醬香型白酒中活性成分的抗氧化活性

羅強，劉杰，劉志剛

(深圳大學 醫學部，廣東 深圳,518000)

白酒是由高粱等谷物經蒸煮等多個過程制得。中醫認為白酒可活血通脈、助藥力、增進食欲、消除疲勞，而且還有健脾胃的功效[11]。雖有大量研究表明，酗酒會對機體造成損傷，但同時也有研究顯示，適量飲用白酒對人體健康有一定益處[2, 12]。白酒成分復雜，與人體健康的關系尚不明確。據文獻報道，白酒中含有多種抗氧化性物質，如有機酸、酚類、吡嗪類化合物、含硫及萜類化合物等[13-14]，但由于乙醇及水的存在及分離困難等原因，人們對白酒相關生物活性物質研究較少。本實驗通過萃取、冷凍干燥的方式獲得醬香型白酒中的非乙醇物質(MLE)，并對其進行了抗氧化活性研究，以期解釋醬香型白酒中生物活性物質的抗氧化活性功能，從而為功能型白酒的調配奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌HepG2細胞，中國科學院上海細胞生物研究所；醬香型白酒，貴州茅臺集團；胎牛血清-FBS，中國杭州四季青生物技術有限公司；活性氧檢測試劑盒、細胞裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、Trizol、RT-PCR相關試劑，碧云天生物技術研究所；SOD、MDA、GSH-PX等相關測試盒，南京建成生物工程研究所；ExScript TM RT-PCT kit試劑盒， TaKaRa公司；其他試劑為分析純或標準品，阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IC型超凈工作臺、INCO2108型CO2培養箱，德國Thermo Fisher Scientific公司；TECAN infinite M200多功能酶標儀，德國TECAN公司；2K15型低溫高速離心機、3-30K高速臺式冷凍離心機，美國Sigma公司；Waters R2487高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)，美國Waters公司；液質聯用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS)，美國Agilent Technologies公司；Ultra-Turrax組織勻漿器，德國IKA公司；Epics Altra型流式細胞儀，美國Beckman公司；定量PCR儀，美國Bio-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MLE的分離及組成分析

250 mL分液漏斗中加入50 mL醬香型白酒、30 mL水和100 mL氯仿，振蕩搖勻，靜置，分離氯仿層，重復3次，合并氯仿層。用旋轉蒸發儀(0 ℃)除去氯仿獲得有機層化合物。真空凍干機凍干水層，獲得水層化合物，合并氯仿層及水層化合物即為MLE，LC/MS檢測結果顯示MLE中不含氯仿中所含的雜質，將MLE在-20 ℃避光保存，HPLC-MS分析方法參考相關文獻[13]進行。

1.3.2 細胞培養及實驗分組

3×105個/mL HepG2細胞接種于體積分數10% FBS、100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的DMEM(高糖)培養基中(pH 7.2)，37 ℃、體積分數5% CO2條件下孵育，培養液隔日更換。

實驗分為正常對照組、H2O2模型損傷組、53°醬香型白酒組、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE組及MLE成分組。將處于對數生長期、狀態良好的細胞接種于培養板中孵育24 h；待細胞生長穩定后，實驗組加入100 μg/mL溶于PBS的53°醬香白酒、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE和MLE成分，正常對照組、H2O2模型損傷組加入等量的PBS緩沖液，孵育6 h；棄去培養液，H2O2模型損傷組及實驗組加入含有100 μmol/L H2O2的PBS緩沖液，正常對照組加入等體積的PBS緩沖液，孵育4 h，CCK8(cell counting kit-8)檢測細胞增殖能力[15]。

教師既是“經師”，又是“人師”。教書和育人是一個無法分開的整體，育人滲透在教學中，是教學不可或缺的組成部分，育人效果的好壞直接決定著教學質量的高低。通過教學，教師既要幫助學生掌握知識，形成技能，發展能力，又要幫助學生養成遠大的理想追求，形成正確的人生態度，樂觀的情感體驗，寬廣的人文情懷，堅韌的意志品質，精益求精的敬業精神。美國心理學家林格倫指出：“教師的教育效果取決于師生交往的質量。”[2]要改變高等學校師生關系日漸疏遠的現狀，教師要深入學生之中，親近學生，了解學生，與生為友，以理服生，以情動生，以身示生，真正成為學生的人生導師。

將處于對數生長期、狀態良好的細胞從105個/mL的濃度接種于96孔板上，共接種36個孔孵育24 h；待細胞生長穩定后，實驗分組情況如下：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53%vol醬香型白酒組；④53%乙醇組(體積分數)；⑤MLE組；⑥MLE-10組。③、④、⑤、⑥組每孔分別加入100 μL溶于PBS的53°醬香型白酒、體積分數53%乙醇、MLE、MLE-10溶液，濃度均為0.248 mg/mL，①、②組每孔加入100 μL的PBS緩沖液；孵育6 h后，棄去培養液；②、③、④、⑤、⑥組加入100 μL濃度為100 μmol/L的H2O2溶液，①組加入等體積的PBS緩沖液；孵育4 h后每孔加入100 μL培養基和20 μL 5 g/L的MTT并溫育4 h，去除培養液及cck-8，每孔加入200 μL PBS緩沖液，酶標儀測定570 nm吸光度。

1.3.3 檢測MLE對細胞ROS、抗氧化酶的影響

實驗分組同cck-8法檢測細胞存活率，取對數生長期細胞，從104個/mL密度接種于96孔板培育24 h，加藥物孵育6 h，棄上清液，加100 μmol/L H2O2孵育4 h，然后按試劑盒說明書檢測ROS及GPx、SOD、MDA等的水平。

1.4 總RNA提取和cDNA的合成

總RNA提取和cDNA的合成分別應用Total RNA提取試劑盒和兩步法cDNA合成試劑盒，依試劑盒說明書進行操作。根據GenBank中NQO1、HO-1、PI3K、Nrf2和β-actin mRNA序列，利用Premier 5.0 設計熒光定量PCR引物。

1.5 檢測抗氧化酶基因的表達

實時熒光定量PCR采用SYBR Green I染料法，按照ExScript TM RT-PCR Kit試劑盒操作說明書在定量PCR儀進行。采用總反應體積10.0 μL體系：SYBR-Premix ExTaqTMⅡ 5 μL，引物(10 μmol/L)2.0 μL，cDNA模版1.0 μL，雙蒸水2.0 μL。PCR反應條件：95 ℃變性200 s，95 ℃反應25 s，65 ℃反應25 s，72 ℃反應20 s，72 ℃作用120 s，熒光檢測72 ℃ 10 s，40個循環。表達水平用相對定量的方法，采用2-ΔΔCt進行計算[16]。

1.6 數據處理

采用SPSS 18軟件進行統計。陰性對照和陽性對照采用獨立樣本t檢驗，對MLE處理效應進行回歸分析。P<0.05定為具有顯著性差異，結果均以Mean±SEM表示。

2 結果與分析

2.1 MLE的分離提取及化合物分析

50 mL白酒經萃取、冷凍干燥，最終獲得MLE 0.35 mg。經HPLC-MS分析，MLE多為多元醇、不飽和脂肪酸及其酯類化合物、吡嗪類化合物及含有苯環的芳香族化合物，選出其中含量較多的16種化合物(表1)及MLE進行體外抗氧化活性研究。

2.2 MLE對HepG2細胞增殖能力及ROS含量的影響

取0.10 mg/mL化合物(表1)預處理細胞6 h后，加入100 μmol/L H2O2培養4 h，CCK8檢測細胞增殖能力。相比于正常對照組(細胞增殖能力設為100%)，H2O2組細胞增殖能力顯著下降(83.3%,P<0.05)。分析實驗結果發現，部分化合物可顯著抑制由H2O2誘導引起的細胞增殖能力減弱的現象(表1)。MLE-7、MLE-9、MLE-10及MLE-15與HepG2細胞共培養6 h后，細胞增殖能力分別比H2O2組高6.40%、8.80%、13.2%及10.9%。而細胞與MLE-2、MLE-3、MLE-8及MLE-14共培養后，細胞增殖能力與H2O2組相比分別降低了7.00%、10.7%、11.0%及10.6%。因此，選擇MLE-10與MLE進行抗氧化活性研究。

表1 MLE中相關化合物濃度及對HepG2細胞增殖能力的影響Table 1 Concentrations of compounds in the MLE and effects on proliferation of HepG2 cells

注：“-”表示編號代表的物質為混合物。

實驗分為：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53%vol醬香型白酒組；④V(乙醇)∶V(水)=53∶47；⑤MLE組；⑥MLE-10組。為便于比較，將正常對照組數值設為1，其他組為相對值。

圖1-A結果顯示，相比于正常組相比，經H2O2組細胞存活率降低14.4%(P<0.05)。與H2O2組相比，MLE、MLE-10處理后細胞存活率分別上升5.80%、10.6%。相比于正常組，白酒、乙醇組細胞存活率分別下降17.7%、21.7%，低于H2O2組。說明白酒和乙醇會降低細胞抗H2O2氧化損傷能力，使細胞存活率降低。

MLE對細胞內ROS的影響如圖1-B所示，與正常組相比，H2O2刺激后，細胞內ROS升高338% (P<0.05)。而MLE、MLE-10處理后，與H2O2組比較，細胞內ROS分別下降24.7%、47.9% (P<0.05)，細胞清除ROS能力顯著增強。而白酒、乙醇組的ROS卻高于H2O2組，推測是乙醇與H2O2協同降低了HepG2細胞清除ROS的能力。

A-細胞存活率；B-ROS圖1 MLE對HepG2細胞增殖及細胞內ROS含量的影響Fig.1 Effects of MLE on proliferation and ROS level in HepG2 cells注：與正常對照組比較，#表示差異顯著(P<0.05)，與H2O2模型損傷組比較，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 MLE對HepG2細胞相關抗氧化酶的影響

實驗分為：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53°醬香型白酒組；④V(乙醇)∶V(水)=53∶47；⑤MLE組；⑥MLE-10組。為便于比較，將正常對照組數值設為1，其他組為相對值。

由表2可知，H2O2刺激HepG2細胞后，GST、MDA的含量顯著升高(P<0.05)，GPx、SOD、CAT活性出現明顯降低，且GSH含量也顯著降低。經MLE、MLE-10處理后，GST、MDA的含量降低(P<0.05)，GPx(P<0.05)、SOD、CAT活性明顯增強。不同于MLE、MLE-10可增強HepG2抗氧化損傷的作用，醬香型白酒及同濃度乙醇組的GST、MDA的含量反而高于H2O2組，而GPx、SOD、CAT活性則低于H2O2組。推測可能是組分中乙醇對細胞具有一定的氧化損傷作用導致的。

2.4 MLE對HepG2細胞抗氧化基因表達的影響

實驗分為：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53°醬香型白酒組；④V(乙醇)∶V(水)=53∶47；⑤MLE組；⑥MLE-10組。為便于比較，將正常對照組數值設為1，其他組為相對值。

如圖2所示，用H2O2刺激HepG2細胞后，與對照組相比，HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表達顯著降低(P<0.05)。MLE-10處理后，其表達明顯提高(與H2O2模型損傷組比較，P<0.05)。實驗結果說明，H2O2可導致HepG2細胞相關抗氧化基因的表達下降。而MLE、MLE-10可抑制H2O2所致的抗氧化基因表達下調，使之恢復，并接近正常水平。

表2 MLE對HepG2細胞內GPx、SOD、CAT、GSH、GST及MDA的影響Table 2 Effects of MLE on GPx, SOD, CAT, GSH, GST and MDA in HepG2 cells

注：與正常對照組對比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)，與H2O2模型損傷組比，*表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 MLE對H2O2處理HepG2細胞HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表達的影響Fig.2 Effects of MLE on HO-1, NQO-1, Nrf2 and PI3K gene expressions in HepG2 cells注：與正常對照組對比，#表示差異顯著(P<0.05)，與H2O2模型損傷組比較，*表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

氧化應激是體內氧化和抗氧化水平失去平衡的結果，過量的活性氧會引起分子、細胞和機體的損傷[17]。大量研究表明，氧化應激是代謝綜合征發生和發展及一些疾病發生的重要病因之一[18-19]。在肝炎、酒精肝等多種肝病中，氧化應激是它們共同的損傷機制[20]。H2O2可直接轉變為·OH作用于肝細胞，引起細胞氧化損傷[21]。大量研究表明，酒精及其代謝產物會對機體造成一定的損傷，尤其是對消化系統。不同于伏特加等蒸餾酒，醬香型白酒是一種由谷物發酵(如高粱等)經蒸煮等多種過程而得的蒸餾酒，它在含有酒精的同時還含有大量生物活性物質。實驗結果顯示，醬香型白酒中含有多種酯類、不飽和烯醇及含有苯環的芳香族化合物。其中化合物MLE-10(2-乙酰基-5-甲基呋喃)能顯著增強細胞抗H2O2造成的氧化損傷。進一步實驗證明，MLE及MLE-10可提高細胞Nrf2及其上游調控因子PI3K及下游Ⅱ相酶基因NQO1和HO-1的表達，進而提高細胞內SOD、GPx等抗氧化酶活性，降低MDA產生，增強細胞清除自由基能力，進而發揮抗氧化作用[22]。但是，與相關研究結果類似，酒精組及白酒組細胞抗氧化能力降低、相關抗氧化酶活性低于H2O2組，說明乙醇降低了細胞的抗氧化損傷能力。