基于COI 基因的絲網(wǎng)印刷電極生物傳感器應(yīng)用于肉品鑒別技術(shù)研究

蔣娟娟，丁新怡，倪俊，董益陽(yáng)*，陳浣，聞紅，劉佳蕙

1(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100029) 2(北京市廣渠門中學(xué)，北京，100062) 3(北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京，100000)

改革開放40年來(lái)，我國(guó)人民生活質(zhì)量有了顯著改善。肉及其制品富含營(yíng)養(yǎng)，在食品精細(xì)化程度不斷加深和高收益的強(qiáng)烈誘惑下，食品違法行為也屢見不鮮[1-3]。目前在肉品質(zhì)量監(jiān)控方面，世界各國(guó)制定了一系列政策措施，國(guó)際社會(huì)對(duì)肉品摻假的關(guān)注也不斷提高，2017年，在北京舉辦關(guān)于共同預(yù)防、控制以及治理食品摻假問題的“全球共識(shí)”研討會(huì)；我國(guó)國(guó)務(wù)院在《2017年食品安全重點(diǎn)工作安排》中也強(qiáng)調(diào)要推動(dòng)“摻假造假行為直接入刑”等工作。基于此，食品肉類工業(yè)迫切需要一種快速、便攜、大眾化和可以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的檢測(cè)方法來(lái)完成自查和督查工作。

CAO等[4]使用酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)技術(shù)，聯(lián)用 SYBR green I(SG)可以實(shí)現(xiàn)未加工肉品的摻假, 也可以區(qū)分經(jīng)過如煮沸、微波、高壓或油炸等深度加工肉品的種類；ALIA 等[5]對(duì)市場(chǎng)中的肉丸進(jìn)行了研究，開發(fā)了基于納米生物綴合物的雜交動(dòng)力學(xué)技術(shù)，通過功能化的標(biāo)記金納米顆粒來(lái)檢測(cè)特定序列和單核苷酸錯(cuò)配，以此來(lái)探索肉類來(lái)源，該方法具有較高的靈敏度。但是，在使用基于蛋白的方法來(lái)鑒別不同品系的肉品時(shí)，需要對(duì)靶蛋白的特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行全面考量；另外，蛋白質(zhì)容易變性。因此，對(duì)于肉品摻假的鑒定研究工作仍然側(cè)重于基于核酸的分析方法[6-11]。

SOARES等[12]在家禽肉中混合已知量豬肉來(lái)構(gòu)建二元混合肉制品，用 SYBR Green 為染料進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，通過分析熔解曲線，驗(yàn)證了該方法可應(yīng)用于市場(chǎng)禽肉質(zhì)量的檢測(cè)分析工作中；REN[13]通過對(duì)液滴數(shù)字 PCR(droplet digital PCR, ddPCR)分析技術(shù)的探究，對(duì)羊肉中有雞肉摻入的情況進(jìn)行了定量檢測(cè)；同時(shí)，該工作也確定了在摻假比例不同時(shí)，拷貝數(shù)與混合肉類質(zhì)量比率關(guān)系的轉(zhuǎn)換系數(shù)。雖然ddPCR技術(shù)是非常有應(yīng)用價(jià)值的 DNA 定量檢測(cè)技術(shù)，但是，由于整個(gè)檢測(cè)過程處于微體系中，對(duì)液滴的操控水平要求極高，如何實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、高效且低成本的檢測(cè)，是第三代 PCR 技術(shù)從實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究走向市場(chǎng)化亟待解決的問題。

HEBERT等[14]提出的DNA 條形碼技術(shù)(DNA barcoding)[15-16]，已在真菌、植物、魚類和兩棲類等多個(gè)類群的鑒別研究中得到應(yīng)用。另一方面，隨著近些年對(duì)電化學(xué)傳感器研究力度的增強(qiáng)，DNA 傳感器便于攜帶、可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)漸漸得到重視。例如，運(yùn)用絲網(wǎng)印刷工藝，制成具有超小體積、質(zhì)量幾可忽略、方便現(xiàn)場(chǎng)操作等特點(diǎn)的絲網(wǎng)印刷電極(screen printed electrode, SPE)，整個(gè)移動(dòng)式檢測(cè)分析過程通過電纜線連接電腦即可完成，如圖1所示。該技術(shù)在 DNA-藥物相互作用機(jī)制的研究和評(píng)估、臨床診斷 DNA 堿基損傷、直接監(jiān)測(cè)雜交過程或特異性 DNA 序列的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)等[17]應(yīng)用較多。

a-樣品托架；b-一次性絲網(wǎng)印刷電極；c-便攜式恒電位儀；d-傳感檢測(cè)軟件圖1 便攜式絲網(wǎng)印刷電極電化學(xué)傳感系統(tǒng)Fig.1 Portable SPE Electrochemical Sensor System

本課題將嘗試探索構(gòu)建基于動(dòng)物線粒體COI基因片段的絲網(wǎng)印刷電化學(xué)生物傳感器，如圖2所示，該過程無(wú)需經(jīng)過繁瑣的 PCR 擴(kuò)增過程，直接在電極工作界面通過寡核酸序列探針特異性捕獲靶序列，對(duì)樣品進(jìn)行高特異性、高靈敏度和高適用性的分析測(cè)試，可實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)、高靈敏性、易商品化地快速鑒別肉品摻假目的，并完成混合二元靶 DNA 模型的定性與定量的相關(guān)工作，為我國(guó)關(guān)于禽肉、畜肉標(biāo)準(zhǔn)條形碼的確定和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，提供一種新的研究手段，也為相關(guān)法令條款的制訂與落實(shí)提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

a-特異性探針的固定(藍(lán)線)；b-COI基因序列的雜交(綠線)；c-雙鏈DNA與亞甲基藍(lán)結(jié)合(紫點(diǎn))；d-亞甲基藍(lán)方波伏安法電流信號(hào)圖2 利用特異性探針檢測(cè)生豬肉/牛肉混合二元物示意圖Fig.2 Illustration of the detection for pork/beef binary mixture with specific probe

1 材料與方法

1.1 試劑配制

分別配制 PBS 緩沖液(pH 7.4)、Tris-HCl 溶液(pH 8.0)和TE 緩沖液(pH 7.4)、 0.1 mol/L H2SO4溶液、1 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液、1 mmol/L ME 溶液、0.2% SDS 溶液、2.0×10-5mol/L MB 溶液以及1.0×10-3mol/L TCEP 溶液備用；按照合成說(shuō)明，加入適量 TE 緩沖液配制成100 mmol/L DNA 合成液，4 ℃或-20 ℃冷凍保存。

1.2 定性PCR篩選肉品DNA條形碼序列

牛(BosTaurus)、羊(Ovisaries)、豬(Susscrofa)、雞(Gallusgallus)COI基因序列信息來(lái)源于：BOLD(NCBI)、Public Data Portal(CBOL)和參考文獻(xiàn)[18-19]；特異性引物通過 Nucleotide BLAST 和Primer 3設(shè)計(jì)以及篩選；所用通用引物參見文獻(xiàn)[20]。依次開展定性 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液配制、反應(yīng)條件設(shè)定以及擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中所用序列均由上海生工公司合成。

1.3 COI-生物傳感器相關(guān)條件參數(shù)探究

本實(shí)驗(yàn)采用的是探針自組裝的操作方式。(1)在使用前用1.0×10-3mol/L TCEP 溶液對(duì)DNA探針進(jìn)行前處理，其中探針溶液和 TCEP 溶液的使用比率為1∶9(V/V)，探針通過其5′端二硫鍵和絲網(wǎng)印刷電極的金表面進(jìn)行功能化連接，室溫孵育12 h；然后用0.2% SDS 溶液和 PBS 緩沖液(pH 7.4)反復(fù)沖洗后晾干絲網(wǎng)印刷電極；最后置于 ME 溶液(1mmol/L)中，避光處理1 h后用 PBS 緩沖液(pH 7.4)和超純水清洗表面，備用；(2)探針序列與靶序列的特異性雜交：用 TE 緩沖液將目標(biāo)序列溶液稀釋，將處理好的電極浸入對(duì)應(yīng)的目標(biāo) DNA 溶液(20 μL)中，用恒溫水浴鍋(45 ℃)孵育1 h，即可完成探針與目標(biāo)序列的特異性雜交。反應(yīng)結(jié)束后，用 PBS 緩沖液及超純水反復(fù)沖洗電極表面，室溫自然晾干，備用；(3)對(duì)傳感器電流信號(hào)值的讀取分析：將處理后的電極浸入在 MB 溶液(2.0×10-5mol/L，50 μL)中置于混勻振蕩器上20 min，幫助 MB 增加嵌入量；再將電極處于 PBS 緩沖液中，輕柔搖晃5 min后反復(fù)沖洗晾干。便攜式電化學(xué)工作站安裝好后，將電極轉(zhuǎn)入至PBS緩沖液中，并在SWV模式下進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選4種生肉品COI基因序列結(jié)果

由于禽肉和畜肉的條形碼技術(shù)在國(guó)內(nèi)還處于起步階段，在肉品物種鑒定研究中，不同物種的“商標(biāo)條形碼基因”仍未統(tǒng)一確定。因此，需要根據(jù)常見食用性肉品的不同物種進(jìn)行初步篩選和電泳確證，為后續(xù)特異性探針的設(shè)計(jì)提供參考。2004年成立的生命條形碼聯(lián)盟(the Consortium for the Barcode of Life, CBOL)是物種分類條形碼的權(quán)威機(jī)構(gòu)組織，通過其 Public Data Portal 基因庫(kù)，檢索雞肉、羊肉、豬肉、牛肉等相關(guān)4個(gè)代表性物種的 DNA 條形碼序列并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，進(jìn)行擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，通過凝膠成像儀對(duì)條帶進(jìn)行分析。

如圖3所示，當(dāng)使用 DL2000 DNA Marker 時(shí)，生雞肉(條帶1～3)、生羊肉(條帶4)、生豬肉(條帶5)、生牛肉(條帶6)的線粒體COI基因經(jīng) PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物大小分別為150、210、200和230 bp，擴(kuò)增結(jié)果與 Primer 3 系統(tǒng)預(yù)估產(chǎn)物長(zhǎng)度(依次為：153，200，193，225 bp，)基本吻合且條帶重現(xiàn)性好。通過參考田晨曦等[21]設(shè)計(jì)的通用引物，對(duì)4條靶序列進(jìn)行定性 PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)和瓊脂糖凝膠電泳。

M-DL2000 DNA Marker;1～3-雞源性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物;4～6-分別為羊源性、豬源性和牛源性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物;7-空白對(duì)比圖3 雞肉、羊肉、豬肉、牛肉COI基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 PCR-amplificated mt COI gene amplicons were analyzed by agarose gel electrophoresis

如圖4所示，當(dāng)使用100 bp DNA Ladder(Dye Plus)時(shí)，生牛肉、生羊肉、生豬肉的COI基因經(jīng) PCR 擴(kuò)增后的電泳條帶清晰且可重復(fù)性高；雞肉的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為920 bp，但電泳條帶較模糊(如圖4-d所示)，說(shuō)明該部分采用的通用引物對(duì)物種G.gallus的COI基因特異性結(jié)合較弱。結(jié)果說(shuō)明，所選COI基因序列具有高度保守區(qū)，有明顯物種代表性，基本符合 DNA 條形碼技術(shù)對(duì)理想標(biāo)準(zhǔn)條形碼的要求，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列。

a-牛基因擴(kuò)增產(chǎn)物(890 bp); b-羊基因擴(kuò)增產(chǎn)物(530 bp);c-豬基因擴(kuò)增產(chǎn)物(600 bp);d-雞基因擴(kuò)增產(chǎn)物(920 bp)圖4 四種生肉COI基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 PCR-amplification of mitochondrial COI gene

2.2 四種生肉品的檢測(cè)范圍及檢測(cè)限

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)4種生肉品(雞肉、豬肉、牛肉和羊肉)的COI基因序列進(jìn)行分析，分析濃度范圍為1.0×10-13～1.0×10-5mol/L的4種合成靶標(biāo)序列在傳感工作平臺(tái)上的響應(yīng)電信號(hào)變化，繼而建立各自 DNA 濃度(log C)與電化學(xué)指示劑 MB 還原電流差異變化(ΔI)間關(guān)系的曲線(如圖5所示)。

根據(jù)結(jié)果可以得知，在前期優(yōu)化的電化學(xué)條件下，靶標(biāo)序列濃度范圍在10-13～10-5mol/L時(shí)，與還原峰電流差異ΔI(nA)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程分別為：雞肉的線性方程為ΔI=580.999 83+8 333.078 9 log C，線性相關(guān)系數(shù)為0.806 17；羊肉的線性方程為ΔI=203.125+6 658.12 log C，線性相關(guān)系數(shù)為0.786 77；豬肉的線性方程為ΔI=391.25+5 482 log C，線性相關(guān)系數(shù)為0.987 4；牛肉的線性方程為ΔI=720.625+10 521.45 log C，線性相關(guān)系數(shù)0.9613 6。

由于COI基因在線粒體基因組中，有時(shí)不會(huì)選用 AUG 或其中一種公認(rèn)的翻譯規(guī)則來(lái)替代起始密碼子，而會(huì)經(jīng)常使用未知方法來(lái)啟動(dòng)翻譯，這種不尋常行為的頻率以及潛在的分子機(jī)制尚不清楚[22]，這給COI基因的研究工作增添了許多難度，對(duì)相關(guān)的檢測(cè)結(jié)果也有較難預(yù)期的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，豬肉和牛肉關(guān)系曲線的線性相關(guān)性較好。對(duì)無(wú)靶標(biāo)序列修飾的電極進(jìn)行10次平行 SWV 檢測(cè)，得到ΔI均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，再分別依據(jù)上述豬肉和牛肉的線性方程斜率求得相應(yīng)的濃度值，因此，計(jì)算得出生豬肉檢測(cè)限為3.491×10-14mol/L，生牛肉的檢測(cè)限為5.048×10-14mol/L。因此，構(gòu)建的COI-絲網(wǎng)印刷電極傳感器，能夠快速、簡(jiǎn)便完成檢測(cè)工作，同時(shí)擁有較寬的檢測(cè)范圍，以及較低檢測(cè)限，能夠滿足市場(chǎng)對(duì)食品質(zhì)量摻假的便攜、靈敏的檢測(cè)要求。

圖5 豬肉、羊肉、牛肉和雞肉COI基因序列梯度濃度對(duì)數(shù)值與MB雜交前后還原電流差異變化關(guān)系曲線(n=3)Fig.5 Relationship between logarithm of gradient concentration of raw meat and the difference of reduction current for MB hybridization (n=3)

2.3 混合二元物摻假模型響應(yīng)曲線探究

為了進(jìn)一步探究以牛源性修飾探針為生物識(shí)別元件與絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行固定后構(gòu)建的傳感器的可行性，將從大型超市購(gòu)買的生豬肉和生牛肉攪碎均質(zhì)制成肉泥；再將肉泥制備成不同比例的混合肉樣模型；提取混合樣品 DNA，并進(jìn)行純度濃度檢測(cè)，備用；用 TE 溶液統(tǒng)一配制成濃度為 10-5mol/L 的靶標(biāo)溶液，將探針與絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行一系列組裝和孵育，然后對(duì)生豬肉/牛肉混合二元物模型進(jìn)行電化學(xué)傳感檢測(cè)分析。

如圖6所示，不同質(zhì)量的混合肉品提取的 DNA 與牛源性探針雜交后，通過電化學(xué)指示劑亞甲基藍(lán)的嵌入，雜交信號(hào)可以成功轉(zhuǎn)化為電流信號(hào)。取50 ng混合樣品時(shí)，雜交特異性最強(qiáng)，隨著混合生肉品的質(zhì)量減少，亞甲基藍(lán)的電流信號(hào)穩(wěn)定性逐漸降低，圖形開始出現(xiàn)波動(dòng)，出現(xiàn)該種情況的原因可能是由于目標(biāo)序列的濃度逐漸減少，在電極工作表面同探針進(jìn)行特異性結(jié)合的 ssDNA 也隨之減少，使得 MB 有效嵌入量減少，故最終電化學(xué)信號(hào)降低也較顯著。

a-靶標(biāo)DNA取自50 ng混合肉樣; b-靶標(biāo)DNA取自30 ng混合肉樣; c-靶標(biāo)DNA取自20 ng混合肉樣圖6 生牛肉中分別摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 3%, 1%和0.1%生豬肉時(shí)DNA檢測(cè)的峰值電流與摻混比例的對(duì)應(yīng)圖Fig.6 Peak current versus adulteration ratio of bovine DNA consisting 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 3%, 1% and 0.1% (w/w%) of porcine DNA, respectively

從圖6可以得出，當(dāng)混合生肉量為50 ng時(shí)，靶標(biāo) DNA 與探針特異性結(jié)合后，指示劑 MB 的電信號(hào)更加穩(wěn)定；同時(shí)，雖然靶標(biāo) DNA 的濃度不同，但是從最終的電信號(hào)峰值來(lái)看，除摻混比例25%的數(shù)據(jù)普遍有點(diǎn)異常有待進(jìn)一步探明原因外，方法對(duì)混合二元物的識(shí)別能力幾乎不受摻假比例影響。

綜上可知，利用牛源性物種Bosgruuniens的COI基因設(shè)計(jì)的特異性探針，經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎棧瑯?gòu)建COI-絲網(wǎng)印刷電極傳感平臺(tái)用于識(shí)別生豬肉/牛肉的混合二元物摻假是可行的，這為實(shí)際生豬肉/牛肉摻假或因非人為因素偶然攜入的檢測(cè)工作提供了新的研究思路。

2.4 與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的特性比對(duì)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(traditional PCR)是現(xiàn)階段應(yīng)用最廣泛的生物分子定性技術(shù)之一。在常見的食品摻假事件中，為了達(dá)到定量肉品摻假的鑒別要求，發(fā)展出了第二代 PCR 技術(shù)，其中實(shí)時(shí) PCR 或熒光PCR技術(shù)(Real-time PCR, RT-PCR)是現(xiàn)在肉類摻假鑒別的主流技術(shù)，也是現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)許多檢測(cè)機(jī)構(gòu)公認(rèn)的定量檢測(cè)手段。為了更好地體現(xiàn)本工作中首次構(gòu)建的基于動(dòng)物線粒體COI基因的電化學(xué)傳感平臺(tái)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，本文對(duì)該技術(shù)與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)進(jìn)行了小結(jié)和比較(如表1所示)。

表1 電化學(xué)傳感技術(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)比較Table 1 Comparison of electrochemical sensing technology and RT-PCR detection technology

通過2種檢測(cè)方法的比較可知，實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù)均可以完成對(duì)生豬肉/牛肉混合二元物的鑒定工作，前者現(xiàn)階段運(yùn)用成熟，但是后者在儀器成本、配套設(shè)施、響應(yīng)時(shí)間等方面更具分析優(yōu)勢(shì)，也更加適合低比例摻假和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)要求，故在肉品真?zhèn)舞b別中具有較大的市場(chǎng)開發(fā)潛力。

3 結(jié)論

為了快速便捷的實(shí)現(xiàn)肉品真?zhèn)舞b別，本文首次以動(dòng)物線粒體COI基因?yàn)樽R(shí)別元件，以一次性絲網(wǎng)印刷生物傳感器為器件，成功搭建鑒別豬肉和牛肉混合二元物的電化學(xué)傳感檢測(cè)平臺(tái)，檢測(cè)可免去復(fù)雜的分子擴(kuò)增中間實(shí)驗(yàn)、成本更低、操作技術(shù)更加簡(jiǎn)便化，具有良好的鑒別靈敏度和商業(yè)應(yīng)用前景，是目前主流的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的重要補(bǔ)充。本文所介紹的絲網(wǎng)印刷電極電化學(xué)傳感技術(shù)也可為動(dòng)物COI基因條形碼相關(guān)研究提供新的思路和數(shù)據(jù)支持。