超聲波輔助木瓜蛋白酶及發酵處理對牦牛肉的理化和質構特性

陳一萌，唐善虎，李思寧，貢佳欣，李琦

(西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都，610041)

牦牛是生長在高原惡劣環境的特有物種，被譽為“高原之舟”，其肉質鮮美，蛋白質含量高達20%～23%，比普通牛肉高58.7%，脂肪含量普遍低于普通牛肉，為5%左右[1]。牦牛肉中氨基酸總量、必需氨基酸含量優于普通牛肉[2]，富含鋅、鐵、銅、鎂、鈣、錳等礦物質元素[3]，能顯著增強人體抗病力、細胞活力和器官功能，是頗受消費者青睞的綠色食品[4]。我國牦牛采用放牧式飼養，肌纖維較粗，導致牦牛肉肉質堅硬，嫩度低，較難咀嚼，口感相對較差[5-6]。這些均表明需要進行嫩化處理。影響肉嫩度的重要因素是肌肉中的肌原纖維和結締組織。肌原纖維中的肌動蛋白、肌球蛋白及肌動球蛋白均可影響肉品的嫩度，特別是肌球蛋白的pH值、離子強度和某些外源性酶類，如胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等對肌動球蛋白的裂解[7]。結締組織中膠原蛋白的含量、結構、溶解性和分子之間的交聯程度對肉的嫩度也有很大的影響[8]。目前常用的嫩化牦牛肉的方法主要有物理嫩化法和化學嫩化法[9-11]。

木瓜蛋白酶能夠分解肉中肌原纖維和結締組織中的蛋白質，將蛋白質降解成小分子的多肽甚至氨基酸，使得肌肉絲斷裂，從而達到嫩化的目的[12]。超聲波是指頻率高于20 kHz的機械波，其空化效應會在組織內部引起強烈反應，造成肌肉內部結構的損壞，同時可引起肉中組織蛋白酶和鈣離子的釋放，破壞肌肉組織，從而起到嫩化作用[13]。微生物的發酵作用也可以改善肉的嫩度，發酵使原料肉處于酸性環境，肌肉蛋白在酸性條件下變性為膠狀組織，改變原有的質構特征，添加益生菌等微生物可分泌蛋白酶，降解肉中的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，從而達到肉質軟化的目的[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉，由四川省阿壩州紅原縣永源肉業提供，健康無病的3歲成年公牦牛的背最長肌，屠宰后于24 h內進行冷卻排酸處理后于-20 ℃下急凍，在0～4 ℃下運輸至實驗室；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，L.p)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，P.p)，中國工業微生物菌種保藏管理中心；MRS肉湯、MRS培養基，杭州微生物試劑有限公司；木瓜蛋白酶(8×105U/g)、考馬斯亮藍R-250、甘氨酸、TEMED，上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白，上海如吉生物科技有限公司；NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、KCl，KH2PO4、K2HPO4、EDTA-2Na、MgCl2、NaOH、C4H4KNaO6·4H2O、CuSO4·5H2O、SDS、丙烯酰胺、甲雙叉丙烯酰胺、乙醇、冰乙酸，均為分析純，成都科龍化工試劑廠；Tris、過硫酸銨，北京博奧拓達科技有限公司；5×SDS-PAGE加樣緩沖液，上海勵瑞生物科技有限公司；蛋白Marker(11～245 kDa)，北京索萊寶科技有限公司；食鹽、亞硝酸鈉、葡萄糖(食用級)，成都市武侯區紅旗超市。

1.2 儀器與設備

HH-6恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；SB-5200DTDN超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；TA-XT Plus質構儀，英國Stable Micro Systems公司；DHP-9162D電熱恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；Centrifuge 5804離心機，德國Eppendorf公司；UV1810S紫外分光光度計，上海佑科儀器表有限公司；DYY-2C型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料與處理

將牦牛肉從-20 ℃冰箱中取出至室溫解凍，剔除牦牛肉上的筋膜和可見脂肪塊后洗去血污，然后切成5 cm×3 cm×3 cm大小，形狀規整，厚薄均勻的肉條。切好的肉條置于含3%(質量濃度)食鹽、0.005%(質量濃度)亞硝酸鈉的腌制液中于4 ℃下腌制12 h。腌制完成后的肉條瀝干水分后，分組并稱重，便于下一步處理。

1.3.2 不同嫩化處理工藝參數

將腌制好的肉條分成6組，以未經過任何處理的牦牛肉為對照組C，其余5個對照組分別為超聲波組T1，木瓜蛋白酶組T2，超聲波輔助木瓜蛋白酶組T3，發酵組T4，超聲波輔助木瓜蛋白酶+發酵組T5。前期對不同嫩化方法處理牦牛肉的工藝條件進行優化試驗，得出各組嫩化處理工藝見表1，T1組牦牛肉用190 W的超聲波處理30 min，T2組和T3組的牦牛肉按1∶10(v∶m)的比例注射木瓜蛋白酶溶液，使肉中木瓜蛋白酶濃度達到20 U/g，滾揉15 min后，將T3組的牦牛肉再用190 W超聲波超聲30 min，T4和T5組的牦牛肉先接種由植物乳桿菌和戊糖片球菌制成的復合發酵劑，接種量為1.0×106CFU/g，在30 ℃下恒溫發酵18 h，發酵完成后再對T5組的牦牛肉進行超聲波輔助木瓜蛋白酶處理，處理條件與T3組相同。所有處理組和對照組的牦牛肉嫩化完成后進行下一步指標檢測。

表1 六組嫩化方法工藝條件Table 1 The tenderization conditions of the six treatment groups

1.3.3 指標測定

“這個——我應該說是這樣的，多虧了‘應予扣除額’這一欄下面那十一項保留條款，否則我每年都得當乞丐，去討錢供奉這個可恨的該死的敲詐勒索的，專制的政府。”

1.3.3.1 可溶性蛋白含量

根據孔令明等[16]的方法并稍作修改。稱取4.00 g切碎的肉樣，加入40 mL浸提液(100 mmol/L KCl、7 mmol/L KH2PO4、18 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L EDTA，1 mmol/L MgCl2，pH 7.0，4 ℃保存)，在高速勻漿機中于4 ℃勻漿，10 000 r/min下冷凍離心30 min，收集上清液。用雙縮脲法測定上清液中可溶性蛋白含量。

1.3.3.2 肌原纖維小片化指數

將上述離心后的沉淀中加入40 mL浸提液，于10 000 r/min下冷凍離心30 min。沉淀用15 mL浸提液溶解，再用單層紗布過濾，棄去結締組織和細胞碎片，濾液即為肌原纖維提取液。用雙縮脲法測定肌原纖維提取液中蛋白質的濃度，再用浸提液調整肌原纖維提取液蛋白質量濃度至0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定吸光度[17]。將吸光值代入公式：肌原纖維小片化指數=A540 nm×200，計算出肌原纖維小片化指數值。

1.3.3.3 雙縮脲法測蛋白濃度

參考王兆明[18]的雙縮脲法測定蛋白濃度。分別取10 mg/mL的BSA標準液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于7個玻璃試管中，配制0、2、4、5、6、8、10 mg/mL溶液各1 mL，然后加入縮二脲試劑4 mL，在25 ℃下放置60 min，以空白試劑調零，在波長540 nm下，測定各濃度BSA溶液的吸光度值A540 nm。通過Excel數據分析中的回歸分析建立直線回歸方程y=0.044x+0.002，R2=0.999 7。其中，y為樣品在540 nm下的吸光度，x為蛋白濃度。

1.3.3.4 蛋白SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE電泳參考LAEMMLI[19]和RAWDKUEN等[20]的方法。將2 g樣品置于研缽中，加入20 mL 0.5 mol/L(pH 7.8)的Tris-HCl緩沖液勻漿成稀糊狀， 10 000×g離心10 min，將上清液的蛋白質濃度調至1 g/L后，取100 μL與25 μL 5X上樣品緩沖液在離心管中混合，10 000 r/min混勻5 min，吸取樣品10 μL進行上樣。分離膠濃度12%、濃縮膠濃度5%，初始電壓為80 V，快跑至分離膠時調至120 V，當溴酚藍指示帶靠近分離膠底部時立即終止操作。取下電泳膠塊，染色2 h后脫色至條帶清晰，使用Bio-Rad凝膠成像儀拍照，分析蛋白聚集與降解變化。

1.3.3.5 質構

將嫩化處理后的樣品分別裝入蒸煮袋中密封，于90 ℃水浴鍋中加熱40 min，取出后用流動水冷卻至室溫，將樣品肉塊按相同的紋路切成2 cm×2 cm×2 cm的方塊，采用TA-XT Plus質構儀測定樣品的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性[21]。設置參數：探頭為P/0.5 s，測前速度為2 mm/s，測試速度為1 mm/s，測后速度為1 mm/s，下壓距離為10 mm，探頭2次測定間隔時間5 s，觸發類型為自動。

1.4 數據分析

每處理組樣本重復3次，使用SPSS V19.0軟件進行數據分析，實驗數據用平均數±標準差的形式表示；用單因素方差分析檢測各處理組之間的差異顯著性(P<0.05)；采用Duncan法進行平均數之間的多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同嫩化處理對牦牛肉可溶性蛋白含量(CSP)的影響

不同嫩化方法對牦牛肉可溶性蛋白含量CSP的影響結果如圖1所示。

圖1 不同嫩化處理對牦牛肉CSP的影響Fig.1 Effects of different tendering methods on CSP of yak meat注：圖中標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

對照組C的CSP為36.42 mg/g，T1～T5的CSP均顯著高于對照組(P<0.05)。T1組CSP為40.49 mg/g，超聲波的機械作用和空化作用破壞肌肉蛋白中較短的多肽鏈，同時超聲波處理對線粒體、肌質網和溶酶體產生破壞作用，使肌質網釋放Ca2+，溶酶體釋放組織蛋白酶和鈣蛋白酶，肌細胞間Ca2+濃度升高，鈣蛋白酶活性增加，其降解肌纖維結構蛋白和肌纖維間連接蛋白的能力增強，同時組織蛋白酶也發揮降解蛋白質的功能，使CSP增加[22]。T2和T3組的CSP分別為55.72和57.26 mg/g，兩組間無顯著差異(P>0.05)，這2組都添加了木瓜蛋白酶，而木瓜蛋白酶含有巰基(—SH)，在一定條件下能將肉中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、膠原蛋白和結締組織等彈性蛋白降解生成其他小分子蛋白[23]，而T3組由于超聲波同時輔助木瓜蛋白酶作用，故其CSP略高于單獨木瓜蛋白酶嫩化組。發酵嫩化組T4的CSP(52.02 mg/g)顯著高于T1組，顯著低于T2和T3組(P<0.05)，發酵產生的蛋白酶或pH值降低能水解肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白而產生許多低分子量蛋白，使肉中CSP增加；而T5組的牦牛肉經超聲、木瓜蛋白酶和發酵共同處理后，其CSP含量(65.25 mg/g)顯著高于其他處理組(P<0.05)。

2.2 不同嫩化處理對牦牛肉肌原纖維小片化指數的影響

肌原纖維小片化指數是指長度為1～4個肌節的肌原纖維占所有肌原纖維的比例，肌節中肌聯蛋白和伴肌動蛋白的降解可引起MFI的變化，MFI是評價I帶被破壞程度和肌纖維間斷裂程度的指標，可表征嫩度[24]，肌肉的MFI值越大，肌肉嫩度越好，據CULLER報道[25]，MFI≥60，非常嫩，MFI在50左右，中等嫩度，遠低于50，嫩度缺乏。由圖2可知，對照組的MFI為33.93，所有處理組的MFI均顯著高于對照組(P<0.05)，其值分別為85.73、97.13、110.60、65.07、69.00，說明經不同嫩化處理后，牦牛肉的嫩度得到了較好改善，且各處理組之間MFI值差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同嫩化處理對牦牛肉MFI的影響Fig.2 Effects of different tendering methods on MFI of yak meat

T1組中超聲波嫩化后牦牛肉的MFI顯著增加，超聲波具有的強穿透力和空化效應等，可以促使肌原纖維、結締組織等在短時間內遭到破壞，使肌原纖維破碎斷裂成肌節小片，因此小片化程度在短時間內顯著增大[26]；T2組的MFI值顯著高于T1組，因牦牛肉中肌原纖維蛋白可在木瓜蛋白酶的作用下分解，使Z線弱化和降解，導致肌節斷裂，肌原纖維橫向交聯被破壞，從而使肌原纖維出現小片化[27]；T3組的MFI值為5個嫩化處理組中最高的，結果表明超聲波結合木瓜蛋白酶處理可顯著降低牦牛肉的嫩度；T4和T5組的牦牛肉經過發酵后，MFI值顯著高于對照組，但低于其他處理組(P<0.05)，發酵使MFI值升高主要是因為微生物蛋白酶和內源蛋白酶在作用于肌肉蛋白時，肌原纖維間I帶和Z線結合變弱直至斷裂，肌原纖維間的連接蛋白降解，肌肉結構遭到破壞，從而大大提高肉的嫩度，表現為MFI增大[28]，T5組牦牛肉經超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化，其MFI值顯著高于T4組(P<0.05)。

2.3 不同嫩化處理的蛋白SDS-PAGE電泳的比較

從圖3的蛋白質電泳圖譜可知，對照組中最明顯的蛋白條帶主要集中在分子量135～245、45～48 kDa之間，在48～100 kDa和低于48 kDa分子量處分布數條蛋白條帶，10～17 kDa之間有2條比較清晰的條帶。由電泳圖譜可知，這類蛋白質在不同嫩化處理后均發生不同程度的降解。觀察T1的蛋白條帶，與對照組的蛋白條帶相似，但條帶變細、顏色變淡，尤其是蛋白分子量為135～245、100、45～48、20～25和17 kDa的條帶變淡變少，14 kDa左右的條帶與對照組和其他處理組無明顯差異，這說明超聲波對牦牛肉的嫩化效果并不完全是由蛋白質的降解引起的；T2和T3的蛋白質發生了非常明顯地降解，與對照組相比，135～245、100 kDa處蛋白條帶變淡變模糊，45～48 kDa之間較粗的條帶變成3條細小的條帶，20～25和17 kDa的條帶逐漸消失，尤其是T3組中這些蛋白條帶已經消失，這說明這2種方法均有較好的嫩化效果；T4組牦牛肉發酵后，相對分子量為135～245 kDa的蛋白條帶變淡，且逐漸分成2條比較清晰的條帶，63 kDa左右的蛋白條帶比對照組清晰，45～48 kDa之間的條帶變細，顏色變淡，20～25 kDa之間的蛋白帶消失，17 kDa的條帶變淡；T5組的蛋白條帶與T4組相似，但該組牦牛肉還經過超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化，其蛋白條帶比T4組顏色淺，尤其是45～48 kDa之間的粗條帶變細，形成一條清晰的條帶。

結合超聲波嫩化后牦牛肉CSP和MFI可知，超聲波對牦牛肉的嫩化主要是由于其機械作用或空化作用破壞肌纖維結構，故其可溶性蛋白含量和蛋白降解程度都低于其他處理組，而肌原纖維斷裂效果較好，MFI值較高。木瓜蛋白酶不僅能使肌原纖維斷裂，也能直接作用于蛋白質使其降解成小分子蛋白甚至氨基酸，對牦牛肉的嫩化效果極為明顯。而在超聲波的協助下，木瓜蛋白酶在肉中分布更均勻，活性更強，其CSP較高，MFI值最高。發酵對蛋白質的降解能力也較強，發酵時微生物產生的蛋白酶能降解蛋白，同時破壞肌肉結構，而結合超聲輔助木瓜蛋白酶嫩化后，牦牛肉的嫩度不僅能得到極佳改善，發酵產生的氨基酸物質等可賦予牦牛肉更豐富的風味，更鮮艷的顏色，有益微生物還可抑制有害微生物的生長繁殖，提高牦牛肉的安全性。

M-Marker；C-對照組；T1-超聲波組；T2-木瓜蛋白酶組；T3-超聲波輔助木瓜蛋白酶組；T4-發酵組；T5-超聲波輔助木瓜蛋白酶+發酵組圖3 不同嫩化方法處理牦牛肉的蛋白質SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoretogram of proteins from yak meat by different tenderization treatments

2.4 不同嫩化處理對牦牛肉質構的影響

表2為不同嫩化方法處理后的牦牛肉的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性的影響。與對照組相比，5種嫩化處理均能降低牦牛肉的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性，硬度關系為T30.05)，其余處理組硬度、彈性、內聚性和咀嚼性均有顯著差異(P<0.05)，可見不同嫩化處理對改善牦牛肉的質構、降低嫩度的效果不同。T1組的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性顯著低于對照組(P<0.05)，但高于其他處理組，表明超聲波處理能在一定程度上破壞牦牛肉的肌肉結構，SOLOMON等[29]通過顯微鏡觀察到超聲波作用能使肉中的連接蛋白纖絲受到嚴重破壞，導致肉塊變軟。T2和T3組的牦牛肉經過木瓜蛋白酶嫩化后，其硬度、彈性、內聚性和咀嚼性顯著降低，由于木瓜蛋白酶對牦牛肉中的結締組織以及肌纖維中結構較復雜的膠原蛋白、彈性蛋白的水解作用強烈，對其結構的破壞性強，肉的嫩度得到了較大提高，而T3組中木瓜蛋白酶在超聲波的輔助作用下，分布更均勻，擴散速度更快，酶的活力增強，故該組的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性是所有處理組中最低的，因此超聲波輔助木瓜蛋白酶對牦牛肉的嫩化效果顯著高于單獨的超聲波、木瓜蛋白酶嫩化工藝；T4組的牦牛肉經過微生物發酵后，其硬度、彈性、內聚性和咀嚼性介于T1和T2組之間，發酵會產生大量蛋白酶，促進肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解，從而破壞肌肉的結構；T5組的牦牛肉不僅經過了發酵，還經過超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化，但該組的彈性、內聚性和咀嚼性均顯著高于T3組，且硬度顯著高于T2和T3組，其原因是發酵時大量產酸，使得肉中蛋白質變性加快，形成凝膠組織結構，肉的硬度和彈性增加[30]。

表2 不同嫩化處理對牦牛肉質構的影響Table 2 Effects of different tendering methods on texture of yak meat

注：表中數據表示為平均數，同列數字標有不同字母，表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

本文通過超聲波、木瓜蛋白酶、超聲波輔助木瓜蛋白酶、發酵、超聲波輔助木瓜蛋白酶+發酵5種嫩化方法對牦牛肉進行嫩化處理，研究不同嫩化方法嫩化后可溶性蛋白含量(CSP)、肌原纖維小片化指數(MFI)、質構特性及蛋白質降解的變化。相對于未處理的牦牛肉，5種嫩化方法都可對牦牛肉起到不同程度的嫩化作用，均可顯著提高牦牛肉CSP、MFI(P<0.05)，改善牦牛肉質構特征，顯著降低硬度、彈性、內聚性和咀嚼性(P<0.05)，其中超聲波輔助木瓜蛋白酶組對牦牛肉質構特性的改善最顯著，MFI最高，超聲波、木瓜蛋白酶和發酵3種方法結合處理的牦牛肉中CSP最多。經過SDS-PAGE電泳，不同嫩化處理對牦牛肉蛋白質有不同程度的降解，其中超聲波對蛋白降解程度低于其他處理組，木瓜蛋白酶和發酵對蛋白質的降解比較明顯，尤其是超聲波輔助木瓜蛋白酶結合發酵處理可將大分子蛋白顯著降解為小分子蛋白。