯類物質共同奠定了葡萄酒中的水果香氣和清香的基調，其中順-3-己烯醇、反-2-己烯醇等為葡萄酒貢獻了青草類的清香。

醛酮類化合物共檢測到74種，占總物質的12.33%，其中醛類物質為酒帶來一些植物類和油脂的香氣，如己醛、反-2-甲基-2-丁烯醛、壬醛等，而酮類則主要是一些奶香和堅果類的香氣特征，如2,3-丁二酮等。

含硫化合物也是葡萄酒中關鍵的一類香氣化合物，由于其閾值較低，且具有獨特的香氣特征，雖然目前認為其主要是一些不良氣味的來源，但其對葡萄酒整體風味具有較大的影響，目前同樣是葡萄酒風味研究的熱點之一[25]。在黃土高原產區赤霞珠葡萄酒中共檢測到25種含硫化合物，占總體數目的4.17%。其中2-甲基噻吩等物質具有肉類的香氣特征[26]，3-甲硫基丙醇具有煮土豆的香氣特征，是威代爾冰酒中的關鍵化合物[27]，這些含硫化合物均為葡萄酒增添了香氣的復雜性。

此外，萜烯類化合物也是葡萄酒中重要的一類化合物，是葡萄酒品種香的重要來源[28]，具有清香的植物或水果和花香的香氣，并且很多萜烯類物質具有重要的生理活性，一直是葡萄酒風味研究中的熱點。在黃土高原產區赤霞珠葡萄酒樣品中共定性到85種萜烯類化合物，占總體的14.17%(表3)。之前蔣寶[21]等人只在黃土高原產區新釀赤霞珠葡萄酒中檢測到1種萜烯類化合物。而席艷茹等[29]人結合GC-O在2013年黃土高原5個小產區新釀赤霞珠葡萄酒中共定性到8種具有香氣貢獻的萜烯類化合物。相比一維的檢測，通過GC×GC-TOFMS可以更加有效對痕量萜烯類化合物進行檢測，并且可以很好的對同分異構體進行鑒定，如E-羅勒烯和Z-羅勒烯。萜烯類化合物主要為葡萄酒的風味貢獻植物類和花香類的特征，如1,4-桉葉素和1,8-桉葉素是澳大利亞赤霞珠葡萄酒中典型的桉樹香氣的貢獻化合物[30]，γ-萜品烯、α-雪松烯、1-萜品醇、4-萜品醇等主要呈現生青、松葉類的香氣特征，異香葉醇、香茅醇、β-大馬酮、α-紫羅蘭酮等則為葡萄酒貢獻玫瑰、紫羅蘭等花香類的香氣特征，這些為葡萄酒的風味帶來清新清甜的植物香氣和復雜性。

表3 黃土高原赤霞珠葡萄酒中萜烯類化合物Table 3 Terpenes in Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau

續表3

序號名稱CAS1RT/s2RT/s保留指數a參考保留指數b相似性反相似性可能性14異松油烯586-62-910242.761283.41280918932167415順式玫瑰氧化物876-17-511722.511357.31358862872264416(-)-玫瑰醚16409-43-111722.511357.31390859919359817反式玫瑰醚876-18-612002.611371.31365716885564818α-側柏酮546-80-513162.3314311438798819160419α-環檸檬醛432-24-613482.41448.11430831837377520順式-里那醇氧化物5989-33-313961.991473.41478908920375821順式-對薄荷烷-3-酮491-07-613962.491473.71465753775303222反式-里那醇氧化物34995-77-213961.981473.41452912919376723橙花醇氧化物1786-08-914002.361475.71500878880920424茶香螺烷36431-72-814643.171510.41523882915886825(1S)-(-)-樟腦464-48-215002.41529.61532865881559926葡萄螺烷65416-59-315122.941536.415279089317429271-(1,4-二甲基-3-環己烯-1-基)乙酮43219-68-715202.321540.41504727775832528里那醇78-70-615281.81544.51552960960642329α-雪松烯469-61-415843.621575.91571812871237530(-)-異胡薄荷醇89-79-215882.011577.215757118092905311-萜品醇586-82-315881.941577.11582905907570532小茴香醇1632-73-116041.861585.815978778848673334-萜品醇562-74-316402.081605.71612943944777134脫氫芳樟醇29957-43-516481.731610.11613766855568535反式-依杜蘭41678-29-916562.81615.216027498223829362-(4-甲基-3-環己烯基)丙醛29548-14-916802.191628.61620810823271937β-環檸檬醛432-25-716882.361633.21622919926866438β-萜品醇138-87-416881.881632.91641861877553439乙酸反式里那醇氧化物酯56752-50-217002.3616401619760797725940γ-松油醇21129-27-117041.9116421621964966197641反式羅勒烯醇7643-60-917201.7816511650776829275342羅勒烯醇5986-38-917201.7816511688732840234543藏紅花醛116-26-717322.221658.11617903911854844乙酸香茅酯150-84-517402.421662.71662840872423645順α-法呢烯28973-97-917442.911665.31657909926405046(E)-β-法呢烯18794-84-817482.891667.61662899918378847異龍腦醇124-76-517561.91671.51670736792286848(-)-龍腦醇464-45-918161.8617061675794842316249β-紅沒藥烯495-61-418563.061731.11738905906422650水芹醛21391-98-018682.317381710838930725851環氧芳樟醇14049-11-718721.781740.11721731755736852反式吡喃里那醇氧化物39028-58-518721.781740.11724704794726153α-金合歡烯502-61-418882.851750.51745905925713154香茅醇106-22-919121.761764.51771921934441455α-姜黃烯644-30-419362.81779.81773895906853756γ-異香葉醇13066-51-819481.751786.418008909028984572-蒎烯-10-醇515-00-419681.791798.71767773812534258橙花醇106-25-219721.751801.11806891903394059異香葉醇5944-20-719921.751813.61820872875593660β-大馬酮23726-93-420242.3618341830921922804061順式-香葦醇1197-06-420321.771838.61866717757572762反式香芹醇1197-07-520361.781841.11836730791447563菖蒲烯483-77-2204031844.41840823855570364α,β-二氫-β-紫羅蘭酮17283-81-720402.4618441854791829605865香葉醇106-24-120441.751846.11853916917339066香葉基丙酮3796-70-120682.341861.518628969066042

續表3

注：a，保留指數根據C5-C30正構烷烴計算得出；b，數據來源于NIST數據庫。

研究還檢測到呋喃、內酯、吡嗪等化合物，與上述物質共同組成了黃土高原產區赤霞珠葡萄酒的香氣特征。

3 結論

本研究采用全二維氣相色譜結合飛行時間質譜(GC×GC-TOFMS)技術對黃土高原5個小產區的赤霞珠葡萄酒中揮發性組分進行了全面解析。研究發現采用全二維色譜技術結合飛行時間質譜具有強分離能力和靈敏性，可以更有效的對復雜組分進行分析，較好的解決了一維氣相色譜中共流出和無法檢測到一些痕量物質的問題。通過對質譜庫的檢索及保留指數比對，在黃土高原產區赤霞珠葡萄酒中共鑒定出600種香氣化合物，體現了葡萄酒香氣成分的復雜性。其中揮發性組分以酯類、芳香族、萜烯類和醇類為主，此外還有醛酮類、含硫化合物、呋喃、內酯、吡嗪等化合物，這些物質共同作用形成了該產區葡萄酒的風味特征。但本研究只是對黃土高原產區赤霞珠葡萄酒中的化合物進行了鑒定分析，而其對葡萄酒風味的貢獻還與其含量和閾值等有較大關系，同時本研究檢測到了數量眾多的萜烯類化合物和硫化物，這些化合物對于黃土高原產區赤霞珠葡萄酒獨特的風味貢獻均值得進一步探究。