不同提取方法對檸檬皮渣果膠特性的影響

劉江，雷激，張俊，胡玲

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都,610039)

果膠是一種大分子酸性多糖，其理化特性、流變性質和乳化特性是食品加工過程中極其重要的特性[1]。檸檬皮渣是檸檬加工的主要副產物，其干基中果膠含量可達30%，與其他種類的果膠相比，其膠凝性強，酯化度高，分子量大，是一種較好的天然果膠來源[2-3]；且檸檬果膠是一種黏性食品膠，具有良好的乳化性[4]。

果膠的提取方法主要有酸法提取(traditional acid extraction，TAE)、酶法提取(enzyme extraction，EE)、微波法輔助提取(microwave assisted extraction，MAE)、超高壓法輔助提取(ultra-high pressure assisted extraction，UHPAE)及超聲波法輔助提取(ultrasound assisted extraction，UAE)[4]。研究表明，不同方式提取的果膠具有不同的性質特性，所得果膠在工業生產中應用領域也不同[5-6]。因此，研究不同提取方式對檸檬果膠特性的影響可在一定程度上擴大果膠的應用?；诖?，本研究主要探討了5種不同的提取方式對檸檬果膠理化特性、流變特性和乳化特性的影響，并與商品檸檬果膠(commercial lemon pectin，CLP)比較，以期為拓展檸檬果膠在食品行業中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥檸檬皮渣：自制，制備方法見參考文獻[7]；D-半乳糖醛酸(91510-62-2)，分析純，美國Sigma公司；咔唑試劑(86-74-8)，上海展云化工有限公司；白砂糖，眉山市新紀元食品有限公司；商品檸檬果膠，安德利集團有限公司；食品級纖維素酶(酶活400 U/g)，和氏璧生物科技有限公司；無水乙醇、碳酸鈉溶液、濃硫酸(95%～98%)、乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、95%(體積分數)乙醇、酚酞、氫氧化鈉，分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

Triowin橙子榨汁機，上海沃迪智能裝備股份有限公司；TB-214電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；SHZ-DIII旋轉蒸發儀，北京普瑞奇科技股份有限公司；PHS-320 pH計，上海霄盛有限公司；SFG-02.400電熱恒溫鼓風干燥箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司；SpectraMax?i3x酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；TD-5M低速離心機，四川蜀科儀器有限公司；JYD-L超聲波細胞粉碎儀，上海般諾生物科技有限公司；MOOEL超高壓設備，上海沃迪智能裝備股份有限公司；FY-10型微波萃取儀，上海越眾儀器設備有限公司；Nicolet Is 50傅立葉變換紅外光譜儀，上海力晶科學儀器有限公司；MCR xx2流變儀，奧地利安東帕(中國)有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS激光粒度儀，英國Malvern儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

檸檬干渣過篩(去除小于1 mm顆粒)→5種提取果膠工藝(詳見1.3.2.1～1.3.2.5；都以0.05 mol/L EDTA為提取溶劑，0.5 mol/L檸檬酸調節pH)→1 500 r/min下離心20 min收集上清液→濾渣用蒸餾水洗滌→60 ℃旋轉蒸發濃縮至原體積1/2→2倍體積的95%(體積分數)乙醇沉淀45 min并用無水乙醇洗滌3次→60 ℃干燥果膠→粉碎→果膠成品

1.3.2 提取方法

以果膠得率為指標，在預試驗基礎上得到5種不同提取方式的最佳提取工藝參數，如下所述：

1.3.2.1 TAE果膠工藝

料液比1∶20(g∶mL)，pH 1.8，80 ℃提取150 min，其他步驟條件同1.3.1。

1.3.2.2 EE果膠工藝

料液比1∶20(g∶mL)，pH 5.5，纖維素酶加酶量0.8%(質量濃度)，53 ℃酶解110 min，其他步驟條件同1.3.1。

1.3.2.3 MAE果膠工藝

料液比1∶22(g∶mL)，pH 2.3，在功率密度為320 W/g下提取8 min，其他步驟條件同1.3.1。

1.3.2.4 UHPAE果膠工藝

料液比1∶18(g∶mL)，pH 2.3，350 MPa保壓17 min，其他步驟條件同1.3.1。

1.3.2.5 UAE果膠工藝

料液比1∶18(g∶mL)，pH 2.3，350 W/g提取33 min，其他步驟條件同1.3.1。

1.4 試驗指標及測定方法

1.4.1 檸檬干渣果膠得率

檸檬干渣果膠得率的測定采用重量法[8]，果膠得率按公式(1)計算：

(1)

式中：P，果膠得率，%；m，干燥后得到的果膠的質量，g；W，樣品檸檬干渣的質量，g。

1.4.2 果膠酯化度測定

采用滴定法[9]進行，按公式(2)計算：

(2)

式中：V1，樣品的初始滴定體積，mL；V2，樣品溶液的皂化滴定體積，mL。

1.4.3 果膠半乳糖醛酸含量測定

采用硫酸咔唑比色法[10]進行。按公式(3)計算：

(3)

式中：E，從標準曲線中查得的半乳糖醛酸質量濃度，μg/mL。

1.4.4 果膠分子質量測定

采用凝膠色譜法測定果膠分子質量。色譜儀器：Waters 515液相色譜泵，Waters 2410示差檢測器，Waters Ultrahyrdogel Linear凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)，Waters凝膠色譜專用軟件；色譜條件：0.2 mol/L NaNO3，柱溫40 ℃，流速0.60 mL/min，分子質量對照品為窄分布的葡聚糖(分子質量范圍2 500～5 348 000 Dc)；樣品處理：稱取10 mg果膠樣品，加2 mL 0.2 mol/L NaNO3溶解，用0.45 μm針筒式濾膜過濾得樣品溶液，窄分布葡聚糖對照品溶液用同樣方法配制；分子質量計算：利用凝膠色譜專用軟件計算樣品的分子質量。

1.4.5 果膠的結構測定

利用Nicolet Is 50傅立葉變換紅外光譜儀對樣品進行紅外測定。把果膠與KBr以質量比1∶25混合研磨壓片制樣，在400～4 000 cm-1范圍內掃描。掃描64次，分辨率4 cm-1。利用Ominic 3.0軟件對試驗數據進行分析處理[11]。

1.4.6 果膠溶液流變性質測試

將不同提取方式的檸檬果膠樣品溶解在去離子水中，使用磁力攪拌器攪拌，配制成質量分數為2%的果膠溶液。采用安東帕RheoCompass流變儀測定果膠流變性，每次測量之前，使樣品平衡2 min，所有試驗至少進行3次重復。

1.4.6.1 果膠溶液穩態剪切測試[12-13]

選用同軸圓筒，使樣品剛好淹沒圓筒內劃線，轉子下降后樣品剛好覆蓋其表面。剪切速率0.001～10 s-1，溫度25 ℃，測定樣品的表觀黏度隨剪切速率的變化。采用Power law模型對流變曲線進行擬合，模型公式如公式(4)所示:

σ=kεn

(4)

其中:σ,剪切應力;ε,剪切速率，s-1；k,黏性系數;n為流動特性指數，表示流體偏離牛頓流體的程度，當n=1，流體為牛頓流體，當n>1，流體為脹塑性流體，當n<1，流體為假塑性流體。設ηa=kεn-1，則模型公式變為σ=ηaε，ηa被稱為表觀黏度，即測定值中的k。

1.4.6.2 果膠溶液動態黏彈性測試[14]

振幅掃描：固定頻率1 Hz，溫度25 ℃，在0.01%～100%范圍進行應變掃描以確定線性黏彈區(linear viscoelastic region, LVR)。

由預試驗結果可知，為保證測定過程中所有果膠樣品均在線性黏彈區內，選擇1%作為應變掃描值。在溫度25 ℃，角頻率范圍為0.1～100 rad/s時進行頻率掃描測試。此試驗選擇直徑為40 mm的P50平板。記錄貯藏模量G′和損耗模量G″。

1.4.7 果膠溶液乳化性質測定[15]

果膠乳化性主要從乳化穩定性(emulsifying stability，ES)、乳化活性(emulsifying activity，EA)、乳液粒徑及Zeta電位等方面進行表征。向質量分數為1%的20 g果膠溶液中加入15 g精制大豆油，攪拌混合，用FJ200-S高速均質機以10 000 r/min均質3次3 min(1 min/次)制備果膠乳化液。

1.4.7.1 果膠乳液粒徑測定[16]

將制備好的乳液吸取2 mL于Malvern Zetasizer Nano ZS激光粒度儀比色皿中，測定乳化液粒徑(volume mean diameter，D4,3)。每個樣品平行3次。乳液水平放置在4 ℃冰箱中，觀察儲藏0、1、3、5、7 d后的乳液的穩定情況。

1.4.7.2 果膠乳液Zeta電位[14]

基于經典動態光散射理論，使用Malvern Zetasizer Nano ZS激光粒度儀Zeta potential模式測量檸檬果膠乳液的Zeta電位。為避免多重散射效應，將1%(質量分數)乳化果膠溶液稀釋100倍，調節果膠溶液pH分別為 3、4、5、6、7，在25 ℃測定其電位。

1.4.7.3 果膠乳化活性及乳化穩定性[17-18]

當乳化液制備好后，0 min和10 min時分別從底部吸取1 mL乳化液于250 mL燒杯中，將乳液稀釋90倍(每次稀釋10倍)，以0.1%(質量濃度)SDS溶液為空白，振蕩均勻后在500 nm下測定吸光值。果膠EA及ES分別按公式(5)、公式(6)計算：

(5)

(6)

式中：EA，乳化活性，m2/g；ES，乳化穩定性，min；A0和A10，分別代表0 min和10 min時乳化液的吸光值；V，稀釋倍數(90)；L，比色皿的寬度(1 cm)；φ，乳化液中油的體積分數，在本試驗中油相占3/7；C，果膠溶液的質量分數，1%。

1.5 統計分析

數據以均值±標準差表示，采用SPSS 21.0 對均值進行單因素ANOVA分析和最小顯著差數法(LSD)多重比較，P<0.05差異有統計學意義。采用Origin 8.5進行統計圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 提取方法對檸檬果膠得率的影響

不同提取方式對果膠得率的影響如圖1所示，通過方差分析顯示通過5種不同提取方式得到的檸檬果膠得率差異顯著(P<0.05)。MAE果膠得率最高為25.02%，UAE和UHPAE其次，分別是24.04%、23.76%，EE果膠得率為20.41%，TAE果膠得率最低為17.54%，這可能是由于MAE、UHPAE、UAE和EE對檸檬皮渣細胞壁的分解程度大，使得細胞破裂從而更多的多糖等物質被分解出來，所得果膠得率高。

圖1 提取方式對檸檬果膠得率的影響Fig.1 Effects of extraction methods on the yield of pectin注：相鄰字母表示P<0.05；相間字母表示P<0.01。下同。

2.2 提取方式對檸檬果膠酯化度的影響

圖2 提取方式對檸檬果膠酯化度的影響Fig.2 Effects of extraction methods on esterification degree of pectin

酯化度是指果膠主鏈上聚半乳糖醛酸被甲酯化的程度，是果膠的一個重要功能指標[3]，對果膠的溶解性、凝膠特性等影響很大。由圖2可知，不同方法提取的果膠酯化度均大于50%，屬于高甲氧基果膠，且不同提取方式得到的檸檬果膠酯化度差異顯著(P<0.05)。5種方法提取的果膠酯化度值均大于CLP果膠。不同提取方法中，TAE得到的果膠酯化度最高，EE和MAE其次，UAE和UHPAE最低。高的DE可以允許果膠在較高的pH條件下形成凝膠，可以顯著降低凝膠類食品的酸度，這對凝膠食品有重要意義[5]。

2.3 提取方式對檸檬果膠半乳糖醛酸含量的影響

半乳糖醛酸的回歸方程為：y=0.004 5x-0.003 8，相關系數R2=0.999 1，半乳糖醛酸呈良好的線性關系，式中:y為所測溶液的吸光度值；x為溶液中果膠的濃度(μg/mL)。

由圖3可知，不同提取方法總半乳糖醛酸含量≥65%，符合GB 25533—2010的要求，EE果膠半乳糖醛酸含量最低為80.51%，與其他果膠半乳糖醛酸含量相比差異性顯著(P<0.05)，而商品果膠和其他4種果膠不存在顯著性差異。張曉陽等[10]使用微波法、水浴法、食用菌發酵法和超高壓法提取胡蘿卜渣中的果膠，發現4種方法提取所得果膠的半乳糖醛酸含量均無顯著差異，與本試驗結果類似。萬國福等[19]采用酸提法提取檸檬皮渣中果膠，并測得其半乳糖醛酸含量為66.92%，低于本試驗所得含量。

圖3 提取方式對檸檬果膠半乳糖醛酸的影響Fig.3 Effects of extraction methods on galacturonic acid of lemon pectin

2.4 提取方式對檸檬果膠分子質量的影響

果膠分子質量是影響果膠特性的一個重要因素，分子質量的差異不僅影響果膠的物理特性，還對果膠在體內的吸收分布以及與其他分子間的相互作用模式產生影響[10]。如圖4所示，不同提取方法所得的果膠分子質量差異顯著(P<0.05)。CLP、TAE、EE、MAE、UHPAE和UAE果膠均分子質量分別是1.38×105、1.46×105、2.04×105、2.85×105、3.67×105、2.47×105Da，5種方法提取的果膠分子質量均大于CLP。UHPAE果膠分子質量最大，MAE果膠其次，EE果膠和UAE果膠分子質量次于MAE，TAE果膠和CLP分子質量最小，可能是因為TAE過程中時間長、溫度高，果膠分子發生部分降解，使得到果膠分子質量降低，這與YAPO等[20]研究的不同提取條件對甜菜果膠性質研究結論基本一致。在實際加工生產中，可以根據果膠的特性用途選擇提取方式，例如生產果凍或果醬的企業可選擇經UHPAE或MAE提取的分子質量大的果膠作為增稠劑或膠凝劑，形成具有一定彈性和口感的產品。

圖4 提取方式對檸檬果膠分子量的影響Fig.4 Effects of extraction methods on molecular weight of lemon pectin

2.5 檸檬果膠紅外光譜分析

1-TAE；2-CLP；3-EE；4-MAE；5-UAE；6-UHPAE圖5 經不同提取方法提取的檸檬果膠的傅立葉紅外光譜圖Fig.5 FTIR of lemon pectin extracted by different extraction methods

從圖5傅里葉紅外光譜圖(fourier transform infrared spectrometry，FTIR)可知，幾種方式提取得到的果膠和CLP在紅外光譜圖中特征官能團對應的波數基本相同，只是指紋區略有差異，說明不同提取方法不會對提取的果膠結構產生影響，這一結果與趙光遠等[21]報道的一致。

2.6 提取方法對果膠流變性的影響

2.6.1 提取方法對果膠穩態剪切測試的影響

流變性是果膠的重要特性，流變學是在力的作用下研究物質的流動和變形。當果膠被作為增稠劑或穩定劑使用時，黏度是衡量果膠效果的一個重要指標。如圖6所示，所有檸檬果膠溶液隨著剪切速率的增加表觀黏度降低，表現出剪切稀化行為，可能是由于高剪切速率使得果膠分子之間的空隙增大，分子鏈纏結數量減少，膠體的黏度降低[12]。平穩時，表觀黏度由高到低分別為：MAE、UHPAE、UAE、EE、TAE、CLP，5種方法提取的果膠表觀黏度值均大于CLP。不同提取方法中，MAE果膠的表觀黏度最高，TAE果膠黏度最低，這可能是由于MAE果膠增加了組織細胞內部能量，分子間彼此纏結，分子量增大，分子的相對運動減弱，流體流動困難，從而表現出較大的表觀黏度[13]；而TAE果膠由于長時間高溫提取使果膠分子鏈斷裂，使得平均分子量最小，從而導致果膠表觀黏度低。

圖6 提取方法對檸檬果膠表觀黏度的影響Fig.6 Effects of extraction methods on apparent viscosity of lemon pectin

根據Power law對流變數據點進行擬合，結果顯示預測值和試驗值相關系數為0.982～0.998，表明Power law模型(公式4)對曲線有較高的擬合精度。由表1可知，不同提取方法的流動特性指數n均小于1，檸檬果膠溶液為假塑性流體，不同提取方法中，MAE果膠的n值最小，流體表現出的假塑性最強，這與穩態表觀黏度曲線的趨勢相對應。

表1 不同提取方法檸檬果膠流變性模型擬合參數Table 1 Fitting parameters rheological model of lemon pectin by different extraction methods

注：K為表觀黏度，n為流體特征性指數，R2為方程擬合精度，RS為標準差，肩標小寫字母表示相鄰差異顯著P<0.05；相間差異顯著P<0.01。

2.6.2 提取方法對果膠動態黏彈性測試的影響

凝膠體系的動態黏彈性與其實際應用性能直接相關。果膠是一種大分子多糖，具有黏彈特性(同時表現出固體和液體性質)[14]。貯能模量G′代表能量貯存而可恢復的彈性性質，損耗模量G″代表體系的黏性性質，G′和G″的交點定義了果膠形成凝膠或果膠彈性行為的開始，是果膠具有較好黏彈特性的證明[22]。不同方法提取果膠溶液G′和G″由圖7所示，TAE和CLP的G′和G″無交集且G″>G′，說明此時果膠的分子鏈纏繞較少屬于溶膠體系，彈性特性較弱，果膠主要表現為黏性；EE、MAE、UAE以及UHPAE的G′和G″均出現交集，說明這幾種提取方法能增強果膠的凝膠性，可能是由于這幾種方法提取果膠過程中暴露了許多連接區，果膠鏈的相互作用更大，形成的交鏈系統更強，表現出一種典型的凝膠動態流變學特性[14]。

損耗正切值tanε為G″與G′比值，提供了彈性和黏性對系統的比較參數[22]。由圖8可知不同提取方法的tanε值都呈現出上升趨勢，當G′ 1，果膠液主要表現為黏性；當G′ >G″時，tanε<1，果膠液主要表現為彈性，表明流動性減弱，凝膠強度增加[14]。CLP和TAE的tanε恒大于1，表現出黏性，而其他幾種提取體系隨角頻率增加tanε先小于1后大于1，表現出弱凝膠性，由于液滴被捕獲在弱凝膠結構中，減緩了液滴的布朗運動，增強了液滴抵抗浮力及重力的能力，使得液滴穩定地懸浮在體系中，具有貯藏穩定性[23]。凝膠性強可改善食品體系的加工性能，在實際應用中可根據所需果膠性能選擇合適的提取方式。

a-CLP;b-TAE;c-EE;d-MAE;e-UAE;f-UHPAE圖7 不同方法提取檸檬果膠的頻率掃描結果Fig.7 Frequency scanning results of different extraction methods of lemon pectin

圖8 提取方法對檸檬果膠損耗正切值的影響Fig.8 Effects of extraction methods on tangent value of lemon pectin

2.7 提取方法對果膠乳化性的影響

2.7.1 提取方法對果膠乳液粒徑的影響

乳化粒徑大小是評價乳化液優劣的一個重要指標，正常情況下，它與乳液的穩定性呈現出良好的相關性。乳液粒徑越小，分布越均勻，乳液的穩定性越好[24]。如圖9所示，不同方法提取的果膠對乳化液粒徑有顯著差異(P<0.05)。粒徑排序為：CLP>TAE>EE>UAE>UHPAE≥MAE，可能是由于MAE和UHPAE中果膠中性糖側鏈多，使得果膠分子在油滴表面形成水合層厚度較高，從而產生空間位阻效應，導致果膠粒徑小。在工業生產中，可以通過改變提取方式來降低乳液粒徑，提高乳液的穩定性。此外，乳化液儲放1～7 d后，乳化液粒徑均增大，這可能是由于制備的乳液隨著保存時間的延長，乳液液滴彼此之間發生聚集作用和重力沉降[16]，形成大顆粒的液滴，乳液粒徑增大。總體而言，CLP、TAE、EE、MAE、UHPAE、UAE儲放7 d后,D4，3變化分別為1.649、1.561、1.245、0.539、0.778、0.900 μm，CLP粒徑變化大于5種方法提取果膠的變化，其穩定性最差，MAE粒徑變化最小，其穩定性最好。

圖9 不同提取方法下果膠乳液粒徑Fig.9 Effects of different extraction methods on particle size of pectin emulsion

2.7.2 提取方法對果膠乳化液Zeta電位影響

Zeta電位是指乳液中分散液滴表面與連續相內部的電位差，通常用于表征乳液體系的穩定性[17]。檸檬果膠是一種陰離子酸性多糖帶負電，所測定的乳液的電位為負值，pH值變化導致果膠帶電荷數量的不同，進而影響了乳化顆粒帶電荷數量[18]。如表2所示，隨著pH增加，各樣品果膠溶液的Zeta電位變化趨勢大體相同，即Zeta電位絕對值先增加后保持恒定，pH 3時各樣品Zeta電位最小。總體來看，CLP乳液電位絕對值最??；MAE、UHPAE、UAE乳液電位絕對值大。這可能是因為MAE、UHPAE、UAE提高了果膠電離程度，使得乳化液液滴表面能夠吸附溶液中帶負電荷分子，電位值的絕對值增大，相互之間產生的作用力強，乳液穩定高[25]。不同提取方式對檸檬果膠乳液的Zeta電位有顯著影響，這與對果膠乳液粒徑影響結果一致。

表2 不同提取方法檸檬果膠在不同pH值下Zeta電位的影響Table 2 Effects of zeta potential of lemon pectin by different extraction methods at different pH values

注：肩標小寫字母表示各同列差異顯著P<0.05，大寫字母表示同行差異顯著P<0.05。

2.7.3 不同提取方法對果膠穩定性的影響

果膠是一種天然的具有乳化能力的物質，與阿拉伯膠等乳化劑相比，果膠分子中帶有的乙?；軌蛟鰪娛杷饔昧?，有效降低界面張力，低濃度的果膠就能形成較為穩定的乳液[17]。如圖10所示，不同提取方法提取的果膠乳化液的EA差異顯著(P<0.05)，CLP的EA最小，UHPAE和MAE的EA最大，這可能是因為MAE和UHPAE提取對果膠中性糖側鏈破壞小，表現出的活性大，得到的果膠穩定性高[15]。從ES分析可知，所有樣品溶液ES均大于100 min，具有良好的穩定性，但CLP溶液穩定性顯著低于5種提取方式得到的果膠(P<0.05)。這與上述果膠乳液粒徑影響結果一致，在實際應用中可以通過改變果膠的提取方式來提高乳化穩定性，從而獲得乳化性能較好的果膠。

圖10 不同提取方式檸檬果膠的乳化活性及穩定性Fig.10 EA and ES of lemon pectin extracted by different methods注：不同大寫字母表示乳化活性具有顯著性差異(P<0.05)，不同小寫字母表示乳化穩定性具有顯著性差異(P<0.05)。

3 結論

不同提取方式對檸檬果膠特性有顯著影響(P<0.05)。MAE果膠得率(25.02%)最高，UHPAE果膠分子質量最高(3.67×105Da)；所有果膠半乳糖醛酸含量均高于80%，超過國標65%的要求；酯化度均大于50%，檸檬果膠屬于高甲氧基果膠；FTIR顯示，不同方法提取的果膠均具有果膠的特征官能團，說明不同提取方法不會對果膠結構產生影響；不同方法所得的果膠中，MAE、UHPAE、UAE及EE隨角頻率增加tanε先小于1后大于1，表現出弱凝膠性，具有貯藏穩定性；果膠的表觀黏度、粒徑、Zeta電位及乳化穩定性等的大小具有相同的順序：MAE>UHPAE>UAE>EE>TAE>CLP，即5種提取方法得到的果膠流變及乳化特性均高于商品果膠，且其它4種提取方法所得果膠又好于酸法，說明在傳統酸提取基礎進行上改進，采用一定的現代技術輔助酸法提取檸檬果膠有助于提高其的理化性、流變性和乳化特性，這為研究不同方法提取檸檬果膠在食品工業中的進一步應用提供了一定基礎。