益生菌復配富鉻酵母緩解2型糖尿病的作用機制涉及調節腸道菌群失調

周興婷，于雷雷，翟齊嘯，田豐偉，趙建新，張灝，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

腸道菌群作為人體組成的一個重要部分，發揮著重要而又特殊的營養代謝和腸道屏障保護功能。近年來，越來越多的研究表明2型糖尿病的發生與腸道菌群失調有著密切的關系。腸道菌群在宿主體內具有與病原體競爭性定殖、發展免疫系統和腸道屏障系統的功能[1]。腸道菌群失調會導致機體免疫力下降、慢性炎癥反應和能量代謝失衡等一系列并發癥，這些會進一步導致代謝紊亂和胰島素抵抗[2]，最終形成2型糖尿病。2型糖尿病是以胰島素抵抗、葡萄糖耐量降低和低度炎癥引發的以高血糖為特征的代謝紊亂癥之一[3]。國際衛生組織預測2025年糖尿病患者數量將突破3億，而中國是世界上糖尿病患者數居第2的國家，主要以2型糖尿病為主[4]，目前大量研究表明，2型糖尿病會導致小鼠腸道菌群擬桿菌門豐度下降，厚壁菌門豐度上升[5]。對腸道菌群的調節成為當前的一種干預和治療2型糖尿病的新策略。腸道菌群的可塑性將發展為一種很有前途的治療手段[6]。乳酸菌屬于益生菌的種類之一，近些年對乳酸菌的研究日益增多，益生菌由于其益生性和安全性已經被廣泛地應用于發酵食品，且乳酸菌對改善2型糖尿病的癥狀具有顯著的效果，鼠李糖乳桿菌CRL981能夠顯著緩解高血糖水平，調節機體血脂水平和抗氧化酶的活力[7]。富鉻酵母產品具有很好的降糖效果，能夠顯著緩解糖尿病相關癥狀，因其效果顯著和安全性高的特點在市場上被廣泛應用于糖尿病人群的飲食干預。鉻參與糖代謝，調控胰島素功能，從而發揮降糖效果。本文通過研究2株具有顯著降糖效果的乳桿菌，植物乳桿菌X1和鼠李糖乳桿菌CCFM0528與富鉻酵母進行復配組合，應用于2型糖尿病小鼠模型中，探究其復配劑是否具有協同增效的作用，其緩解機制是否涉及調節腸道菌群失調。本研究的成果將為益生菌復配劑應用于2型糖尿病的干預治療提供重要參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

植物乳桿菌(X1)、鼠李糖乳桿菌(CCFM0528)，江南大學食品生物中心菌種保藏中心；富鉻酵母，安琪酵母股份有限公司；鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)，sigma公司；基因組提取試劑盒Fast DNA?SPIN Kit for Feces，美國MP公司；DNA回收試劑盒TIANgel Mini Purification Kit，天根生化科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、無水葡萄糖、無水乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4、檸檬酸氫二鈉、K2HPO4·3H2O、吐溫80、乙酸、丙酸和丁酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

小型冷凍離心機，德國Hettich有限公司；大容量冷凍離心機，美國Beckman公司；高速冷凍離心機，Eppendorf公司；隔水式恒溫生物培養箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1CV型微生物操作超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；EL204型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯用，島津中國公司；PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；MiSeq測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳桿菌的活化與培養

從-80 ℃冰箱中取出乳桿菌的保菌管，在乳酸細菌培養基(MRS) 固體平板上劃線，挑出單菌落接種到MRS液體培養基后于37 ℃培養18 h，之后以1%～2%(體積分數)的接種量接種于MRS液體培養基中在37 ℃培養18 h，連續活化3代后用于后續實驗。

1.3.2 益生菌復配劑的制備

將活化菌株按1%(體積分數)的接種量接種于1 L的液體培養基中擴大培養，37 ℃恒溫培養下培養18 h后，在4 ℃，6 000 r/min的條件下離心10 min后獲得菌泥，無菌生理鹽水沖洗3次，用10%(質量分數)的脫脂乳作為保護劑重懸，冷凍干燥后，與富鉻酵母進行復配，其中小鼠每日攝入每種乳桿菌含量為109CFU，富鉻酵母按小鼠每日鉻攝入量100 μg/kg為標準進行復配。小鼠灌胃之前，用無菌生理鹽水重懸調整菌液濃度為5×109CFU/mL，富硒酵母為5 mg/mL，并在37 ℃水浴中復蘇30 min后使用。

1.3.3 動物實驗

1.3.3.1 益生菌復配劑的降糖效果評價實驗

選取50只體重相近的3周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，喂養程序經江南大學動物管理和使用委員會的許可(許可證號：JN.No 20180115c0700613[24])。實驗動物房常年恒溫恒濕，保持溫度在(22±2)℃和濕度在(55±5)%的范圍內，并嚴格遵循12 h晝夜循環標準。適應性喂養1周，喂食普通飼料，1周后隨機分為5組，分別為空白組、模型組、藥物組、乳酸菌組、復合組。分組后前5周實驗期間，正常組喂食普通飼料，其余各組喂食高脂飼料，同時正常組、模型組、藥物組灌胃脫脂乳，乳酸菌組喂食混合乳酸菌溶液、復合組喂食益生菌復配劑。第5周，所有小鼠禁食8 h以上，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠注射新鮮的鏈脲佐菌素STZ(按100 mg/kg體重注射)。造模1周后，所有小鼠開始喂食普通飼料，同時正常組和模型組灌胃脫脂乳，藥物組開始灌胃鹽酸二甲雙胍(按10 mg/kg體重灌胃)，乳酸菌組喂食混合乳酸菌溶液、復合組喂食益生菌復配劑。

1.3.3.2 小鼠糞便腸道菌群的測定[8]

在收集小鼠糞便之后，準確稱量500 mg的小鼠糞便樣品，利用Fast DNA?SPIN Kit for Feces試劑盒提取糞便樣品中的DNA。以提取到的DNA為模板，經過PCR擴增16S rDNA的V3、V4區。PCR體系為50 μL，上游引物341 R，下游引物806 R。擴增結束之后，制作瓊脂糖凝膠，點樣后進行電泳，利用電泳操作來進行DNA條帶的分離，對條帶亮區進行切膠回收，將得到的DNA利用Qubit 3.0測定樣品的DNA濃度，然后經Illumina MiSeq測序儀進行上機測定。上機測定完成之后，獲得下機數據地址，根據bacode表篩選出正確的樣品標簽，制定出Mapping_File文件，利用SSH Secure Shell Client軟件進行數據提取和合并。去除嵌合體序列，進行OTU聚類，選取OTU代表性序列以進行后續分析。通過對序列進行分類，制定biom格式的OTU表。隨后將otu_table.biom文件轉換可讀的OTU_table.txt文件，根據otu_table.biom進行α、β多樣性分析和腸道菌群門屬水平種類與豐度的多樣性分析。

1.3.3.3 小鼠糞便短鏈脂肪酸的測定[8]

收集糞便之后，放在凍干平板上進行凍干處理脫去水分之后，準確稱取50 mg樣品放入500 μL飽和NaCl溶液中進行破碎處理，然后加入20 μL H2SO4溶液進行酸化處理，處理完之后加入1 mL乙醚溶液進行短鏈脂肪酸的提取，將上清液倒入無水Na2SO4固體中進行脫水處理，樣品制備完成后轉移至棕色進樣瓶中，利用氣相色譜-質譜聯用技術來檢測小鼠糞便中的乙酸、丙酸、丁酸中的表達量。

1.4 實驗數據處理

實驗數據以平均值±標準差表示，數據分析采用One-way ANOVA分析，作圖采用Graphpad 8.0。

2 結果與分析

2.1 小鼠腸道菌群α多樣性和β多樣性分析

為了研究乳酸菌與富鉻酵母的復配是否對糖尿病小鼠的腸道菌群結構具有調節作用，通過16S rDNA擴增子測序的方法來分析小鼠糞便中腸道菌群的組成與豐度，分析不同組別間小鼠菌群的α多樣性和β多樣性，α多樣性和β多樣性一起構成了小鼠菌群的總體多樣性或一定區域的生物異質性。Chao1指數反映了小鼠糞便菌群的豐富性，Shannon指數反映了小鼠糞便菌群的多樣性。結果如圖1-A所示，造模組小鼠菌群豐富度明顯下降，這與IN KIELER等[9]的研究結果一致；如圖1-B所示，各組小鼠Shannon指數并沒有顯著性差異，這說明各組小鼠之間菌群多樣性沒有顯著差異，這與HAN等[10]的研究結果一致。圖1-C結果顯示模型組集中在PCA圖的右下角，藥物組、乳酸菌組、復合組與空白組聚集混合在一起，集中在PCA圖中上方，這說明糖尿病會引起小鼠腸道菌群發生改變，不同的干預治療方式會帶來不同程度菌群結構的恢復。

A-菌群豐富度；B-shannon指數；C-主成分分析圖1 不同組別小鼠糞便菌群的α多樣性、β多樣性Fig.1 Alpha diversity, beta diversity of gut microbiota in different groups of mice注：#代表與空白組比較有顯著差異，P<0.05；*代表與造模組比較有顯著差異，P<0.05。下同。

2.2 小鼠腸道菌群門水平上菌群變化

如圖2所示，小鼠糞便菌群在門水平上，主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia) 和變形菌門(Proteobacteria) 組成。圖2結果顯示，經STZ造模后的糖尿病小鼠在門水平上，Firmicutes豐度明顯上升，Bacteroidetes豐度明顯下降(P<0.05)，這與CAO等[11]的研究結果相一致。

圖2 不同組別小鼠腸道菌群的門水平豐度Fig.2 The phylum level of gut microbiota in different groups of mice

Firmicutes和Bacteroidetes是腸道菌群門水平上最主要的組成成分，相對豐度達到70%～90%，腸道內Firmicutes與Bacteroidetes的比例增大時會導致機體更加有效地吸收食物中的熱量，從而導致肥胖，研究表明肥胖導致的腸道菌群失調，是誘發2型糖尿病的原因之一。在實驗前期通過喂食高脂飼料來誘導糖尿病模型，如圖3所示。

A-擬桿菌門；B-厚壁菌門圖3 不同組別小鼠糞便菌群的Bacteroidetes和Firmicute豐度Fig.3 Bacteroidetes and Firmicute abundance of gut microbiota in different groups of mice

模型組小鼠Bacteroidetes明顯下降，Firmicutes明顯上升，而經過治療后，藥物組、乳酸菌組和復合組的Bacteroidetes和Firmicute的相對豐度均有所恢復，這說明藥物組發揮了一定的緩解效果，乳酸菌組和復合組的結果顯示，二者均能夠顯著回調Bacteroidetes和Firmicute的豐度，一定程度緩解2型糖尿病導致的腸道菌群失調。

2.3 小鼠腸道菌群屬水平上的差異

從門水平上進行分析，發現2型糖尿病模型會導致腸道菌群發生紊亂，為了進一步探究2型糖尿病在屬水平上的差異，利用數據分析軟件進一步分析屬水平上菌群的相對豐度。如圖4所示，小鼠菌群在厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、多爾氏菌屬(Dorea)、理研菌屬(Rikenellaceae-g_)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Akk菌屬(Akkermansia) 等水平上發生了明顯改變。

圖4 不同組別小鼠腸道菌群的屬水平豐度Fig.4 Genus abundance of gut microbiota in different groups of mice

如圖5-A所示，與空白組相比，在屬水平上，模型組中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Akk菌屬(Akkermansia) 和瘤胃球菌屬(Ruminococcus) 豐度明顯減少(P<0.05)，經過干預治療后，復合組小鼠Bifidobacterium、Lactobacillus和Akkermansia菌群豐度均有明顯回升(P<0.05)，但是Ruminococcus豐度增加但是沒有顯著性差異。

Bifidobacterium和Lactobacillus是一類居住在腸道內并發揮多種益生作用的微生物，它們可以維護人體健康和調節免疫功能，部分菌株可以有效抑制血糖的增長，達到緩解2型糖尿病的效果[12]。研究發現Bifidobacterium的豐度與腸道內毒素水平存在顯著負相關關系[13]，內毒素可以激活TLR4 /MyD88/NF-κB途徑，釋放炎癥因子，導致細胞胰島素抵抗(IR)。糖尿病小鼠由于機體炎癥水平導致雙歧桿菌豐度下降，而經過干預處理后，其豐度有所回升。Lactobacillus可以抑制誘導自身免疫性糖尿病的CD4+T細胞和細胞因子(IL-2) 的產生，同時可以抑制胰島β細胞的自身免疫性破壞[14]。胰島β細胞的破壞加劇了2型糖尿病的癥狀，在經過乳桿菌干預治療后，可以明顯改善機體2型糖尿病的病癥。Ruminococcus[15]是一類革蘭氏陽性厭氧菌，是發酵產生丁酸的腸道微生物主要成員之一，丁酸是碳水化合物和脂肪代謝途徑的核心，通過影響短鏈脂肪酸的含量來影響2型糖尿病患者的血糖水平。Akkermansia[16]是人體腸道中一種可降解黏蛋白的細菌，它與肥胖、糖尿病、炎癥和代謝紊亂呈負相關，研究發現Akkermansia可以顯著增強機體的葡萄糖耐受性并減弱脂肪組織炎癥。2型糖尿病小鼠葡萄糖耐受性明顯下降且伴隨組織炎癥[17]，造模后導致模型組小鼠Akkermansia豐度明顯下降，而喂食乳酸菌和富鉻酵母能夠明顯增加了Akkermansia屬豐度。說明喂食乳酸菌和富鉻酵母能夠在一定程度緩解2型糖尿病造成的腸道菌群紊亂。

與空白組相比，在屬水平上，模型組厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、糞球菌屬(Coprococcus)、多爾氏菌屬(Dorea)、理研菌屬(Rikenellaceae-g_) 明顯增多(P<0.05)。經過干預治療后，復合組能夠顯著降低Anaerostipes、Coprococcus和Rikenellaceae-g_菌群豐度(P<0.05)。

Anaerostipes[18]是一類革蘭氏陽性致病菌，其致病物質主要是外毒素，可引起局部炎癥，當外毒素入血后引起全身中毒癥狀，常損傷心肌與外周神經，Anaerostipes與2型糖尿病宿主機體炎癥水平息息相關。Coprococcus[19]是一類革蘭氏陽性厭氧菌，與腸道健康、胃腸道功能和炎癥水平息息相關。Dorea[20]是腸道中主要的產氣菌，利用碳水化合物產氣，與腸易激綜合征有關。Rikenellaceae[21]是一類存在于腸道內的致病菌，與艾滋病、胃癌和炎性腸病等疾病的發生息息相關。Anaerostipes、Coprococcus和Rikenellaceae是腸道內存在的致病菌，能夠加劇機體炎癥水平，其致病物質內毒素進入機體后，會通過TLR4/MyD88/NF-κB等途徑在機體內釋放炎癥因子，導致機體炎癥，破壞機體健康狀態，胰島β細胞被破壞，誘導2型糖尿病的形成，同時也會導致一系列并發癥的發生，如炎癥性腸病。2型糖尿病小鼠腸道穩態遭到破壞，其致病菌的豐度升高，進一步加劇了腸道穩態失調。

A-雙歧桿菌屬；B-乳桿菌屬；C-Akk菌屬；D-壓氧棒球菌屬；E-類球菌屬；F-瘤胃球菌屬；G-多爾氏菌屬；H-理研菌屬；I-分類■理研圖5 不同組別小鼠腸道菌群的不同菌屬豐度Fig.5 Different species abundance of gut microbiota in different groups of mice

2.4 造模組和復合組間菌群差異分析

對小鼠糞便門水平和屬水平上菌群豐度的分析，發現復配配方能夠在一定程度緩解2型糖尿病造成的腸道菌群穩態失調的癥狀，利用LEfse分析對模型組和復合組2組之間進行比較，進行亞組分析，從而找到這2組間在豐度上具有顯著差異的物種，分析結果如圖6所示。

圖6 造模組和復合組的進化分支圖和LDA值分布柱狀圖Fig.6 Model and cocktail group evolutionary branch diagram and LDA score diagram

模型組小鼠厚壁菌門(Firmicutes)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichi) 存在顯著差異，且厚壁菌門(Firmicutes)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichi)、咸海鮮球菌(Jeotgalicoccus)、副桿菌屬(parabacteroides) 和支原菌屬(Allobaculum) 豐度上明顯增加。復合組小鼠擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria) 和放線菌綱(Actinobacteria) 存在顯著差異，且擬桿菌門(Bacteroidetes)、Akk菌屬(Akkermansia) 和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium) 豐度上明顯增加。

2.5 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量結果

短鏈脂肪酸與2型糖尿病之間有著密切關系，短鏈脂肪酸是由某些腸道菌群通過復雜的多糖發酵產生，主要以乙酸、丙酸和丁酸為主，在能量代謝、葡萄糖穩態、脂肪生成調節和免疫調節過程中發揮重要作用[22]。糖尿病會導致短鏈脂肪酸水平降低并改變腸道微生物的代謝活性，導致腸道菌群的生態失調[23]。乙酸由宿主體內多種厭氧菌產生，在細胞中，乙酸是碳水化合物和脂肪代謝途徑的核心，并且在這些過程中與輔酶A結合[24]，在結腸和體循環中濃度最高。丙酸也是通過細菌發酵產生的，一部分進入體循環后可作為糖異生的產物，與機體血糖控制有關，并且其可作為奇數鏈脂肪酸代謝的中心產物，具有一定的潛在毒性，奇數鏈脂肪酸分解所必需的酶會導致丙酸等毒素在循環中積聚，導致嘔吐、脫水、酸中毒、低肌張力、癲癇發作和嗜睡[25]。丁酸大部分直接作用于腸道，與2型糖尿病的保護作用密切相關[26]，其可以通過降低LPS易位來減輕機體炎癥，同時可以激活小鼠結腸細胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ，抑制兼性厭氧致病菌的生長，促進健康腸道菌群[27]。小鼠糞便總酸水平如圖7(A) 所示，造模組小鼠糞便中總酸含量明顯下降(P<0.05)，而二甲雙胍藥物組經藥物治療后，總酸含量明顯回升，與空白組沒有明顯差異，這說明藥物組治療效果明顯，且乳酸菌組總酸含量較模型組有所上升，復合組總酸含量上升明顯，與模型組有顯著性差異(P<0.05)，這說明復合組治療效果顯著，且優于乳酸菌組。如圖7(B～D) 所示為小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量，發現模型組小鼠三者含量明顯下降(P<0.05)，這與CAO等[11]的研究一致，糖尿病會導致短鏈脂肪酸含量下降，可能是因為糖尿病導致腸道菌群穩態失調，促進致病菌生長，抑制有益菌生長，降低腸道內的發酵反應，減少短鏈脂肪酸的生成，而藥物組、乳酸菌組、復合組乙酸、丙酸和丁酸水平明顯回升，均展現出較好的治療效果。

A-總酸；B-乙酸；C-丙酸；D-丁酸；E-相關性分析圖7 不同組別小鼠總酸、乙酸、丙酸和丁酸含量及相關性分析Fig.7 Total acid, acetic acid, propionic acid and butyric acid in different groups of mice and correlation analysis

短鏈脂肪酸是由某些腸道微生物通過復雜的多糖發酵產生，通過數據來解析短鏈脂肪酸生成與腸道微生物之間的相關性，結果如圖7-E所示，發現Lactobacillus和Ruminococcus與短鏈脂肪酸的生成呈正相關性，且與乙酸、丁酸和丙酸的生成呈正相關性，而Akkermansia和Bifidobacterium與丁酸的生成呈正相關性。GABRIELLA等[28]研究發現，乳桿菌NCFM和動物雙歧亞種能夠顯著增強人結腸模型中短鏈脂肪酸的產生，尤其是乙酸、丙酸和丁酸。Ruminococcus[29]是公認的產丁酸的菌，丁酸的減少會促進炎癥并破壞正常的腸道屏障功能，患有2型糖尿病的個體在其腸道中表現出產丁酸菌豐度的下降，Rikenellaceae_g_與Dorea是腸道內的致病菌，與乙酸、丙酸和丁酸的生成呈明顯的負相關性，說明Rikenellaceae_g_與Dorea豐度的增加在一定程度上抑制了腸道微生物發酵生成短鏈脂肪酸。ZHANG等[30]研究發現，利用E.gardneri水提取物可以調節腸道微生物，模型組中腸道菌群發生明顯的Rikenellaceae_g_與Dorea豐度上升，出現乙酸和丙酸下降，干預治療后，菌群豐度下降，短鏈脂肪酸產量增多。短鏈脂肪酸與腸道微生物之間的相關性分析可以發現Lactobacillus、Ruminococcus等腸道有益菌可以促進短鏈脂肪酸的產生，促進腸道健康，而Rikenellaceae_g_與Dorea等腸道致病菌的滋生會破壞腸道菌群穩態，加劇機體炎癥水平。乳酸菌組和藥物組均起到改善腸道菌群穩態失調的癥狀。

3 結論

通過將具有緩解2型糖尿病能力的植物乳桿菌X1、鼠李糖乳桿菌CCFM0528與富鉻酵母進行復配，應用于高脂飼料和STZ誘導的2型糖尿病模型，發現藥物組發揮了緩解2型糖尿病的作用，而乳酸菌組與復合組能夠有效增加乙酸、丙酸和丁酸含量，改善腸道菌群的豐度，增加有益菌Bifidobacterium、Lactobacillus、Akkermansia和Ruminococcus豐度，減少致病菌Anaerostipes、Coprococcus、Dorea和Rikenellaceae-g_的豐度，在一定程度上緩解了2型糖尿病的腸道失調。其中復合組相比乳酸菌組的保護效果更顯著，更顯著增加Lactobacillus的豐度，降低Coprococcus和Rikenellaceae-g_的豐度，同時短鏈脂肪酸含量被顯著增加。綜上，復合組對2型糖尿病小鼠腸道菌群失調具有最顯著的改善作用。本研究的成果將為益生菌復配劑應用于2型糖尿病的干預治療提供重要參考依據。