冷磨橙皮油生產(chǎn)工藝中離心廢水與精油的揮發(fā)性物質(zhì)差異分析

張群琳，李貴節(jié),2，程玉嬌，何雅靜，ROUSEFF R L，谷利偉,3*，吳厚玖，孫志高*

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶，400712) 2(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067) 3(佛羅里達(dá)大學(xué) 食品科學(xué)與人類營養(yǎng)系，美國，32611-0720)

甜橙(Citrussinensis)屬蕓香科植物，其植株的果實、花及葉中都含有香氣物質(zhì)[1]。甜橙外果皮中分布有扁圓形的油胞，直徑一般可達(dá)0.4～0.6 mm[2]，內(nèi)含豐富的香精油，具有令人愉悅的獨特芳香風(fēng)味，是一種廣受消費者歡迎的天然香料。食品、飲料及其他輕工業(yè)中大量使用甜橙精油來賦予產(chǎn)品天然橙香[3]。此外，甜橙精油還具有抑菌[4]、抗氧化、消炎[5]、抗病毒[6]和降血壓[7]等作用，因此也被廣泛應(yīng)用于化妝品和醫(yī)藥行業(yè)。近年來，國內(nèi)外市場對甜橙精油的需求呈持續(xù)增長的態(tài)勢。

甜橙精油的工業(yè)提取方法主要有冷磨法、水蒸汽蒸餾法和超臨界萃取法等[8]。其中冷磨法為常溫下機(jī)械力加工，未經(jīng)熱處理，所得精油成分最接近天然組成，其香氣品質(zhì)更接近于新鮮果香，因此冷磨法成為生產(chǎn)高品質(zhì)甜橙精油的主要方法。典型的冷磨設(shè)備主要由螺旋軸和齒輥組成，果實被螺旋推進(jìn)并由齒輥帶動翻滾，該過程中外果皮被刺傷，油胞破裂，皮油被大量噴淋水沖刷收集，形成皮油乳液[9]。乳液粗濾后，經(jīng)第1次離心分離得到濃縮乳液、少量廢渣和一級離心廢水，濃縮乳液再經(jīng)第2次離心分離得到冷磨油和二級離心廢水。冷磨油最后經(jīng)低溫貯藏去除其中殘留的水分和蠟質(zhì)，得到冷磨橙皮精油[10]。

甜橙精油的香氣源于其中所含的揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds, VOCs)，主要由萜烯類、醇類、醛酮類和酯類組成。生產(chǎn)過程中不可避免地會有部分揮發(fā)性成分隨過濾皮渣、離心沉淀物以及離心廢水(aqueous effluent, AE)而損失。BRAT等[11]對揮發(fā)性物質(zhì)在離心后皮渣和上清液中的分布情況展開研究，結(jié)果表明，乙醇、乙酸乙酯等醇、酯類高極性物質(zhì)在水相中的溶解度更大。有文獻(xiàn)表明[9]，離心廢水中殘留總揮發(fā)性物質(zhì)的量將在很大程度上影響精油的產(chǎn)量和品質(zhì)，MOSHONAS等[12-13]對商業(yè)上生產(chǎn)橙皮油獲得的離心廢水進(jìn)行了簡單定性分析，發(fā)現(xiàn)其中含有甜橙的大多數(shù)特征香氣成分；還對濃縮橙汁時的蒸餾回收物“水溶性精油(aqueous essence)”和精油間的香氣及揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)水溶性精油和精油具有不同的芳香特征，可能是由于揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量上的差異造成的。這些研究表明與皮油直接接觸的水相中殘留有揮發(fā)性成分，可能成為回收香氣物質(zhì)的重要來源，而目前針對冷磨甜橙精油離心廢水中揮發(fā)性物質(zhì)的準(zhǔn)確定性、定量分析研究尚無報道。

本研究以全球廣泛種植的伏令夏橙(Valenciaorange)為原料，通過實驗室模擬工業(yè)冷磨法生產(chǎn)精油的過程，利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(headspace solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)對2次離心廢水及精油中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量與定性分析，為全面了解離心廢水中的揮發(fā)性物質(zhì)種類和其香氣品質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時為進(jìn)一步提高冷磨精油(cold-pressed oil, CPO)過程中總揮發(fā)性物質(zhì)的回收利用率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟伏令夏橙果實，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所資源圃；環(huán)己酮(>99.5%)，aladdin公司；C5-C25正構(gòu)烷烴(色譜級)，Honeywell公司。

1.2 儀器與設(shè)備

9N50型碟片式分離機(jī)，青海農(nóng)牧機(jī)械制造有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；Agilent 7890 GC-5977 MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；85 μm，CAR/PDMS固相微萃取裝置，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 冷磨橙皮精油的制備及水、油取樣

冷磨橙皮油的制備參考MATTHEWS等[14]的方法并稍作修改，流程如圖1所示，具體步驟為：稱取3.3 kg伏令夏橙，量取1.4 L自來水于容器中，在水中用不銹鋼銼板對果實表皮進(jìn)行適度銼磨，使油胞破裂釋放其中的皮精油。為減少皮油成分的揮發(fā)損失，容器全程置于冰水浴中。所得皮油乳液經(jīng)200目紗布過濾去除大部分不溶性皮渣后，采用碟片式分離機(jī)進(jìn)行第一級離心，循環(huán)多次獲得濃縮皮油乳液，同時收集第一級離心廢水(aqueous effluent I, AE I)。測定AE I的體積和可溶性固形物含量(total soluble solids, TSS)，置于-18 ℃氮氣中密閉保存待用。濃縮皮油乳液于4 ℃高速冷凍離心機(jī)中以7 026×g進(jìn)行二級離心，收集上層澄清精油和下層廢液(aqueous effluent II, AE II)，分別測定其體積和AE II的TSS，而后置于-18 ℃氮氣中密閉凍藏備用。

圖1 冷磨精油生產(chǎn)工藝流程圖Fig.1 The flow chart of essential oil by cold pressing methods

1.3.2 頂空固相微萃取

取50 μL精制冷磨油于18 mL頂空瓶中，AE I、AE II解凍后各取2 mL于20 mL頂空瓶中，以使3個樣品的頂空體積基本相同。分別加入環(huán)己酮內(nèi)標(biāo)，充入氮氣后密閉。樣品于40 ℃水浴中平衡30 min，靜態(tài)頂空SPME吸附15 s，立刻進(jìn)行GC-MS檢測。

1.3.3 GC-MS檢測條件

氣相條件：DB-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度230 ℃，不分流；升溫程序： 35 ℃保持3 min，以6 ℃/min升溫至203 ℃，以10 ℃/min升溫至243 ℃，保持3 min。氣體流速：1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z：40～350。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

定性分析：以W10N14譜庫檢索結(jié)合DB-5色譜柱的保留指數(shù)進(jìn)行定性。

保留指數(shù)(retention index, RI)將C5-C25正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品按1.3.3條件進(jìn)樣，確定各物質(zhì)保留時間，根據(jù)公式(1)進(jìn)行計算：

(1)

式中：ti、tz、t(z+1)分別代表待測組分及碳數(shù)為z、z+1正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

半定量分析：利用內(nèi)標(biāo)法定量，以環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

待測組分在精油和2次離心廢水中的質(zhì)量濃度X(μg/mL)分別根據(jù)公式(2)、(3)計算：

(2)

(3)

式中：Ai，待測組分峰面積；ms，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量,μg；As，內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V，進(jìn)樣瓶中樣品體積,mL；f，相對揮發(fā)度，即內(nèi)標(biāo)物“環(huán)己酮”在水相和油相中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比，經(jīng)過換算得f水/油=5.62。

所有實驗均測定3組平行樣品，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，顯著性分析使用SPSS 22.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量分析

一級離心廢水、二級離心廢水和冷磨精油中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖如圖2所示。

a- AEI；b- AEII；c-CPO圖2 兩級離心廢水及冷磨精油的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile compounds in AE I、AE II and CPO注：對高響應(yīng)值物質(zhì)色譜峰進(jìn)行標(biāo)注，編號見表1；右上角小圖為完整總離子流圖，其中虛線區(qū)域內(nèi)為放大部分。

通過譜庫檢索及與對比保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫[15-16]，從3個樣品中共檢測鑒定出77種揮發(fā)性物質(zhì)，各物質(zhì)名稱及其在3個樣品中的濃度信息如表1所示。其中，AE I、AE II和CPO中分別鑒定出75、72和63種揮發(fā)性物質(zhì)。

2.2 不同樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的分類分析及比較

如表2所示，AE I、AE II及CPO中揮發(fā)性物質(zhì)總質(zhì)量濃度分別為962.39、1 602.22及52 081.27 μg/mL，CPO濃度遠(yuǎn)高于廢水的濃度；但將各個樣品中VOCs總濃度與樣品的總體積相乘(分別為1 400、36和3 mL)后，發(fā)現(xiàn)AE I中VOCs的含量占3個樣品VOCs總量的86.30%，遠(yuǎn)大于AE II和CPO的含量(3.69%和10.00%)。該結(jié)果說明一級離心廢水帶走了原本屬于精油中的大量揮發(fā)性物質(zhì)。與VOCs總量類似，除有機(jī)酸類化合物外，其他各類物質(zhì)在CPO中的濃度均為最高，但以總量計則仍為AE I中含量最多。其中，醛酮類、醇類物質(zhì)在AE I中的含量占3個樣品總含量的96.39%和94.94%。

表1 一級離心廢水、二級離心廢水和精油中的揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Volatile compounds contained in AE I、AE II and CPO

續(xù)表1

續(xù)表1

序號RI1RI2化合物名稱化合物濃度/(μg·ml-1)AEIAEIICPO定性方法氣味描述詞[15-16]7515231524杜松萜烯Cadinene,d0.11±0.010.07±0.141.75±0.15MS、RI[E]woody,dry,mild7615281521順式-去氫白菖烯cis-Calamenene0.12±0.030.19±0.255.65±0.22MS、RI[A]herb,spice7716811677卡達(dá)烯Cadalene0.01±0.000.02±0.010.51±0.05MS、RINA

注：RI1表示DB-5色譜柱的保留指數(shù)，RI2文獻(xiàn)中參考保留指數(shù)；“—”表示未檢出；“tr”表示檢測到但沒有定量；NA表示未查到描述詞；[A～I(xiàn)]分別代表藥草香、果香、青香、油脂香、木香、松香、花香、不愉悅、橘香等香氣屬性。

表2 三個樣品中揮發(fā)性物質(zhì)分類匯總表 單位：μg/mLTable 2 Structural categorization of volatile components in three samples

注：a-各類化合物所含成分的個數(shù);b-其他包含單萜氧化物和蒎烷等。

2.2.1 單萜烴類化合物

有研究表明[17]，在甜橙精油中，單萜烴類化合物中的D-檸檬烯、檜烯、β-月桂烯、蒎烯等是最主要的氣味貢獻(xiàn)成分。從表1、2可知，單萜碳?xì)浠衔镌贏E I、AE II和CPO中的含量分布情況相似，都是相對含量最高的物質(zhì)。D-檸檬烯是3個樣品中含量最豐富的共有成分；在離心廢水中含量較高的其他主要單萜類成分有β-月桂烯、α-萜品油烯、α-蒎烯和檜烯，前兩者分別具有濃郁的香料味和柑橘味，后兩者則被描述為松脂味[15]。3-蒈烯僅在AE I被檢測到；(E)-b-羅勒烯僅在AE I和CPO中檢測到，且其在AE I中的濃度遠(yuǎn)高于CPO。2,6-二甲基-3-辛烯和(-)-β-香茅烯含量極低(<0.005%,w/w)，屬于痕量成分。

2.2.2 倍半萜烴類化合物

在3個樣品中，瓦倫西亞橘烯都是含量最高的倍半萜類物質(zhì)，為柑橘類果實常見的香氣成分，通常被描述為木頭味和柑橘味[16]。含量次之的此類物質(zhì)，在AE I中分別為α-古巴烯、β-反式石竹烯、β-蛇麻烯，而在AE II和CPO中為順式-去氫白菖烯、α-金合歡烯。有文獻(xiàn)[18]稱在肯尼亞伏令夏橙皮油中α-金合歡烯為含量最高的倍半萜類物質(zhì)，且未檢測到瓦倫西亞橘烯，2種物質(zhì)在含量上的差異顯示果實產(chǎn)地可能對揮發(fā)性成分的組成有重要影響。

2.2.3 醛酮類化合物

相關(guān)文獻(xiàn)表明，醛酮類中多數(shù)物質(zhì)香味閾值很低，低濃度時也可表現(xiàn)出很強(qiáng)的氣味[19]，如辛醛、癸醛、壬醛和香茅醛等[20]。在AE I、AE II及CPO中，醛酮類化合物是除單萜烴類化合物之外含量最高的化合物種類，其中辛醛和癸醛是3個樣品中含量最高的醛類物質(zhì)，兩者含量之和分別占AE I及AE II中醛酮類物質(zhì)總量的71.39%、72.12%(w/w)。香葉醛、橙花醛、紫蘇醛和香茅醛是3個樣品中主要的單萜醛類物質(zhì)，其中香茅醛含量最高，與其他甜橙皮油的研究結(jié)果一致[18]。正己醛在AE I中的濃度極大地高于其在CPO中的濃度，與RADFORD等[21]構(gòu)建的含柑桔果渣和水的模擬體系中醛類的分布相類似，即極性更高的醛類主要存在于水相中。在AE I、AE II色譜圖的前10 min發(fā)現(xiàn)存在3-羥基-正丁醛、(E)-2-戊烯醛和3-甲基-2-丁烯醛(圖3)，這些醛類物質(zhì)在CPO中并沒有檢測到。(Z)-香芹酮是3個樣品中最主要的酮類物質(zhì)，其濃度是其他同類物質(zhì)濃度的5～7倍；2,3-丁二酮是AE II中檢測到的唯一酮類物質(zhì)。

a- AE I；b- AE II；c-CPO圖3 3個樣品的總離子流圖前端色譜圖Fig.3 Early eluting part of the total ion chromatograms of the volatile compounds in three samples注：圖(a)、(b)中物質(zhì)的色譜峰對應(yīng)編號見表1。

2.2.4 醇類物質(zhì)

芳樟醇不僅是CPO，也是AE I、AE II中含量最高的醇類物質(zhì)，分別占3個樣品中總醇類物質(zhì)量的92.53%、91.11%和89.44%(w/w)。其他含量較高的醇類物質(zhì)為α-松油醇、4-松油醇和香茅醇等，有文獻(xiàn)表明檸檬烯經(jīng)水合作用可以轉(zhuǎn)化為α-松油醇[22]，這可能是AE I、AE II中含較高濃度α-松油醇的原因之一。此外，CPO中缺失了幾種醇類物質(zhì)，它們僅在AE I、AE II的色譜圖中檢測到，分別為3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、(Z)-2-戊烯-1-醇，這些醇類在其他甜橙精油中也并未見報道。

2.2.5 其他物質(zhì)

研究發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)含量極低。其中在CPO中鑒定出辛酸乙酯和丁酸香茅酯，這2種酯類物質(zhì)被多次報道存在于甜橙果汁中[21,23]，但尚未在冷磨橙皮油中檢出。順式-氧化檸檬烯是3個樣品中唯一被鑒定出的環(huán)氧化物，其他文獻(xiàn)報道的環(huán)氧月桂烯、(E)-芳樟醇氧化物、環(huán)氧石竹烯[18,24]等物質(zhì)均未被檢測到。這些氧化物可能是甜橙油中的天然成分，也可能是在樣品制備、儲存或分析過程中，在熱或酸的影響下經(jīng)氧化而形成[18]。本研究前處理在低溫和氮氣保護(hù)環(huán)境下進(jìn)行，可能在一定程度上避免了氧化反應(yīng)的發(fā)生。

由上述分析可知，離心廢水與精油中的揮發(fā)性成分種類接近，均檢測出烯烴、醛酮、醇、酯等化合物。兩類樣品間的差異主要體現(xiàn)在VOCs的濃度和含量上，還體現(xiàn)在極性較強(qiáng)的小分子醇、醛和酯類物質(zhì)的分布上。后者的分布趨勢與MOSHONAS等[13]的報道相符。

2.3 不同樣品間各香氣屬性物質(zhì)的組成差異

揮發(fā)性香氣物質(zhì)的濃度是影響樣品香氣品質(zhì)的重要原因之一[25]。通過比對數(shù)據(jù)庫[15-16]以及查閱文獻(xiàn)資料[26-29]，完成對所有揮發(fā)性物質(zhì)所對應(yīng)香氣描述詞的查找和匹配，最終將3個樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)歸為果香型(7個)、青香型(6個)、花香型(9個)、脂香型(8個)、木香型(6個)、松香型(7個)、橘香型(8個)、藥草香型(12個)及不愉悅氣味(4個)9類香型。分別計算3個樣品(j=1、2、3)中每種香型(i=1、2、…、9)物質(zhì)濃度占該樣品總VOCs濃度的比例Z(j,i)(c/c,%)，以Z(j,i)最大值為單位“1”作圖，比較香型分布的樣品差異，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同香氣類型的揮發(fā)性物質(zhì)在3個樣品中的分布差異Fig.4 Distribution variance of volatile compounds that attribute to different aroma type in three samples

由圖4可知，就同類香型物質(zhì)而言，其在AE I、AE II及CPO中的分配比例具有極顯著差異(P<0.01)。果香、青香、花香、脂香、藥草香等香型成分在AE I中所占比例明顯高于AE II及CPO，其中AE I中花香型物質(zhì)所占比例為4.88%(c/c)，是CPO中(0.81%)的6倍；木香、松香等香型物質(zhì)在CPO中更為豐富，如松香成分在CPO和AE I中所占比例(c/c，%)分別為5.39%和2.26%，前者約是后者的2.4倍。

3 結(jié)論

通過HS-SPME-GC-MS對離心廢水和冷磨皮精油中揮發(fā)性物質(zhì)的定性、定量分析，檢測鑒定出77種揮發(fā)性物質(zhì)，在2次離心廢水中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)種類與皮精油中揮發(fā)性物質(zhì)種類基本重疊，其區(qū)別集中體現(xiàn)在一些易溶于水的小分子脂肪族醇、醛及酯類物質(zhì)上。通過定量分析，雖然各物質(zhì)在精油中的濃度顯著高于其在AE I、AE II中的濃度，但AE I中的揮發(fā)性物質(zhì)的總量卻是精油中總量的8.6倍，占3個樣品揮發(fā)性物質(zhì)總和的86.30%。2次離心廢水與精油中不同香型物質(zhì)的濃度在各樣品VOCs總量中的分配比例存在顯著差異(P<0.01)，離心廢水中青香、果香、花香、藥草香等香型物質(zhì)比例高于精油中的比例。綜合可知，冷磨橙皮油生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的離心廢水中含有種類豐富的大量揮發(fā)性物質(zhì)，具有很大的回收利用價值。