pH值和比生長速率協同調控Streptomyces albulus合成ε-聚賴氨酸

王開方，潘龍，刁文嬌，陳旭升，毛忠貴

(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是由25～35個L-賴氨酸單體通過ε-氨基和α-羧基脫水縮合形成的一種同型氨基酸聚合物[1-2]。ε-PL具有抑菌范圍廣[3-4]、安全無毒[5]和熱穩定性高等特點，故廣泛用作食品防腐劑，目前已被多個國家使用[6-7]。

ε-PL的發酵工藝主要為pH控制策略。KAHAR等[8]開創了兩階段pH控制策略，即發酵前期(2 d)將pH控制在5.0以上，獲得更高的菌體量；后期將pH控制在4.0左右，快速合成ε-PL。經過連續8 d補料分批發酵，ε-PL產量達到48.3 g/L，成為當時的領先水平。任喜東等[9]建立了一種pH沖擊策略發酵生產ε-PL模式。前期控制pH為5.0，隨后讓pH自然下降，經12 h左右的沖擊(pH 3.0)后回調pH值至4.0左右，直至發酵結束。同樣經過連續8 d補料分批發酵，ε-PL產量達到54.7 g/L。大量研究表明，發酵過程中將pH控制在4.0左右是S.albulus積累ε-PL的先決條件[8，10-11]。目前，關于低pH促進S.albulus高產ε-PL的原因主要有2種觀點，第1種觀點認為，低pH能夠有效的抑制ε-PL降解酶(PL dehydrogenase, Pld)的酶活，防止產生的ε-PL被降解[12-13]；第2種觀點認為，ε-PL合成酶(PL synthetase, Pls)是一種依賴于ATP的非核糖體肽合成酶，低pH環境有利于胞內ATP的積累，從而促進ε-PL的合成[14]。

然而，低pH除了影響Pld酶活和胞內ATP濃度之外，還會對菌體生長速率產生影響[15]，而生長速率的不同又會影響微生物的代謝流分布[16-17]。王澤建等[18]研究發現：在糞產堿桿菌中，隨著比生長速率的升高(0.05 h-1到0.29 h-1)，葡萄糖流向菌體生長的比例從18%增加到了47%，流向凝膠多糖合成的碳去向分布由45%降低到了12%；在高比生長速率的情況下，更多的碳源流向菌體的生長以及副產物的生成。那么比生長速率是否也是影響ε-PL合成的一個重要原因呢？目前關于菌體比生長速率對ε-PL合成的影響尚未有研究報道。因此，本研究將通過恒化培養方式，研究不同pH和菌體比生長速率對S.albulusM-Z18合成ε-PL的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

StreptomycesalbulusM-Z18，本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

ATP檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，碧云天生物技術公司；ε-PL標準品，鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；葡萄糖(優級純)，西王藥業有限公司鄒平分公司；酵母粉，英國Oxoid公司；其他試劑(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

固體培養基(BNT)(g/L)：葡萄糖 10，酵母粉 1，魚粉蛋白胨 2，pH 7.5。

種子培養基(M3G培養基)(g/L)：葡萄糖 50，酵母粉 5，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，KH2PO41.36，K2HPO40.8，pH 6.8。

分批培養基(RSM培養基)(g/L)：葡萄糖 60，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.8， FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO44，pH 6.8。

恒化分批培養基(g/L)：葡萄糖20，其他成分與分批培養基相同。

恒化補料培養基(g/L)：葡萄糖22，其他成分與分批培養基相同。

1.1.4 儀器與設備

T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應器，迪比爾生物工程(上海)有限公司；BT100-1F/DG蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司；Synergy H4多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計，尤尼可儀器有限公司；AB204-N分析天平，瑞士梅特勒公司；3K15冷凍離心機，德國SIGMA公司；HYG-Ⅱ回轉式恒溫調速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設備有限公司；BS1100+電子天平，上海友聲衡器有限公司；GNP-9160恒溫培養箱，上海光都儀器設備公司；SBA-40C生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所。

1.2 培養方法

1.2.1 搖瓶種子培養

從活化的新鮮平板上刮取2環孢子接入裝有80 mL種子培養基的500 mL搖瓶中，200 r/min、30 ℃搖床培養24 h。

1.2.2 分批發酵

將培養好的種子液以體積分數8%接種量接入T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應器，裝液量為600 mL，溫度設置為30 ℃，通氣量1.0 vvm，初始轉速為200 r/min，溶氧設置為30%，轉速溶氧聯動控制。待pH分別自然下降至3.5、4.0、5.0和5.5時，用12.5%的NH3·H2O分別維持pH恒定直至發酵結束。期間每隔6 h取一次樣，測定菌體干重(DCW)、ε-PL濃度、葡萄糖濃度等參數，以考察不同pH控制模式對S.albulusM-Z18生長以及ε-PL合成的影響。

1.2.3 恒化培養

恒化培養在T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應器中進行，工作體積為600 mL，接種量為8%。分批階段：初始轉速為200 r/min，溶氧設置為30%，轉速溶氧聯動控制，直至葡萄糖基本耗完(18 h)，轉入恒化階段[19]。恒化階段：全程控制溫度為30 ℃，轉速為700 r/min，通氣量為1.0 vvm，分別控制pH為4.0、5.0和5.5，置換4～5個體積后均能達到穩定狀態(通過葡萄糖濃度、菌體干重、溶氧、ε-PL濃度等過程參數確定)。取穩定狀態菌液進行分析。

1.3 分析方法

1.3.1 ε-PL濃度的測定

采用甲基橙比色法[20]。

1.3.2 DCW的測定

取10 mL發酵液，5 000×g離心10 min后，棄上清，沉淀用去離子水洗滌、離心2次后，于105 ℃烘干至恒重(約24 h)。

1.3.3 葡萄糖濃度的測定

使用生物傳感分析儀進行測定。

1.3.4 胞內ATP濃度的測定

參照試劑盒說明書。

1.3.5 蛋白濃度的測定

參照試劑盒說明書。

1.3.6 動力學參數的計算[18，21-22]

比生長速率：使用Origin 9.0軟件按照Logistic方程非線性擬合得到生長曲線，再經Origin 9.0軟件進一步處理數據得出比生長速率曲線。

ε-PL比合成速率：方法類似于比生長速率。

恒化穩態時，比生長速率(μ，h-1)、稀釋率(D，h-1)、細胞得率(YX/S，g/g)、ε-PL得率(YP/S，g/g)、以菌體生長為基準的ε-PL得率(YP/X，g/g)、葡萄糖比消耗速率(qS，g/(g·h)以及ε-PL比合成速率(qP，g/(g·h)參照以下公式。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

qP=μ·YP/X

(6)

式中：F，補料速率，L/h；V，裝液量，0.6 L；c(X)，穩態時菌體干重，g/L；c(P)，穩態時ε-PL質量濃度，g/L；c(S)，穩態時葡萄糖質量濃度，g/L；c(S0)，補料液中的葡萄糖質量濃度，g/L。

2 結果與討論

2.1 pH對S. albulus M-Z18分批發酵的影響

微生物的生長需要一定的酸堿度，鏈霉菌的最適生長pH為中性偏堿性[23-24]。pH通過影響微生物細胞膜的電荷、酶活、營養物質和中間代謝產物的解離等進而影響微生物生長和產物合成[25]。pH對S.albulusM-Z18分批發酵結果如圖1所示，隨著分批發酵進行，pH值由初始6.8逐步下降至pH 5.5(13 h)、pH 5.0(14 h)、pH 4.0(14.5 h)和pH 3.5(15 h)，隨后依靠自動流加氨水將分批發酵過程控制在不同的pH進行。由圖1-a可知，不同pH對S.albulusM-Z18菌體生長產生了顯著影響，受控pH越高，發酵結束時菌體量就越高，該實驗結果與前期研究保持一致[18]。pH 3.5時，最終生物量為(11.62±0.40)g/L，僅為pH 5.5時的一半[(22.53±0.42 g/L]。另外，在分批發酵分別達到受控pH值后(15 h)，μpH 3.5約為0.04 h-1，μpH4.0約為0.07 h-1，μpH 5.0約為0.10 h-1，μpH 5.5約為0.13 h-1(圖1-b)，表明分批發酵受控pH, pH值越小，S.albulusM-Z18比生長速率越低。然而，ε-PL產量在pH 3.5時最高，達到(5.24±0.10) g/L；當pH高于5.0時，發酵液中檢測不到ε-PL(圖1-c)。通過對ε-PL比合成速率分析發現，ε-PL快速合成階段主要集中于18～27 h左右。24 h之后，ε-PL比合成速率顯著下降。在大部分時間里，pH 3.5時ε-PL比合成速率高于pH 4.0時(圖1-d)。因此，S.albulusM-Z18在低pH環境下積累ε-PL與菌體生長速率存在一定關聯。

a-菌體生長；b-比生長速率；c-ε-PL產量；d-ε-PL比合成速率圖1 pH值對分批發酵過程參數的影響Fig.1 Time profiles during batch fermentation at different pH

2.2 pH對S. albulus M-Z18恒化培養積累ε-PL的影響

恒化培養可以通過改變稀釋率及限制性基質的種類和濃度靈活地控制微生物細胞的比生長速率。通過恒化培養可以使微生物細胞達到“穩態”，故常常被用于微生物生理方面的研究[26-27]。本文通過控制D=0.04 h-1，研究不同pH(4.0，4.5，5.0)對S.albulusM-Z18合成ε-PL的影響(在稀釋率為0.04 h-1時，pH 3.5不能建立恒化體系)，如圖2a-c所示，隨著pH值升高，S.albulusM-Z18生物量逐漸增大，而ε-PL質量濃度逐漸減小。在pH 4.0時，生物量為(8.19±0.05) g/L，ε-PL濃度為(2.43±0.04) g/L；在pH 5.0時，生物量為(12.19±0.14) g/L，ε-PL質量濃度為(0.76±0.02) g/L；在pH 5.5時，生物量為(15.63±0.09) g/L，ε-PL質量濃度為0 g/L。實驗結果表明，pH值對于恒化條件下的菌體生長和ε-PL合成影響，與上述分批發酵結果基本一致：低pH有利于ε-PL合成，而不利于菌體生長。進一步動力學參數分析發現，隨著pH值降低，細胞得率(YX/S)逐漸減小，葡萄糖比消耗速率(qS)逐漸增大，ε-PL比合成速率(qP)也逐漸增加。特別是在pH 4.0時，YX/S最低(0.376 g/g)，qS最高(0.106 g/(g·h))，qP最大(0.012 g/(g·h))(表1)。這表明，低pH時，細胞會快速消耗葡萄糖用于ε-PL的合成。胞內ATP濃度檢測發現(圖2-d)，在pH 4.0時，胞內ATP濃度最高為(7.11±0.80) nmol/mg蛋白，而pH 5.0與pH 5.5胞內ATP濃度分別只有(4.23±0.43) 和(2.66±0.70) nmol/mg蛋白。這表明，pH值越低越有利于胞內ATP積累。事實上，ε-PL合成依靠的ε-PL合成酶是一種依賴于ATP濃度的非核糖體肽合成酶，即ATP濃度越高，酶活越高[14]，ε-PL合成速率就越快。另外，已有的研究表明S.albulus中存在2種ε-PL分解酶，它們的最適pH為7.0左右，且酶活會隨著pH降低而逐漸減小，在pH 4.0時酶活基本喪失[12-13]。綜上，在菌體比生長速率相同情況下，低pH一方面抑制了分解酶活性，另一方面使得底物葡萄糖更多地用于ATP和ε-PL合成，從而有利于ε-PL積累。

a-pH 4.0；b-pH 5.0；c-pH 5.5；d-胞內ATP含量圖2 S. albulus M-Z18在不同pH下的恒化培養(D=0.04 h-1)過程參數和胞內ATP含量Fig.2 Time profiles and intracellular ATP concentrations of S. albulus M-Z18 in chemostat (D=0.04 h-1) at different pH

表1 不同pH值下S. albulus M-Z18恒化培養(D=0.04 h-1)動力學參數Table 1 Kinetic paraments of S. albulus M-Z18 in chemostat (D=0.04 h-1) at different pH

2.3 比生長速率對恒定pH 4.0條件下S. albulus M-Z18合成ε-PL的影響

S.albulusM-Z18在pH 4.0條件下，不同稀釋率的恒化培養體系中達到“穩態”時(D=0.08 h-1有輕微洗脫現象)，μ=0.04、0.06和0.08 h-1的生物量分別為(8.19±0.05)、(7.83±0.04)和(6.81±0.07) g/L；ε-PL濃度分別為(2.43±0.04)、(2.29±0.06)和(1.68±0.06) g/L(圖3a-c)。隨著菌體比生長速率的增加(稀釋率升高)，qS和qP均呈逐漸增加趨勢(表2)。相比于D=0.04 h-1、D=0.06 h-1時，qS和qP分別提高了43%和50%；相比于D=0.06 h-1、D=0.08 h-1時，qS提高了70%，而qP只提高了11%。

表2 不同稀釋率S. albulus M-Z18恒化培養(pH 4.0)動力學參數Table 2 Kinetic paraments of S. albulus M-Z18 in chemostat (pH 4.0) at different dilution ratios

另外，不同稀釋率恒化體系中菌體胞內ATP濃度檢測發現，稀釋率為0.04、0.06和0.08 h-1時，胞內ATP濃度分別為(7.11±0.80)、(12.98±0.45)和(16.06±1.41) nmol/mg蛋白。相比于D=0.04 h-1、D=0.06 h-1胞內ATP增加了82.5%左右，約6 nmol/mg蛋白。而相比于D=0.06 h-1、D=0.08 h-1胞內ATP僅增加了23.7%，約3 nmol/mg蛋白。綜上，在恒定pH 4.0時，菌體比生長速率越高，底物葡萄糖消耗速率、ε-PL比生成速率和胞內ATP濃度就越大，而細胞得率和ε-PL得率(YP/S)卻在總體下降。由此可以看出，隨著菌體比生長速率提高，底物葡萄糖消耗速率加快，更多的葡萄糖流向了菌體合成和ATP生產，但是ε-PL比生成速率提高不顯著，而YP/S下降明顯(特別是在D=0.08 h-1時)，故過高的菌體比生長速率會降低發酵的經濟性。因此，在發酵過程中，除了將pH控制在合適范圍內，也需要調節菌體的生長速率保持在合理區間(如0.06 h-1左右)，才能實現ε-PL的最高效發酵。

a-0.04 h-1；b-0.06 h-1；c-0.08 h-1；d-胞內ATP含量圖3 S. albulus M-Z18在不同稀釋率的恒化培養(pH=4.0)過程參數和胞內ATP含量Fig.3 Time profiles and intracellular ATP concentrations of S. albulus M-Z18 in chemostat (pH 4.0) at different dilution ratios

3 結論

為了探究ε-PL發酵過程的關鍵影響因素，本文從發酵動力學角度，分析了pH值和菌體比生長速率對ε-PL發酵過程參數的影響。研究結果表明，發酵過程控制pH在4.0左右，不僅可以抑制ε-PL分解酶活性，同時使得底物葡萄糖更多地用于ATP和ε-PL合成，從而有利于ε-PL的積累；另外，維持菌體比生長速率在合理區間(0.06 h-1左右)，也是獲得ε-PL高效積累的重要控制條件。因此，在發酵過程中將pH控制在較低水平，不僅能夠抑制分解酶活性、提高胞內ATP濃度，還可以將菌體生長控制在合適的速率范圍，最終共同調控了ε-PL大量積累?；谏鲜霭l現，在ε-PL補料分批發酵過程中(pH沖擊模式)，當菌體增長緩慢時，可通過流加有機氮源(如酵母粉)促進菌體生長；而當菌體增長過快，可通過適當下調pH，以維持細胞比生長速率在0.06 h-1左右，進一步達到高產ε-PL的目的。