3種生態環境中華絨螯蟹肉揮發性風味特征的比較

程華峰，林琳，葛孟甜，吳浩然，李肖嬋，高凱日，姜紹通，陸劍鋒

(合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥，230009)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱大閘蟹、河蟹、毛蟹等，是我國重要的養殖經濟蟹類品種之一。自20世紀90年代河蟹養殖技術取得突破發展以來，河蟹養殖規模逐年擴大，2017年國內總產量超過7.5×105t[1]。依據生長或養殖生態環境的差異，河蟹主要劃為長江野生蟹(江蟹)、湖泊圍養蟹(湖蟹)、池塘養殖蟹(塘蟹)、稻田養殖蟹(稻蟹)等。已有研究表明，河蟹蟹肉營養價值較高，含有豐富的蛋白質(氨基酸)、礦物質、脂肪酸等[2-3]。

揮發性物質是指一類能為人體感覺器官所感知的揮發性化合物，其與滋味一同構成了食品的風味，它主要被鼻腔上部的嗅覺上皮細胞感知[4]。揮發性物質通常是由風味前體物質在一定條件下催化轉化而來，風味前體物質一般由水溶性成分(氨基酸、核苷酸、肽類等)和脂溶性成分(脂質等)構成[5]。風味前體物質的復雜性與交互反應性決定了揮發性物質的多樣性，目前在水產品中鑒定出的揮發性物質已有數千種。

水產品揮發性物質的研究與傳感器等技術的發展息息相關。電子鼻(electronic nose，E-Nose)是一種模仿生物嗅覺的電子系統，它由多個性能彼此重疊的氣敏傳感器和適當的模式識別算法組成，通過敏感的電化學傳感器陣列、適當的模式識別方法可以自動檢測和辨別簡單或復雜的揮發性物質[6]。電子鼻以其客觀、準確、快速、操作簡便等優點，被廣泛應用于食品揮發性氣體分析。頂空固相微萃取-氣質聯用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)技術能夠有效分離和鑒定復合物中的揮發性成分，具有靈敏度高、重現性好、成本低、操作簡單、方便快捷等優點，被廣泛應用于食品風味物質的分析檢測[7]。E-Nose與HS-SPME-GC-MS的結合，促進了食品揮發性物質的研究。

國外學者已對藍蟹、雪蟹等海水蟹類的揮發性物質進行了大量的研究[8-12]，但對我國常見的養殖品種——中華絨螯蟹的研究鮮見報道。近年來，雖然國內學者對中華絨螯蟹的揮發性物質開展了深入研究，但主要集中在中華絨螯蟹不同可食部位的揮發性物質分析方面[13-16]，對不同生態環境中華絨螯蟹的揮發性物質差異比較研究相對較少。此外，隨著農業農村部稻漁綜合種養技術的迅速推廣，稻田養蟹正逐漸發展成為我國生態漁業養殖的一種重要模式[17]，因此與稻蟹品質相關的研究也亟需開展。鑒于此，本文以長江野生、湖泊養殖和稻田養殖的中華絨螯蟹為材料，采用E-Nose結合HS-SPME-GC-MS技術分析比較了3種生態環境中華絨螯蟹雌、雄蟹肉揮發性物質種類與含量，旨在探討不同生態環境對蟹肉特征揮發性物質的影響，同時也為今后中華絨螯蟹的生態養殖模式提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

2017年10月下旬，從安徽無為等地現場隨機選取稻田養殖、湖泊養殖、長江野生中華絨螯蟹個體各20只(其中雌蟹10只，規格為100～120 g；雄蟹10只，規格為150～170 g)，共計60只，活體捆扎包裝處理后帶回實驗室，4 ℃低溫保存至樣品前處理(保存時間不宜超過7 d)。

5975C-7890A氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；萃取頭(碳分子篩(CAR)/二甲基硅氧烷(PDMS)，涂層厚度75 μm)、手動進樣柄，德國Sigma公司；PEN3電子鼻，德國Airsense公司；20 mL無色頂空萃取瓶，上海安譜科學儀器有限公司；HH-2數顯水浴鍋，江蘇金壇市環宇科學儀器廠；DB-5MS色譜柱(60 m×0.32 mm×1 μm)，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取出捆扎好的雌、雄蟹，沖洗表面的泥沙等雜質并用毛巾擦拭干凈，置于不銹鋼蒸煮鍋中隔水蒸煮20 min。取出蒸熟蟹樣，冷卻至室溫，解剖取出肌肉，并攪碎均勻，精確稱取每份質量為(2.00±0.01) g和(5.00±0.01) g的肉樣，分別裝入10 mL的電子鼻進樣瓶和20 mL的頂空瓶中備用。

1.2.2 電子鼻檢測

各組進樣瓶在60 ℃下平衡600 s后進行電子鼻檢測，以潔凈干燥空氣為載體，氣體流量400 mL/min，采樣間隔1 s，清洗時間150 s，歸零時間5 s，預進樣時間150 s，測量時間100 s。相同條件下重復檢測3次。電子鼻傳感器性能描述見表1[18]。

1.2.3 GC-MS檢測

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)分離揮發性物質。將內裝樣品的頂空瓶置于室溫下平衡10 min后，再將SPME針管插入頂空瓶的硅橡膠瓶墊，并用已老化的75 μm CAR/PDMS萃取頭在100 ℃水浴下吸附40 min。吸附完畢后，取出萃取頭插入GC-MS進樣口，240 ℃下解析5 min，待熱脫附后進行GC-MS檢測。

色譜條件：揮發性化合物的分析通過GC-MS系統進行。DB-5MS色譜柱(60 m×0.32 mm，1 μm)；采用不分流模式，起始柱溫40 ℃，先以5 ℃/min升至100 ℃，無保留；再以3 ℃/min升至180 ℃；最后以5 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。載氣為He，流速1 mL/min；汽化室溫度240 ℃。

質譜條件：EI離子源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z40～450；檢測器電壓350 V；掃描速度1.8 s-1。

1.2.4 揮發物的定性及定量方法

定性方法：揮發性物質譜圖采用NIST 2008數據庫進行定性分析，僅報道化合物正反匹配度大于80(最大值為100)的鑒定結果。

定量方法：將內標2,4,6-三甲基吡啶(TMP)溶解在甲醇(色譜純)中，使溶液最終質量濃度為1 000 mg/L，并在進行SPME過程之前，將2 μL該溶液加入到5 g中華絨螯蟹均質樣品中，通過計算待測揮發物與TMP的峰面積之比求得其絕對濃度(假定各揮發物的絕對校正因子為1.0)，蟹肉樣品中揮發性化合物濃度計算公式如(1)所示：

(1)

式中：V1,揮發物的峰面積；V2,內標的峰面積；2，內標的含量，μg;5，蟹肉樣品的質量，g。

1.2.5 氣味活度值的計算

采用指標“氣味活度值”(odor activity value, OAV)定義化合物對樣品風味的貢獻度，其計算如公式(2)所示：

(2)

式中：C、T是各揮發性物質的濃度和對應的嗅覺閾值。在一定條件下，OAV<1，表明該化合物對總體風味無明顯貢獻；OAV>1，表明該化合物對總體風味有明顯貢獻。

1.3 數據分析

電子鼻測定結果由儀器自帶的WinMuster軟件采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)處理，預實驗結果表明電子鼻的傳感器信號響應值從90 s開始穩定，為保證實驗數據的穩定性和準確度，本實驗選取第95～96 s測量的數據進行主成分分析；GC-MS數據利用NIST 2008數據庫匹配從而進行定性分析；其余實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 3種生態環境蟹肉的電子鼻結果分析

圖1顯示了3種生態環境蟹肉的風味雷達圖，其中每根傳感器代表不同的揮發性成分類別。每個樣品的最大傳感器響應強度均超過了1，滿足電子鼻技術的有效響應值要求。其中，長江雌蟹肉的響應最大，它的響應曲線與其他樣品的響應曲線區分明顯，而稻田雌蟹肉和雄蟹肉的響應較小，且二者的響應曲線很難區分，這可能是因為相比其他樣品，長江雌蟹肉中揮發性物質的種類與含量存在差異，而稻田雌蟹肉和雄蟹肉中揮發性物質的種類與含量差異較小。

蟹肉-1：湖泊雌蟹肉；蟹肉-2：湖泊雄蟹肉；蟹肉-3：稻田雌蟹肉；蟹肉-4：稻田雄蟹肉；蟹肉-5：長江雌蟹肉；蟹肉-6：長江雄蟹肉圖1 三種生態環境蟹肉的風味雷達圖Fig.1 Flavor radar map of crab muscle obtained from three eco-environment systems

2.2 三種生態環境蟹肉的PCA分析

采用PCA分析不同生態環境蟹肉電子鼻數據，結果見圖2。其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分別為95.58%和3.48%，總貢獻率達99.06%，大于85%，表明電子鼻能夠區分不同的蟹肉樣品，蟹肉樣品在PCA圖上的分布呈現一定的規律性。稻田養殖雌、雄蟹組電子鼻數據相近且重疊率高，表明氣味成分較為相似，稻田蟹與湖泊雌蟹的數據雖然未有重疊，但其差距主要體現在第二主成分軸上，PC2的貢獻率僅為3.48%，因此二者的氣味成分差別不大，其余樣品數據皆無重疊，且差距主要體現在第一主成分軸上(PC1貢獻率達99.06%)，表明各組分氣味成分具有明顯區別，同時長江雌蟹與其他組分數據點相距較遠，且在PC1與PC2成分軸上均有差異體現，由此可見，長江雌蟹的氣味成分明顯區別于其他樣品。

圖2 三種生態環境蟹肉的電子鼻數據PCA分析圖Fig.2 Principal component analysis chart for E-Nose data of crab muscle obtained from three eco-environment systems

2.3 三種生態環境蟹肉的GC-MS分析

2.3.1 三種生態環境蟹肉的揮發性成分

采用HS-SPME-GC-MS技術檢測3種生態環境雄蟹和雌蟹肉中揮發性成分，結果見表2和表3。本實驗共分離鑒定出86種化合物，其中烴類芳香族26種，醇類10種，酮類8種，醛類14種，酯類19種，含氮化合物1種，其他化合物8種。從3種生態環境雄蟹肉中分別檢測出30、29和31種揮發性風味化合物；從3種生態環境雌蟹肉中分別檢測出30、29和29種揮發性風味化合物。

2.3.2 三種生態環境蟹肉的揮發性成分分析

3種生態環境蟹肉的揮發性成分中，雄蟹肉烴類芳香族化合物總含量分別為893.47 ng/g(稻田養殖)、639.87 ng/g(湖泊養殖)和580.59 ng/g(長江野生)；雌蟹肉的揮發性成分中，烴類芳香族化合物總含量分別為693.48 ng/g(稻田養殖)、614.96 ng/g(湖泊養殖)和357.08 ng/g(長江野生)。其中長江野生雌蟹肉的烴類芳香族化合物含量最少，這可能是造成與其他樣品間氣味組分存在差異的原因之一。鑒于烴類芳香族化合物具有較高的嗅覺閾值，對樣品整體風味的貢獻較小[18]。但某些支鏈烷烴仍具有一定的風味，如2,6,10,14-四甲基十五烷具有一種清甜香[19]，此化合物在3種樣品中均被檢測到，這可能是中華絨螯蟹肉風味較好的原因之一。此外，在3種樣品中均檢測到較高含量的苯乙烯，苯乙烯具有樹脂、堅果香氣，對中華絨螯蟹的風味有較大貢獻[20]。值得注意的是在樣品中檢測出一定含量的1,4-二甲基苯與萘，這類化合物一般是由環境污染物被不斷富集而形成，這可能是導致蟹肉具有刺激性氣味的原因[21-22]，但由于其嗅覺閾值較高，對蟹肉風味影響較小[23]。

表2 三種生態環境雄蟹肉的揮發性成分Table 2 Volatile compounds of male crab muscle obtained from three eco-environment systems

續表2

類別保留時間/min化合物名稱化合物含量/(ng·g-1)稻田養殖湖泊養殖長江野生其他16.4322-戊基呋喃6.56--24.275乙烯基正十八醚-7.82-25.5972-庚基呋喃-29.33-30.8552,4-二叔丁基苯酚10.16-7.3430.8742,6-雙(1,1-二甲基乙基)-苯酚-0.82-41.546乙二醇十二烷基醚--2.43合計16.72±4.31b37.97±6.12a9.77±1.23c

注：同行不同字母代表數據間差異顯著(P<0.05)；“-”表示未檢測到或無法得到相關數值。下同。

表3 三種生態環境雌蟹肉的揮發性成分Table 3 Volatile compounds of female crab muscle obtained from three eco-environment systems

續表3

類別保留時間/min化合物名稱化合物含量/(ng·g-1)稻田養殖湖泊養殖長江野生醛類11.173苯甲醛147.35-147.8815.514壬醛157.5568.3581.8019.213癸醛40.3328.6110.2123.172十二醛17.35-11.3324.629庚醛-2.41-31.078十三醛18.70-7.8341.844十四醛20.144.36-41.851十五醛--24.7141.957十六醛122.8124.60-46.896十八醛39.54--合計563.77±23.64a128.33±13.32c283.76±18.74b酯類25.774環丁基十四烷基乙二酸酯-1.556.3231.802環丁基十八烷基乙二酸酯-5.03-31.9992-十四烷基甲氧基乙酸酯8.79-2.7536.749十二烷基-2-丙基乙酸酯10.73--37.306烯丙基十六烷基乙二酸酯--1.1538.647烯丙基十三烷基乙二酸酯-1.561.1039.542十五烷基-2-丙基乙二酸酯9.90--40.210環丁基十七烷基乙二酸酯8.23--40.457丁基十六烷基碳酸酯7.55--44.645十六酸甲酯13.69--45.317鄰苯二甲酸二丁酯39.54--合計98.43±13.21a8.14±2.22c11.32±2.17b含氮類37.607甲基烯丙基胺-1.83-合計-1.83±0.61-其他15.669安息香甲基醚-35.82-16.4322-戊基呋喃8.13--30.8552,4-二叔丁基苯酚--4.1741.546庚基己基醚-2.89-41.877乙二醇十二烷基醚--2.64合計8.13±0.59b38.71±6.49a6.81±0.47c

醇類化合物通常是由脂肪酸的二級氫過氧化物的分解、脂肪氧化酶對脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解或由羰基化合物還原生成。醇類化合物是一類高閾值化合物，一般產生較為柔和的氣味，有類似水果或植物的香氣[24]。由于其嗅覺閾值高，對蟹肉風味的貢獻較小。本實驗共檢測出醇類化合物10種，其中雄蟹肉中含有5種，雌蟹肉中含有7種，相同化合物2種，分別為2-丁基-1-辛醇和二十四烷醇。此外，僅在長江野生蟹雌、雄蟹肉樣品中檢測出二十四烷醇，其可能為長江野生蟹蟹肉特有風味物質。

酮類化合物多由多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解、氨基酸降解或微生物氧化產生。對于蝦蟹等甲殼類，主要貢獻獨特的清香和果香味，其香味隨著碳鏈的延長逐漸增強[25]。雄蟹肉中共檢測到4種酮類，雌蟹肉中共檢測到5種酮類，其中2-壬酮呈果香、清香及奶油的氣味[26]，僅在湖泊雄蟹與長江雌蟹肉中檢測到該種化合物，這可能是水體生長環境影響的結果。2-癸酮嗅覺閾值較低，具有獨特的番茄香氣[27]，且僅在長江雌蟹肉中檢測到該種物質。這些酮類物質的相互作用可能是導致長江雌蟹肉與其他樣品氣味存在較大差異的原因之一。烯酮類化合物可能是肉制品在加熱期間生成的脂質氧化產物，有青葉的芳香氣味[28]。本實驗中，共檢測到3種烯酮類化合物：11-十二碳烯-2-酮、6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮和1-庚烯-3-酮，對蟹肉主要貢獻熱帶水果、青草的氣味[25]。

醛類化合物的嗅覺閾值較低，一般具有青香、果香、堅果香和甜香，主要由脂類氧化生成，此類化合物對蟹肉的風味有重要影響。本實驗中，共有14種醛類化合物被檢測出來，其中苯甲醛具有強烈的甜橙氣息和類似炒花生的香氣，且嗅覺閾值較低，對蟹肉風味產生重要影響。壬醛和庚醛等給新鮮的海鮮提供了令人舒適的綠色植物般的青香和甜甜的花香[29-30]，但同時也經常被認為是淡水魚類土腥味的重要成分[15]。稻田養殖雌、雄蟹肉中的壬醛含量均較高，分別為157.55和129.59 ng/g，所以其在提供青香的同時，也可能造成稻田養殖蟹的土腥味較重，但其蟹肉風味特征也符合稻田養殖生態環境的特點。癸醛嗅覺閾值較低，在高度稀釋后具有水果香氣、蜂蜜樣香氣和花香[31]，其中稻田養殖蟹肉的癸醛化合物濃度較高，對其風味貢獻較大。本實驗中，雄蟹肉的醛類化合物總量分別為443.18 ng/g(稻田養殖)、157.14 ng/g(湖泊養殖)和491.75 ng/g(長江野生)，雌蟹肉的醛類化合物總量分別為563.77 ng/g(稻田養殖)、128.33 ng/g(湖泊養殖)和283.76 ng/g(長江野生)，且3者之間均存在顯著性差異(P<0.05)，這些醛類化合物種類和含量的差異可能是3種生態環境蟹肉特征風味差異性的原因之一。

酯類物質一般是由發酵或者脂質代謝生成的羧酸和醇酯化后產生[18]，酯類化合物主要具有甜香、奶油香、水果香、花香等，同時能增強其他風味化合物的氣味，對蟹肉風味特征具有重要貢獻[18]。本實驗中，稻田養殖蟹肉的酯類化合物含量最高，雄蟹肉中主要化合物為2-十四烷基苯乙酸脂和鄰苯二甲酸雙十二酯，二者含量占酯類總量的70%，它們可能是構成稻田養殖雄蟹肉的香味主體。而稻田養殖雌蟹肉中鄰苯二甲酸二丁酯含量較高，占酯類總量的40%，這可能是稻田養殖雌蟹肉的香味主體。豐富的酯類含量有助于稻田養殖蟹蟹肉整體風味的形成，這可能是稻田養殖蟹蟹肉風味較好的原因之一。

含氮化合物主要來源于蛋白質、游離氨基酸和核酸的分解[32]，實驗僅在湖泊養殖雌蟹肉中檢測到1種含氮化合物——甲基烯丙基胺，其含量為1.83 ng/g，該物質的產生可能是由環境因素引起的，其具體風味特征需要進一步的研究。

其他化合物中主要包括醚、呋喃和酚。醚是醇或酚的羥基中的氫被烴基取代的產物，醚類化合物本身具有獨特的氣味。3種生態環境河蟹中僅稻田養殖蟹未檢測出醚類化合物，這可能是稻田養殖蟹與其他2種生態環境蟹風味差異的原因之一。呋喃類化合物主要來源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應、氨基酸(如脯氨酸)及硫胺素的熱解反應，具有濃郁的肉香味，常見于熟制蟹肉、蝦的水解物，烤干的魷魚和蒸煮的小龍蝦風味成分中[33]。2-戊基呋喃的嗅覺閾值相對較低，具有誘人焦香味，可作為肉品脂質氧化的指示物，其僅在稻田養殖蟹中檢測到，對肉品的整體風味作用巨大[15]。2-庚基呋喃常存在于烤牛肉、燒雞中，具有青香、牛奶和豬肉香[20]，其僅在湖泊養殖雄蟹肉樣品中檢測到，這可能是湖泊養殖雄蟹肉特有的風味物質。乙二醇十二烷基醚只在長江野生蟹中被檢測出，這種化合物可能是長江野生蟹特有風味物質，也可能是長江野生蟹與其他生態環境蟹氣味組分存在差異的原因之一。酚類化合物主要來源于木質素熱降解和酚羧酸的脫羧作用，通常具有木香、焦香和煙熏香氣[18]。由于蟹肉中檢測到的酚類化合物種類和含量較少，所以對蟹肉整體風味的貢獻也較小。

2.3.3 三種生態環境蟹肉的風味活性物質分析

人類對揮發性物質的敏感度不僅僅取決于物質的濃度大小，還取決于嗅覺閾值的高低，通常把人能感受到某種物質的最低濃度稱為“嗅覺閾值”[34-35]。化合物濃度一定時，嗅覺閾值越低的化合物越容易被感知；嗅覺閾值一定時，化合物濃度越高越容易被感知。所以只有將嗅覺閾值與揮發性物質濃度結合起來才能對化合物的總體風味作出客觀評價。在一般情況下，OAV值越大表明該化合物對總體風味貢獻越大[35-37]。根據公式(2)計算得到各主要風味化合物的OAV值，結果見表4和表5。3種生態環境雄蟹和雌蟹蟹肉各鑒定出10、11種對蟹肉風味有貢獻的風味活性物質，其中8種是雌、雄蟹肉共同呈現的風味活性物質。醛類化合物是主要的風味活性物質。

表4 3種生態環境雄蟹肉的主要風味活性物質Table 4 The major volatile odor-active compounds of male crab muscle obtained from three eco-environment systems

注：“-”表示未檢測到或無法得到相關數值。下同。

表5 3種生態環境雌蟹肉的主要風味活性物質Table 5 The major volatile odor-active compounds of female crab muscle obtained from three eco-environment systems

在3種生態環境中，長江野生雌蟹肉與其他蟹肉樣品的主要風味活性物質種類和含量上的差異是其氣味成分存在差異的重要原因。稻田養殖雌、雄蟹的關鍵風味化合物具有較高相似度，這也驗證了電子鼻檢測的數據。此外，稻田養殖雌雄蟹肉OAV總和分別為391.9和699.51均高于其他生態環境蟹。進一步分析可知，稻田養殖雄蟹關鍵風味化合物為壬醛、癸醛和十四醛，雌蟹關鍵風味化合物為壬醛、癸醛和十六醛；湖泊養殖雄蟹關鍵風味化合物為壬醛、十六醛和十五醛，雌蟹關鍵風味化合物為壬醛、癸醛和十六醛；長江野生雄蟹關鍵風味化合物為苯甲醛、壬醛和十五醛，雌蟹關鍵風味化合物為壬醛、癸醛和十五醛。關鍵風味物質種類和含量的差異，使得3種生態環境河蟹呈現不同的風味特征，進而可能導致了感官嗅覺上存在一定的差異。

3 結論

采用電子鼻和頂空固相微萃取氣質聯用技術對3種生態環境(稻田養殖、湖泊養殖和長江野生)下的中華絨螯蟹蟹肉進行了檢測分析，結果表明，E-Nose可以較好地區別3種生態環境蟹肉風味，而HS-SPME-GC-MS確定了3種生態環境蟹肉的揮發性風味成分，得出3種生態環境蟹肉的揮發性風味成分具有一定的差異，但主要風味貢獻化合物均為醛類化合物，其中稻田養殖雌、雄蟹肉的壬醛與癸醛含量均較高，相較于另外2種生態環境蟹表現出較強的魚腥味與植物的清香，這可能與稻田水體的養殖環境有關。長江野生雌蟹由于其獨特的水果清香，在氣味上與其他蟹肉樣品表現出較大的區別，這也可能與江河水體的生長環境有關。此外稻田養殖雌、雄蟹肉的OAV總量均高于其他生態環境蟹，表現出稻田養殖蟹具有較好的嗅感。總的來說，稻田養殖蟹相比于另外2種生態環境蟹，具有更強的風味特征，這對于中華絨螯蟹養殖模式的選擇具有重要參考價值。