海藻糖快速檢測方法的建立與初步應用

苗佳，王彩喆，牛丹丹，Nokuthula Peace Mchunu，田康明*，Suren Singh，Kugenthiren Permaul，王正祥*

1(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457) 2(天津科技大學 化工與材料學院，天津 300457) 3(Biotechnology Platform, Agricultural Research Council, Pretoria 0001, South Africa) 4(Department of Biotechnology & Food Technology, Durban University of Technology, Durban 4001, South Africa)

海藻糖(Trehalose, α-D-glucopyranosyl-α- D-glucopyranoside)是由兩個葡萄糖殘基組成的非還原性二糖，天然存在于低等植物、細菌、真菌、昆蟲及無脊椎動物中[1-3]。在冷凍、干燥、加熱等逆性環境下，海藻糖被認為能夠與生物大分子形成氫鍵或在其周圍形成玻璃質，從而起到保護作用，是新型食品加工與保鮮的重要保護劑[4-5]。海藻糖在保存脂類、蛋白質等生物大分子以及干細胞、組織和器官等方面的應用，也受到研究者的關注[6]。

海藻糖的定量分析是對其進行研究和應用的技術基礎。目前常用的海藻糖定量分析方法包括比色法、高效液相色譜(HPLC)法和酶法。比色法是基于蒽酮與碳水化合物的顏色反應進行定量，不具有特異性[7-8]。HPLC法是目前定量分析海藻糖的主要方法，但其對樣品處理要求較高，且受特定設備條件限制[9-14]。酶法檢測利用海藻糖酶特異性水解海藻糖生成兩分子葡萄糖，通過對反應過程參數[12]或對其酶解產物葡萄糖的檢測[13, 15-18]而間接定量海藻糖，是亟待發展的海藻糖快速簡便檢測方法。

ANTONLLI等[14 ]使用海藻糖酶、己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，通過檢測NADPH生成量間接定量海藻糖，檢測限可達6.3 μmol/L；NEVES等[16]使用海藻糖酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，依據染料吸光度變化測定生成的O2，以此定量海藻糖檢測限可達50 μmol/L。此類方法特異性高，操作相對簡便，但較高的用酶成本限制其推廣應用。

鑒于葡萄糖快速定量檢測技術已經十分成熟，以固定化酶微電極為基礎的葡萄糖生物傳感分析儀已在我國發酵、食品研究及生產領域得到廣泛應用。為此，本文在前期獲得優秀海藻糖酶酶分子的基礎上，利用海藻糖酶對海藻糖的專一水解，結合葡萄糖生物傳感分析儀對海藻糖水解產物的快速定量檢測，建立起一種海藻糖快速檢測方法，并就其檢測特征與可能的應用價值進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻糖標準品購于Sigma公司；海藻糖酶(120 u/mL，一個酶活力單位定義為在pH 4.0和55 ℃條件下，每分鐘水解1 μmol海藻糖所需的酶量)為本實驗室前期制備與保存，另文發表；所用的其他化學品均為分析純。

大腸桿菌(Escherichiacoli) B0013-1031H、JC31和JC41，為本課題組前期構建。B0013-1031H 菌株的乙酸、乳酸、甲酸和琥珀酸的合成途徑被阻斷[19]，在此基礎上，刪除海藻糖分解途徑獲得突變株JC31，進一步強化海藻糖合成途徑獲得突變株JC41[20]。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶-生物傳感分析儀法檢測海藻糖含量

酶解反應體系(0.4 mL)包含適度稀釋的待測樣品(0.2 mL)、12 u海藻糖酶酶液(0.1 mL)和pH 4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(0.1 mL)；反應在55 ℃及pH 4.0條件下進行10 min。反應完成后快速冷卻，取樣用生物傳感分析儀(SBA-40C型，山東省科學院生物研究所)測定葡萄糖含量。由葡萄糖換算海藻糖含量如公式(1)所示：

CT=0.95×(C2-C1)

(1)

式中：CT，酶解反應體系中海藻糖含量，mg/mL；C1，酶解前葡萄糖含量，mg/mL；C2，酶解后葡萄糖含量，mg/mL；0.95，海藻糖與葡萄糖含量換算系數。

1.2.2 檢測方法的專一性

向1.0 mg/mL的海藻糖標準品中分別添加不同濃度的葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，用1.2.1中方法檢測海藻糖含量。

1.2.3 檢測范圍的確定

取不同濃度的海藻糖標準品，用1.2.1中方法檢測海藻糖，以樣品海藻糖含量為橫坐標(X)、所測葡萄糖含量為縱坐標(Y)繪制擬合曲線。

1.2.4 回收率的計算

取不同濃度的海藻糖標準品，用1.2.1中方法檢測海藻糖，用以下公式計算回收率：

(2)

式中：R，回收率，%；Cc，計算得出的海藻糖濃度，mg/mL；CK，已知的海藻糖濃度，mg/mL。

1.2.5 檢測方法的穩定性

取不同濃度海藻糖標準品，每個濃度做6個平行測定，計算6次檢測結果的相對標準偏差(RSD)。

1.2.6 HPLC法檢測海藻糖

參照GB/T 23529—2009推薦的方法[21]，選擇Luna 5u NH2100A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈∶水=70∶30(體積比)，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測器，進樣量10 μL。

1.2.7 大腸桿菌胞內海藻糖含量測定

各菌株劃線接種于LB平板，37 ℃過夜培養。挑單菌落接種于50 mL LB液體培養基，37 ℃、200 r/min培養12 h后，8 000 r/min離心5 min收集菌體，接種50 mL M9液體培養基(含5 g/L葡萄糖)，至OD600為0.1。再于37 ℃、200 r/min培養12 h后，不添加壓力因素，或分別添加葡萄糖和乙醇至終濃度為80 g/L和10 g/L，繼續培養4 h。同上離心收集菌體并洗滌，以去離子水重懸細胞，于-70 ℃冷凍過夜。取凍存細胞煮沸20 min，冷卻后12 000 r/min離心15 min，上清液即為細胞溶解產物。以本研究建立的方法檢測胞內海藻糖含量。

2 結果

2.1 海藻糖檢測專一性

在1.0 mg/mL的海藻糖溶液中分別添加不同濃度的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖，測定海藻糖的含量，結果匯總于表1。在其他外源糖存在的情況下，檢測海藻糖的回收率為99.12%～102.28%，5種外源添加糖分子對海藻糖的檢測結果均無影響?？梢姡痉ǖ膶Ｒ恍阅軌驖M足海藻糖的特異性檢測要求。

表1 外源糖存在條件下海藻糖的回收率Table 1 Recovery rate of trehalose in the presence of other saccharides

2.2 海藻糖檢測范圍

生物傳感分析儀可檢測葡萄糖的最低濃度為0.01 mg/mL，對應樣品中海藻糖的檢測限為0.019 mg/mL。用本方法檢測系列濃度的海藻糖標準品并計算相對標準偏差，結果表明，海藻糖濃度在0.1 mg/mL以上時，檢測RSD小于10 %，根據MILLER[22]建議原則，此方法檢測海藻糖的定量限為0.1 mg/mL。

以樣品海藻糖含量為橫坐標，以檢測所得葡萄糖含量為縱坐標，繪制擬合曲線如圖1所示。在海藻糖濃度為0.1～150.0 mg/mL范圍內，樣品海藻糖含量與檢測所得葡萄糖含量具有良好的線性關系。在此范圍內，檢測回收率在98.80%～101.33%。

圖1 海藻糖含量與葡萄糖釋放量之間的線性關系Fig.1 Linearity between trehalose content and detected glucose content

本檢測方法使用12 u海藻糖酶，在最適條件下反應10 min，理論可水解最高濃度約為200 mg/mL的海藻糖樣品。結果顯示樣品海藻糖濃度在150 mg/mL范圍內，能夠被完全水解為葡萄糖，通過生物傳感分析儀實現定量檢測；樣品海藻糖濃度高于150 mg/mL時，在此檢測條件下海藻糖不能被完全轉化為葡萄糖，無法實現海藻糖定量檢測。實際應用中，可根據樣品海藻糖濃度或檢測操作要求，調整海藻糖酶用量或反應時間，以降低檢測成本，提高檢測效率。

2.3 穩定性試驗

取低濃度(1.0 mg/mL)、中間濃度(10.0 mg/mL)及高濃度(100.0 mg/mL)3種海藻糖標準品，做平行檢測，結果匯總于表2。各濃度標準品6次平行檢測確定的相對標準偏差均小于3%。

表2 本研究方法檢測海藻糖的穩定性Table 2 Stability analysis of currently established method for trehalose determination

2.4 本法與HPLC法的比較

采用本研究建立的方法，同時采用HPLC法對已知濃度的海藻糖標準品(5.0 mg/mL)進行檢測，測定結果匯總于表3。

表3 兩種方法檢測海藻糖的差異性分析 單位：mg/mLTable 3 Analysis of differences between two trehalose determination methods

經t檢驗分析，在95%的置信區間下，二者無顯著差異(P>0.05)。HPLC法測定往往需要對樣本進行前處理，在多糖混合情況下還需對流動相組成進行合理優化才能將結構相似的糖類分開。本研究方法樣品前處理相對簡單，在保證準確性的同時極大地提高了檢測的時效性。

2.5 大腸桿菌胞內海藻糖含量分析

利用本研究建立的方法，對海藻糖代謝途徑遺傳修飾后大腸桿菌胞內海藻糖含量進行了分析，結果匯總于表4。運用本研究方法，可檢測到胞內海藻糖含量為2.35～83.39 mg/g (細胞干重)。海藻糖分解途徑刪除的突變株JC31以及在海藻糖分解途徑刪除的基礎上進一步強化海藻糖合成途徑的突變株JC41，在無滲透壓壓力或80 g/L葡萄糖下，突變株JC31和JC41的胞內海藻糖合成與積累水平顯著提高；在體積分數1%乙醇條件下，突變株JC31和JC41的胞內海藻糖合成與積累水平也顯著提高，但提升幅度不如80 g/L葡萄糖下顯著[20]。

表4 E. coli B0013-1031H及其突變株在不同培養條件下的胞內海藻糖含量 單位：mg/gTable 4 Intracellular trehalose content of E. coli B0013-1031H and its mutants under different stress conditions

3 討論

本文利用特異性海藻糖酶水解海藻糖生成葡萄糖，結合生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，成功建立起一種海藻糖的快速定量檢測方法。此方法對海藻糖的檢測限為0.019 mg/mL，定量限為0.1 mg/mL。在0.1～150.0 mg/mL范圍內，海藻糖含量與所測葡萄糖含量具有良好線性關系，回收率范圍為98.80%～101.33%。本方法操作簡便快捷，對樣品預處理無特殊要求，具有高特異性、較好的回收率和重復性，檢測結果與HPLC法無顯著差異，可以替代HPLC法用于海藻糖含量的快捷定量分析。

現有文獻顯示，海藻糖是環境脅迫下生物體自我保護的重要相容性溶質[23-24]，也是若干新鮮食物材料的基本組成和可能的重要營養物質[2, 25]。通過本研究獲得的海藻糖快捷定量分析方法，可以輔助若干工業菌種的選育過程，也可以在相關食品原材料的海藻糖含量分析與檢測中發揮重要作用。