產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及產酶條件優化

劉文靜，程晗，陳崇藝，柴春月*，田龍,2，周索

1(南陽師范學院 生命科學與技術學院，河南 南陽，473061) 2(河南省菌類食品工程技術研究中心，河南 南陽,473061)

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)即纖維二糖酶(cellobias，CB)[1]，可催化水解烴基或芳香基與糖基原子團間的糖苷鍵，生成葡萄糖并釋放相應的配基[2]。高活性的β-葡萄糖苷酶可有效降解纖維二糖，從而提高纖維素酶系的作用效率[3]。此外，β-葡萄糖苷酶在食品、紡織、飼料、造紙和醫藥等領域都有廣泛應用[4-5]。

β-葡萄糖苷酶存在于多種生物體中[6]。植物源β-葡萄糖苷酶活性低且不穩定，目前國內外研究所用的β-葡萄糖苷酶主要來源于微生物[7]。2016年，YAO等[8]利用基因工程手段對草酸青霉進行改造，得到了優良的產β-葡萄糖苷酶突變菌株；2017年，李永博等[9]從濃香型大曲中分離出1株β-葡萄糖苷酶活力達到55.7 U/mL的枯草芽孢桿菌；2018年，王鳳梅等[10]從340株葡萄酒相關酵母菌株中篩選得到66株產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株并研究了部分菌株的理化性質。多項研究表明，從自然界分離所得菌株的β-葡萄糖苷酶活力普遍偏低[11]，運用各種誘變手段對野生菌種進行改造，是獲得高產酶活力菌株的有效方法之一[12]。

誘變育種具有高效便捷的優點，常用的誘變方法有物理誘變、化學誘變、常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變等[13]。用單一的誘變方式得到目的突變株的可能性較低，復合誘變是一種能夠大大提高菌株正向突變概率的方法[14]。本研究從腐木樣品中分離得到1株產β-葡萄糖苷酶的青霉菌株；先后用ARTP誘變和硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)誘變方法對該菌株進行誘變，結合七葉苷平板法[15]初篩和搖瓶發酵復篩，最終獲得酶活力顯著提升且遺傳穩定的突變株；最后通過響應面法[16-18]對所得突變菌株的產酶發酵條件進行優化，進一步提高其酶活力。本實驗旨在為產β-葡萄糖苷酶菌株的開發和應用提供高效菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

2018年1月份，在河南南陽獨山森林公園隨機挑選10個地點，每個地點相距約500 m，采集腐木樣品，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內，封袋，并在每個袋上記錄下取樣地點和時間，置于4 ℃保存，備用。

1.1.2 儀器與設備

ZWYR-D2403恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；ARTP誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；JW-2019H臺式高速離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；V-1200分光光度計，翰藝儀器(上海)有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)培養基：200 g土豆去皮切塊，加純水煮沸30 min后用4層紗布過濾，將濾液用ddH2O定容至1 L，分別加入20 g葡萄糖和15 g瓊脂粉，完全溶解后分裝入三角瓶中，待滅菌。

七葉苷培養基：蛋白胨10 g，酵母粉3 g，NaCl 5 g，七葉苷0.1 g，檸檬酸鐵銨0.2 g，加dd H2O 1 L，溶解后加入15 g瓊脂粉，混勻分裝入三角瓶中，待滅菌。

基礎發酵培養基(每100 mL)：3 g麩皮，0.4 g (NH4)2SO4，0.6 g KH2PO4，0.1 g MgSO4·7H2O，0.05 g CaCl2，0.01 g FeSO4。

所有培養基均在0.1 MP，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選

分別稱取采集于10個不同地點的腐木樣品5 g，在無菌研缽中充分研碎，過40目篩，除去雜質和未研碎的大顆粒物。將所有腐木粉置入100 mL無菌離心管內，在振蕩器上連續振蕩10 min，將樣品混勻。從上述混合樣品中稱取1 g腐木粉，加20 mL ddH2O，轉入100 mL無菌錐形瓶中，28 ℃，150 r/min振蕩30 min，取出靜置20 min，取上清液以10倍的濃度梯度差進行稀釋，分別將10-3、10-4和10-5倍稀釋液涂布于PDA平板(含50 μg/mL的氨芐青霉素)上，倒置，28 ℃恒溫培養。每天觀察，及時分離新長出的菌落，并多次純化至純培養。用七葉苷培養基定性檢測純化菌株是否產β-葡萄糖苷酶，根據變色圈的大小和顏色，挑選相關產酶菌株進行搖瓶發酵培養，定量測定發酵液中β-葡萄糖苷酶活力。

1.2.2 酶活測定

取1 mL發酵液，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液稀釋10倍后得到粗酶液。參考劉德海[19]的方法制作標準曲線，得到回歸方程：Y=0.161 3x-0.005 2，相關系數R2=0.999 8，再檢測酶活。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌株形態觀察

將復篩所得菌株接種在PDA平板上，28 ℃恒溫培養2～5 d，觀察菌落的生長速度、菌落形態和顏色等。插片法觀察菌絲形態，孢子大小和形態等。

1.2.3.2 菌株分子生物學鑒定

采用CTAB法[20]提菌株基因組，在生工生物公司合成引物ITS序列通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCT-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；持家基因BenA引物Bt2a：5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’和Bt2b：5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’[21]，總反應體系為25 μL：上下游引物各1 μL，rTaq 0.15 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，dd H2O 17 μL，g DNA 1 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環33次；72 ℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠檢查，根據其結果，挑選相關PCR產物送上海生物工程公司測序，將測序成功的序列在NCBI數據庫中進行Blast比對，用MEGA 6.0構建系統發育樹。

1.2.4 復合誘變

1.2.4.1 孢子懸液的制備

用15%的無菌甘油沖洗培養7 d的固體平板，收集菌懸液于小三角瓶中，在28 ℃搖床中振蕩培養1 h，用8層無菌紗布過濾，得到單孢子懸浮液，用15%的無菌甘油將其定容至108個/mL，備用。

1.2.4.2 ARTP誘變

參考ZOU等[22]的方法，把加有10 μL孢子懸液的圓形鐵片放在操作室的凹槽中，設置電源功率110 W，氣流量10 SLM，處理距離為2 mm，分別處理0、30、60、90、120、150，180、210、240、270、300 s。將處理完的小鐵片分別放入裝有1 mL無菌水的EP管中，振蕩混勻后進行梯度稀釋，取100 μL 10-3倍稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫培養2 d，進行單菌落計數，計算致死率，實驗重復3次。

選取致死率為80%的照射時間對菌株進行誘變，挑取形態發生較大變化的單菌落于七葉苷平板上，培養2～3 d后觀察產酶變色圈的大小，根據其結果，選取變色圈較大的菌株進行活化，通過發酵培養，測定發酵液中β-葡萄糖苷酶活力，挑選酶活力提高最大的突變菌株，10 ℃斜面保存，備用。

1.2.4.3 DES化學誘變

以ARTP誘變篩選到的高酶活突變菌株，制備孢子懸液，方法同1.2.4.1。參考文獻[23]，具體方法如下：每0.1 mL孢子懸液加9.9 mL磷酸緩沖液(pH 7.0)，分別加入0、20、40、60、80、100 μL DES原液，使DES的體積分數為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%，28 ℃搖床振蕩培養20 min，加入1 mL Na2S2O3溶液終止反應，混勻后進行10倍濃度差的梯度稀釋，將100 μL 10-3倍稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫培養2 d，計算單菌落和致死率，實驗重復3次。參照ARTP誘變篩選高產菌方法進行酶活力提高的突變株篩選。

1.2.4.4 遺傳穩定性研究

將篩選得到的高產酶菌株，依次連續傳代培養6次，測定每個時代各菌株發酵液酶活力，判斷突變菌株的遺傳穩定性。挑選經過6次傳代，酶活力變化幅度不明顯的菌株，于10 ℃斜面保存，備用。

1.2.5 發酵條件優化

Plackett-Burman預實驗表明，碳源添加量、氮源添加量和裝液量3個因素的P值都小于0.05，這3個因素是影響發酵條件和酶活力的顯著因素性，因此，選擇這3個因素進行響應面分析。

用Design Expert 8.0軟件設計試驗，選擇三因素三水平實驗，響應值為酶活力，每個實驗重復3次，取平均值。實驗設計見表1。

表1 響應面分析試驗因素及水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface methodology

2 結果與分析

2.1 產β-葡萄糖苷酶菌株篩選

2.1.1 七葉苷平板初篩

將分離純化的菌株接種在七葉苷平板上，觀察菌落生長情況和培養基顏色變化，從26種菌株中挑選出9種產酶變色圈較大的菌株，編號為L1～L9，如圖1所示。

圖1 七葉苷平板初篩產β-葡萄糖苷酶菌株Fig.1 Preliminary screening of strains producing β-glucosidase on esculin agar plates 注：圖中L1～L9為菌株編號。

L1菌株的產酶變色圈明顯大于其它菌株，且顏色深于其它菌株，推測L1菌株可能有較高的β-葡萄糖苷酶活性，因此初步確定以L1作為后續研究菌株。

2.1.2 搖瓶發酵復篩

為定量測定L1～L9這9個菌株的β-葡萄糖苷酶活力，用基礎產酶發酵培養基，分別對這9個菌株進行搖瓶發酵培養，5 d后測定各發酵液酶活力，實驗重復3次，取酶活平均值，結果見圖2。

圖2 L1～L9菌株發酵液的β-葡萄糖苷酶活統計Fig.2 The activity of β-glucosidase in fermentation broth of strain L1～L9

定量實驗結果表明，L1菌株經基礎產酶培養基發酵時，其酶活力平均值達34.85 U/mL，L2～L9菌株的酶活力平均值依次為24.49、16.98、7.92、10.00、20.17、14.00、26.91和22.03 U/mL，L1菌株酶活力最高，結合2.1.1定性實驗結果，選擇L1作為后續誘變及發酵產酶菌株。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態學觀察

將菌株L1接種于PDA平板上，28 ℃恒溫培養5 d，可以看到該菌株菌落的中間呈灰綠色粉末狀，且表面有滲出液，菌落邊緣呈白色氣生菌絲，菌落背面為米白色，如圖3-a、3-b所示。用插片法觀察L1在PDA平板上培養3 d后的菌絲顯微形態，如圖3-c所示，該菌株形成無隔菌絲，分生孢子頭頂端膨大成典型的掃帚狀，分生孢子呈球形，直徑約2.5 μm，是典型的青霉菌屬形態特征，推測該菌株可能是青霉屬的一個種。

圖3 菌株L1在PDA平板上的菌落形態及顯微形態(C圖中比例尺為20 μm)Fig.3 Colony morphology and micromorphology of strain L1 on PDA plate

2.2.2 分子鑒定

為了鑒定該菌株，以其基因組DNA為模板，分別以ITS1/ITS4和Bt2a/Bt2b為引物，擴增L1菌株的ITS序列和持家基因BenA。獲得了長度為545 bp的ITS序列和414 bp的BenA序列，將序列分別在NCBI數據庫中進行Blast比對，結果顯示，L1菌株的ITS序列與已報道的赭綠青霉(Penicilliumochrochloron)的序列相似性達99.45%，持家基因BenA與P.ochrochloron的序列相似性達94.21%，結合菌株形態特征以及分子鑒定的結果，認為L1菌株屬于青霉屬的P.ochrochloron。根據序列的相似性比對結果，挑選相關菌株的BenA和ITS序列，將2個序列進行組合，用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹如圖4所示，光滑青霉菌(P.glabrum)為外群。

圖4 最大似然法構建菌株L1基于BenA和ITS序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree obtained Maximum-Likelihood analysis based on a combined data set of BenA and ITS sequences of strain L1

2.3 誘變結果

2.3.1 ARTP誘變

2.3.1.1 致死率曲線

ARTP誘變中的等離子體富含多種化學活性粒子，能引起細胞膜通透性和蛋白質物質發生改變，同時會造成菌株DNA的損傷，導致照射時間越長，菌株的存活率就越低。為確定最佳誘變時間，將L1菌株的孢子懸浮液置于ARTP誘變儀中，分別照射0、30、60、90、120、150，180、210、240、270和300 s，將照射后的懸浮液進行稀釋，根據預實驗中關于不同濃度孢子懸液與單菌落數的關系(結果未顯示)，選擇10-3倍稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫倒置培養2 d，實驗重復3次，統計各個平板上單菌落數，取平均值，制作誘變時間-致死率曲線，結果見圖5。

圖5 ARTP誘變不同時間的致死率曲線Fig.5 Curve of the mutagenized death rate of different ARTP mutation time

不同處理時間所對應的單菌落數分別為225、162、149、128、112、106、79、58、45、25、5，對應致死率分別為：0、28%、34%、43%、50%、53%、65%、74%、80%、89%和98%。由此可見，不同的誘變時間導致菌株致死率變化較大，對于ARTP和DES誘變來說，通常選擇致死率為75%～85%所對應的誘變條件為最佳參數，結合本實驗的測定結果，ARTP誘變時間為240 s，致死率為80%。因此，選擇對L1菌株的ARTP最佳誘變時間為240 s。

2.3.1.2 ARTP誘變突變株酶活力測定

以L1為出發菌株，以240 s作為ARTP誘變的最佳時間進行誘變，挑選與出發菌株L1有較大形態差異的40～50個突變菌，定性檢測這些菌株在七葉苷平板上的產酶變色圈，篩選出8～10株產酶變色圈較大的突變株，將其活化后通過搖瓶發酵，測定酶活力，重復ARTP誘變20次。結果共篩選出180株在七葉苷平板上產酶變色圈較大突變菌株，進一步進行發酵產酶酶活力測定，結果顯示，其中有15株突變菌株的酶活力提高明顯，與出發菌株L1相比，提高比例高于40%，15株突變菌株的編號依次為：A-1～A-15，結果如圖6所示。其中，突變菌株A-2的發酵液酶活力為57.84 U/mL，比出發菌株L1的酶活提高了52%，高于所有突變株酶活力，故挑選該菌株作為后續DES誘變處理的出發菌株。

圖6 ARTP誘變部分突變株與L1菌株的β-葡萄糖苷酶活比較Fig.6 Comparison of the partially ARTP mutation strains and the strain L1 on β-glucosidase activity

2.3.2 DES誘變

2.3.2.1 致死率曲線

DES是一種高效化學誘變劑，預實驗結果發現，1%的DES濃度對突變菌株A-2的致死率已接近100%。為確定最佳的誘變劑量，設置0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0% DES體積分數梯度，對應平板單菌落個數分別為272、202、143、94、54和7，其致死率分別為0、25%、47%、65%、80%和97%，制作DES濃度-致死率曲線，如圖7所示。考慮到誘變致死率為75%～85%之間時正突變比例較高[24]，結合本實驗結果，選擇0.8% DES體積分數作為最佳誘變劑量。

圖7 DES誘變致死率曲線Fig.7 Lethality of DES concentration to strain A-2

2.3.2.2 DES誘變突變株酶活力測定

以ARTP誘變篩選到的突變菌株A-2為出發菌株，進行DES化學誘變，高產酶突變菌株的初篩方法同ARTP誘變，共挑選出100株在七葉苷平板上產酶變色圈較大的突變菌，經搖瓶發酵培養后，計算各突變菌株酶活，并與出菌株A-2的酶活進行比較，最終挑選出10株酶活提高30%以上的突變株，突變菌株編號依次為D-1～D-10，結果見圖8所示，其中，D-6菌株酶活力為94.74 U/mL，高于其他各突變菌株，且比出發菌株A-2的酶活力提高了75.1%，比初始菌株L1提高了148.2%。

圖8 DES誘變部分突變株與A-2菌株的β-葡萄糖苷酶活比較Fig.8 Comparison of the partially DES mutation strains and the strain A-2 on β-glucosidase activity

2.3.3 遺傳穩定性檢驗

為檢測產酶活力明顯提高的突變株D-6的遺產穩定性，將突變株D-6依次傳代培養6次，對每一代進行搖瓶發酵，實驗重復3次，測定各代菌株的β-葡萄糖苷酶活力，以酶活力平均值-傳代次數作圖，結果見圖9，各代菌株的酶活力分別為：94.94、91.79、93.54、92.89、92.07和90.90 U/mL，不同世代酶活力差異不顯著，表明突變株D-6的遺傳穩定性良好，可作為后續發酵實驗菌株。

圖9 突變菌株D-6的發酵液酶活穩定性檢測Fig.9 Detection of enzyme activity stability in fermentation broth of mutant strain D-6

2.4 響應面實驗

2.4.1 Box-Behnken響應面分拆

Box-Behnken響應面實驗結果見表2，酶活力Y與顯著因子之間的回歸方程為：

模型中二次項系數均為負數，表明該模型拋物面開口向下，有極大值點。該模型的R2值為0.983 4，校正系數R2Adj值為0.962 1，表明回歸模型可以說明98.34%響應值的變化，說明該模型擬合程度高，能較好地預測發酵條件與菌株產酶活性的關系，精密度大于4.0，視為合理且擬合程度良好。回歸方程一次項系數絕對值的大小決定了各因素對響應值影響的主次順序，本實驗中各因素對響應值影響排序為：裝液量(X5)>碳源添加量(X1)>氮源添加量(X2)。

表2 Box-Behnken試驗結果Table 2 Box-Behnken test design combination and results

方差分析表明，模型P值小于0.000 1，說明該模型極顯著；失擬項P值為0.162 8，大于0.05，說明此模型建立有效。綜合以上回歸模型分析和預測發酵條件對菌株產酶活性影響的結果，回歸模型系數顯著性結果顯示，X5-裝液量的一次項、X1-碳源添加量的一二次項對菌株產酶活性回歸模型影響顯著(P<0.05)，X2-氮源添加量一次項對菌株產酶活性回歸模型影響不顯著(P>0.05)。3個因素的二次項對該模型的影響均不顯著(P>0.05)，3因素的交互項影響均不顯著(P>0.05)。

2.4.2 響應面試驗最佳條件與模型驗證

對碳源添加量(X1)、氮源添加量(X2)、裝液量(X5)進行交互分析，發現3個因素均存在極值點，且響應面覆蓋了最大值所在的區域。利用Design-Expert 8.0.6軟件進行參數優化，得到的最佳產酶條件是：KH2PO46 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO40.1 g/L，初始pH 5.2，接種量5%(孢子濃度108個/mL)，碳源添加量(X1) 玉米秸稈45.74 g/L、氮源添加量(X2) (NH4)2SO47.23 g/L、裝液量(X5) 63.21 mL/250 mL，發酵溫度28 ℃，搖床轉速160 r/min，發酵時間132 h，D-6菌株的β-葡萄糖苷酶活力為143.88 U/mL。驗證性實驗表明，D-6菌株的酶活力均值為142.92 U/mL，與預測值的誤差很小，且與基礎培養基發酵后的酶活92.69 U/mL相比，酶活提高了54.2%。綜上所述，響應面法優化產酶條件準確可靠，具有一定的實用價值。

3 結論

從腐木樣品中分離出來1株可以產β-葡萄糖苷酶的青霉菌株L1，經過ARTP-DES復合誘變獲得1株具有較好遺傳穩定性的突變菌株D-6，其發酵液酶活力比初始菌株L1提高了148.2%。通過響應面法進行發酵條件優化，結合軟件分析和實驗所得結果，得到D-6突變株產β-葡萄糖苷酶的最佳條件，且在此條件下，測得菌株酶活力可達142.92 U/mL，比基礎培養基發酵時酶活提高了54.2%；與出發菌株L1相比，酶活力提升了274.4%。在本實驗范圍內建立的二次回歸模型準確有效，可用來預測發酵產酶條件曲工藝參數，對實驗有較好擬合性，具有一定的實用價值。